真菌性玉米頂腐病鑒定技術規程2023-09-25實施2023-09-25實施 1范圍 12規范性引用文件 13術語和定義 14原理 15試劑與材料 26儀器及用具 27取樣方法 38田間癥狀表現型 3 410結果判定 511樣品保存與處理 5 6附錄B(規范性)玉米頂腐病菌菌體形態特征 7I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由甘肅省農業農村廳提出并監督實施。本文件由甘肅省糧食油料作物栽培標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：河西學院、甘肅前進生物科技發展有限公司、甘肅省農業信息中心、泉州師范學院、德農種業股份公司、高臺縣農業技術推廣中心、臨澤縣農業技術推廣中心、張掖國家級玉米種子生產基地種子質量監督檢驗中心、張掖市建國作物種質創新育種工作室、酒泉市通盈種苗有限公司。本文件主要起草人：雷玉明、馬金、趙婧、雷鑫、鄭天翔、楊國振、王偉、濮超、吳堯、劉曉剛、張琪、公曉佳、孫志、馬麗娟、李自峰、李濤、石建國。本文件由河西學院負責解釋。本文件規定了真菌性玉米頂腐病檢驗取樣方法、田間癥狀識別、實驗室檢驗、結果判斷及樣品保存與處理的技術要求。本文件適用于玉米種子繁育田、雜交種真菌性頂腐病的鑒定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB1886.239食品安全國家標準食品添加劑瓊脂GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法HG/T3462化學試劑蔗糖3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。玉米頂腐病一種由亞粘團鐮孢霉引起的玉米葉部、莖部的真菌性病害。亞粘團鐮孢霉真菌、絲孢綱、叢梗孢目、瘤座孢科、鐮孢霉屬的一種真菌。菌落篩選需要從分離培養基培養生長出的大量菌落中，根據菌落形狀、顏色、大小、菌絲形態等的各種特征，從中挑選出具有明顯表型特征的目標菌落的過程。轉接在無菌條件下，將目標菌落轉移到適宜其生長的人工合成培養基而形成單一菌株的過程。4原理玉米頂腐病是一種土壤、種子傳播的真菌性病害，以亞粘團鐮孢霉在土壤、病殘體、種子中越冬。以玉米幼苗、葉片、葉鞘、莖稈、果穗的田間癥狀表現型為初步診斷依據，結合室內種子、土壤、病組織的病原菌分離培養特性與顯微鏡的形態特征，綜合評價，判定真菌性玉米頂腐病。125.10.1%升汞(HgCl?)稱取升汞1.0g,用75%酒精5mL溶解，再加蒸餾水995mL稀釋，加入1%酸性品紅溶液0.1mL,配制5.2乳酚油(C?H??O?)將苯酚結晶加熱熔化后取20mL加入20mL乳酸中攪拌均勻，再先后加入20%甘油40mL和蒸餾水稱取0.1g醫用硫酸鏈霉素粉劑，用70%酒精5mL溶解，無菌水5.7試驗用水6.1.2高壓滅菌鍋：容積50L,電源220V/50hz,最高工作/設計溫度135℃/138℃,最高工作/設計壓力0.22Mpa/0.25Mpa,滅菌定時4min～120min,干燥定時30min～240min;6.1.3超凈工作臺：潔凈等級100級，噪聲≤58db,平均面風速0.3m/s～0.6m/s,電源220V/50hz,光6.1.4培養箱：控溫范圍0℃~50℃,溫度分辨0.1℃,溫度均勻性≤±1℃;6.1.5生物顯微鏡；雙目鏡10x/20x,≥5孔物鏡轉換器，物鏡4x/10x/40x/100x;6.1.6低溫冰箱：控溫范圍-10℃~-40℃,控溫精度±1℃;6.1.7單道移液器：分液范圍2mL～10mL、100μL～1000μL。選擇具有玉米頂腐病典型癥狀或疑似癥狀的植株，在植株根部周圍0.2m2~0.3m2范圍內取5cm深的選擇玉米頂腐病普發田，對角線5點取樣，每點在2m2范圍內取5cm深的表土1000g,將各點土樣混34本法適用于玉米種子表面病原菌檢驗。在超凈工作臺上，將待檢玉米樣品的種子先用蒸餾水沖洗2璃培養皿內，每皿放入5～10粒，重復5次，每個樣品測定種子50粒。培養皿放在25℃±1℃恒溫箱黑暗將待檢葉片、葉鞘材料，剪取大小為(0.1cm～0.2cm)×(0.1cm～0.2cm)病健交界處組織。待檢在超凈工作臺上，將植株組織樣品分別在70%酒精中浸15s～20s,移入0.1%升汞液中消毒30s,用無菌水沖洗3次后，消毒組織置于PSA平板培養基上，每個平板放置5～10在超凈工作臺上，將土壤樣品在PSA平板培養基表面培養出符合第8章中規定的任何一種田間癥狀表現型，且顯微鏡檢病原形態特征符合附錄B描述的亞粘團完成檢驗后，分離物制成斜面試驗菌種保存于-20℃低溫冰箱，植物組織樣品和病原菌分別制成浸漬標本、玻片標本室溫保存。使用的材料和用具，在使用完畢56(規范性)A.1配方A.2制作方法A.2.1配制分別稱取200g馬鈴薯方塊、蔗糖15g、瓊脂18g。將200g馬鈴薯方塊放入2000mL燒杯中，加入水1000mL煮沸20min～25min,用4層紗布過濾，濾液用水補足1000mL,加入蔗糖15g、瓊脂18g,加熱使分裝培養基溶液150mL,錐形三角瓶口加棉花塞或耐高溫組培封口膜，將入高壓滅菌鍋中，在115℃~120℃條件下高壓滅菌30min。當滅菌培養基冷卻至45℃~50℃時，在無菌條件下，用單道移液器取10mg/mL硫酸鏈霉素溶液450uL加入150mL培養基中，搖均后倒入無菌Φ90mm或Φ120mm培養皿和裝入無菌18mm×(規范性)玉米頂腐病菌菌體形態特征B.1PSA培養基菌落特征B.1.1菌落形態氣生菌絲絨毛狀至粉末狀。B.1.2菌落顏色菌落2d～3d為粉白，4d～5d漸變為淡紫色，中部淡紫色，背面菌落淡黃色，邊緣略呈淡紫色。B.2產孢方式產孢細胞內壁芽生，單、復瓶梗式產孢，以單瓶梗居多。B.3小型分生孢子特征B.3.1形狀特征小型分生孢子長橢圓形或擬紡錘形，較小，呈假頭狀不呈串珠狀著生。B.3.2大小B.4大型分生孢子特征B.4.1形狀特征鐮刀形，較直而細長，腳胞足跟不十分明顯，頂端漸尖。B.4.2大小B.5生物學特性B.5.1溫