SZDB/Z深圳市市場監督管理局發布I 1 1 1 2 4 5 5 5 6 8 91基于第二代測序技術的HLA高分辨分型檢測標準本標準適用于使用第二代測序技術進行HLAbp：堿基對（basepair）RNA：核糖核酸（RibonucleiNGS：第二代基因測序技術（NextGenerationSPCR：聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReactiQ-PCR：定量聚合酶鏈反應（QuantitativePolymerdNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphaSSP：特異性序列引物（SpecificSquencePrimer）A：腺嘌呤（Adenine）U：尿嘧啶（Uracil）2血和移植急性排斥反應密切關聯。因此，對于經典的HLA基因進行分型在臨型與過去的低分辨分型相比配型速度更快，配型更精確，使得移植排斥反應更小，手術成功率基于第一代sanger測序技術、利用邊合成邊測DNA序列的一種新的測序技術，在Sanger等測序方法的基礎上，通過具有通量高、成本低等特點，能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進4.1檢測對象臨床具有造血干細胞移植、器官移植HLA配型需求HLA配型數據入庫需求的機構的樣本。4.2受檢者資料和樣本的采集、運輸與保存檢測項目：根據臨床需要選擇需3外周血樣本），.4外周血樣本在常溫下運輸保存不超過7天，2℃~8℃條件下保存不超過15天，-20℃可.1當外周血樣本檢測出現異常或無法解釋的結果時，建議將外周血與口腔拭子一并采樣檢測。對骨髓移植受檢者或近期有輸血史的受檢者，因外周血及其提取的DNA樣本均可.2口腔拭子采集前半小時請勿進食.3采集時一手持采樣拭子/消毒棉簽伸入左上部口腔，在口腔側壁與牙齦交匯處旋轉擦拭約風干，每人至少采集4根。采集過程中避免用手觸及棉簽頭，以免造成樣本污染；勿.4將風干后的拭子/棉簽裝進一次性清潔密封袋，置于潔凈容器中，添加干燥劑后密封包.6置于2℃~8℃條件下可保存15天，干燥的拭子長期儲存則需置于-20℃凍存。.1樣本質量要求：DNA總量應≥10μg，濃.2樣本包裝：保存于1.5mLEP管，用封口膜密封.3樣本運輸及保存：采用冰袋或干冰進行低溫（低于4℃)運輸，運輸時間不超過7天。樣臍帶血樣本.1臍帶血樣本的采集、運輸與保存參見外周血樣本的采集、運輸和保存。45.1.1接收樣本時核對樣本5.1.2檢查待檢樣本狀態，根據4.2.2要求，對符合要求的樣本，接收并登5.2.1使用DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書操作，提取樣本中游離的人類全基因組DNA。5.2.2提取過程中，設置陰性對照和重復對照。5.2.3提取后的DNA置于-20℃條件下保存6個月，或-70℃長期保存，避免反復凍融。5.2.4DNA濃度要求：DNA量≥4μg，濃度≥20ng/5.3.2PCR擴增后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物條帶。條帶應該明亮清晰，片段大小基“A”使得DNA片段與5'端帶有“T”堿基的特殊接5.4.2使用Agilent2100電泳檢測文庫的片段大小及產量，使用Q-PCR儀檢測文庫產量；根據5.4.3混合后的文庫與光學透明玻璃芯片上的接頭雜交，使用第二代高通量測序儀進行HLA型別數據庫采用國際IMGT/HLA數據庫，通過對55.6.1基于第二代測序技術的HLA高分辨分要求，原則上分為四個單獨的工作區域：試劑儲存和準備區、樣本制備區、擴增區、擴增產物區，進入各工作區域應嚴格遵循從試劑儲存和準備區、樣5.6.2數據分析對硬件的要6.1檢測報告包含受檢者基本信息和送檢單位信息。6.3檢測報告注明實驗檢測方法，并告知結果僅供臨床參考?；诘诙鷾y序技術的HLA高分辨7.1受檢者資料包括送檢單、實驗數據記錄和實驗檢測結果，均保存5年以上，另有規定的除7.2受檢者樣本包括外周血、臍帶血和DNA樣本，可按要求保存期限在3年以上。8.1相關人員應接受生物安全、檢測技術等專業培訓，持證上崗。8.2配備必要的基礎設施和適宜的檢測環境，對設施和環境進行監控。8.3設立陰性和重復對照，確保每次檢測的質量。如陰性對照與預期結果不相符時，進行原因分8.4數據分析結果中各位點純合子采用其他方法，如雙脫氧鏈終止測序法(Sanger法)或特異性序列），6*送檢醫師系7 樣本接收日期8表B.1基于第二代測序技術的HLA高樣本編號HLA-A*HLA-B*HLA-C*HLA-9next-generationsequencing.TissueAntigens,2009,3-403[3]ChunlinWang.etal.High-throughput,high-?d