第3章第1節重組DNA技術的基本工具一/限制性內切核酸酶—“分子手術刀”1/DNA連接酶—“分子縫合針”2/基因進入受體細胞的載體—“分子運輸車”3/DNA粗提取和鑒定探究.實踐實現這一精確的操作過程至少需要三種“分子工具”，即準確切割DNA分子的“分子手術刀”、將DNA片段再連接起來的“分子縫合針”和將體外重組好的DNA分子導入受體細胞的“分子運輸車”。舊知重拾1.DNA的結構脫氧核苷酸脫氧核苷酸舊知重拾1.DNA的結構1′2′4′5′3′磷酸基團脫氧核糖含氮堿基舊知重拾1.DNA的結構DNA平面結構圖DNA立體結構圖TCGATGGTCTCAGCTACCAGAG舊知重拾1.DNA的結構DNA平面結構圖①DNA的骨架：脫氧核糖和磷酸交替排列在外側②內側：堿基配對，通過氫鍵連接③配對方式：AT、GC，A和T兩個氫鍵，G和C三個氫鍵④G、C比例越大，DNA相對越穩定舊知重拾2.關于基因TCGATGGTCTCAGCTACCAGAGTCGATGGTCTCAGCTACCAGAG.............概念：基因通常是有遺傳效應的DNA片段BY3’5’5’3’舊知重拾2.關于基因概念：基因通常是有遺傳效應的DNA片段生物以DNA為遺傳物質（RNA病毒除外）.DNA的基本組成單位相同（都是四種脫氧核苷酸）.都遵循堿基互補配對原則.不同生物的DNA都具有相同的雙螺旋結構.以堿基排列順序儲存遺傳信息為不同來源的DNA片段拼接提供了理論依據舊知重拾3.關于基因和蛋白質的關系舊知重拾3.關于基因和蛋白質的關系生物都遵循中心法則：DNA能夠自我復制，復制方式相同為外源DNA在細胞中穩定存在提供了理論依據舊知重拾3.關于基因和蛋白質的關系生物都遵循中心法則：幾乎一切生物共用一套遺傳密碼（密碼子相同）為外源基因的表達提供了理論依據舊知重拾3.關于基因和蛋白質的關系生物通過蛋白質控制性狀：.

基因控制蛋白質的結構直接控制生物體的性狀.

基因控制酶的合成來控制代謝過程進而控制生物體的性狀一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“任務一：閱讀教材P71關于限制性內切核酸酶-”分子手術刀“，回答下列問題。1.切割DNA分子的工具是什么？2.”分子手術刀“從什么生物中分離純化出來的？3.限制性內切核酸酶識別的對象是什么？切割的化學鍵是什么？4.切割后產生的末端有哪些類型？5.請根據限制性內切核酸酶名字猜測它可以從DNA的兩端切割DNA嗎？一1.切割DNA分子的工具是什么2.”分子手術刀“從什么生物中分離純化出來的？限制性內切核酸酶（限制酶）主要是從原核生物（細菌等）中分離純化出來的任務一：閱讀教材P71關于限制性內切核酸酶-”分子手術刀“，回答下列問題。它能破壞外源DNA，如侵染細菌的噬菌體DNA，“限制”病毒在細菌內的寄生，而細菌自身DNA經過相應的化學修飾則不會被限制酶破壞。限制酶的保護作用是細菌等進化出的一種防御機制限制性內切核酸酶-”分子手術刀“一3.限制性內切核酸酶識別的對象是什么？切割的化學鍵是什么？能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開任務一：閱讀教材P71關于限制性內切核酸酶-”分子手術刀“，回答下列問題。例如，EcoRⅠ限制酶的識別序列為從5’→3’方向的識別序列均為GAATTC，并切斷G和A之間的磷酸二酯鍵5’3’5’3’中軸線限制性內切核酸酶-”分子手術刀“一5’3’5’3’從5’→3’方向的識別序列均為GAATTC，并切斷G和A之間的磷酸二酯鍵3’5’5’3’黏性末端黏性末端當限制酶在它識別序列的中心軸線兩側將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產生的是黏性末端；注意：限制酶切割磷酸二酯鍵后氫鍵會自動斷裂！例如，EcoRⅠ限制酶的識別序列為任務一：閱讀教材P71關于限制性內切核酸酶-”分子手術刀“，回答下列問題。限制性內切核酸酶-”分子手術刀“一4.切割后產生的末端有哪些類型？黏性末端任務一：閱讀教材P71關于限制性內切核酸酶-”分子手術刀“，回答下列問題。例如，SmaⅠ限制酶的識別序列為從5’→3’方向的識別序列均為CCCGGG，并切斷C和G之間的磷酸二酯鍵5’3’5’3’中軸線限制性內切核酸酶-”分子手術刀“一4.切割后產生的末端有哪些類型？黏性末端任務一：閱讀教材P71關于限制性內切核酸酶-”分子手術刀“，回答下列問題。例如，SmaⅠ限制酶的識別序列為從5’→3’方向的識別序列均為CCCGGG，并切斷C和G之間的磷酸二酯鍵5’3’5’3’平末端當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產生的是平末端。3’5’5’3’平末端限制性內切核酸酶-”分子手術刀“一任務一：閱讀教材P71關于限制性內切核酸酶-”分子手術刀“，回答下列問題。大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。例如，EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶的識別序列均為6個核苷酸，也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。限制性內切核酸酶-”分子手術刀“一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“①每一限制酶都有各自特異性的識別序列限制性內切核酸酶（限制酶）特點Ⅰ.大多數限制酶識別序列6個核苷酸，也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成為什么？限制酶的識別序列越短，酶切位點在基因組中的分布頻率就越高若基因組DNA的堿基序列是完全隨機排列的，4個堿基的識別序列，平均44即256個堿基就會出現一次一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“①每一限制酶都有各自特異性的識別序列限制性內切核酸酶（限制酶）特點Ⅱ.回文結構/回文序列回文序列特點：以中線為縱軸，一側核苷酸序列以橫線為軸旋轉180°后，縱軸兩側的序列成左右對稱，稱為旋轉對稱。一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“①每一限制酶都有各自特異性的識別序列限制性內切核酸酶（限制酶）特點Ⅱ.回文結構/回文序列識別序列的一條鏈從左往右的堿基序列和另一條鏈從右往左的堿基序列相同即兩條鏈從5‘--3’的堿基序列相同一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“問題2：嘗試寫出EcoRⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ、AluⅠ限制酶酶切后的結果一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“EcoRⅠ3’-CTTAA5’-GAATTC-3’G-5’讀法:5’向3’黏性末端BamHⅠ3’-CCTAG5’-GGATCC-3’G-5’黏性末端SmaⅠ3’-GGG5’-CCCGGG-3’CCC-5’平末端AluⅠ3’-TCGG5’-AGCT-3’-5’黏性末端一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“ATGCATATGCGCGCATTATA5’3’3’5’ATGCATATGCGCGCATTATA5’3’3’5’AAAGCGCTTTA3’5’5’3’AATTGCAATA5’3’GC3’5’AGCCTTTA3’GC5’5’3’AEcoRⅠEcoRⅠATGCTTGCA5’3’3’5’A一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“酶切后獲得的黏性末端不但互補而且相同，因此用相同的限制酶處理得到的黏性末端之間可以通過堿基互補配對關系相互“識別”ATGCATATGCGCGCATTATA5’3’3’5’3’5’5’3’ATATGCGCCATATTATA5’3’3’GCGC5’3’5’5’3’ATTGCAATA5’3’GCAGCGCTTTA3’5’A一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“問題3：比較BamHⅠ、BgIⅡ限制酶酶切后的結果，進行比較。3’-CCTAG5’-GGATCC-3’G-5’3’-TCTAG5’-AGATCT-3’A-5’一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“問題4：BamHⅠ、BgIⅡ等幾種限制酶的識別序列和切割位點均不同，但能切出相同的DNA黏性末端（序列5’-GATC-3’）3’-CCTAG5’-GGATCC-3’G-5’3’-TCTAG5’-AGATCT-3’A-5’這樣切割產生的黏性末端是否可以通過酶相連？黏性末端相連后，原來的限制酶是否還能對其識別并切割？3’-CCTAG5’-GGATCT-3’A-5’可以相連，有相同的黏性末端，堿基可以互補配對不同酶切割的DNA產生的相同黏性末端連接后形成的新位點即所謂雜交位點，一般不能被原來的限制酶各自識別一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“拓展①同尾酶：不同限制酶識別不同序列，產生相同的黏性末端3’-CTAG5’-GATC-3’-5’3’-CCTAG5’-GGATCC-3’G-5’3’-CTAG5’-GATCC-3’G-5’Sau3AⅠBamHⅠ識別X一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“拓展②同裂酶：不同限制酶識別相同序列，產生相同的黏性末端不同限制酶識別相同序列，不同位點切割，產生不同的黏性末端一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“拓展同裂酶其實是一種酶，但是由于限制酶是根據來源命名的，如BamHⅠ和BstⅠ的識別序列和切割位點都是GGATCC一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“AATTC------G-----------G-----CTTAA目的基因-----G-----CTTAAAATTC------G------4個黏性末端一限制性內切核酸酶-”分子手術刀“1個片段2個片段二DNA連接酶-“分子縫合針”任務二：閱讀教材P72關于DNA連接酶-“分子縫合針”，回答下列問題。1.DNA連接酶的作用什么？2.DNA連接酶連接形成什么化學鍵？3.E.coliDNA連接片段具有什么特點？4.T4DNA連接酶連接的片段具有什么特點？5.黏性末端和平末端的連接效率哪個高？原因是什么？1.DNA連接酶的作用什么？連接的對象具有什么特點？2.DNA連接酶連接形成什么化學鍵？3.E.coliDNA連接片段具有什么特點？連接兩個DNA片段磷酸二酯鍵互補的黏性末端、平末端任務二：閱讀教材P72關于DNA連接酶-“分子縫合針”，回答下列問題。二DNA連接酶-“分子縫合針”兩個片段之間堿基能夠互補配對5.黏性末端和平末端的連接效率哪個高？原因是什么？黏性末端效率較高，4.T4DNA連接酶連接的片段具有什么特點？互補的黏性末端、平末端平末端沒有氫鍵的連接和維持。思考：與核酸相關酶，你知道哪些？二DNA連接酶-“分子縫合針”任務二：閱讀教材P72關于DNA連接酶-“分子縫合針”，回答下列問題。小結：與核酸相關酶DNA（水解）酶限制性內切核酸酶二DNA連接酶-“分子縫合針”使DNA水解成基本單位--脫氧核苷酸對特定序列的特定位點進行切割，可得到DNA片段，是基因工程的重要工具酶DNA聚合酶在DNA復制時利用母鏈為模板，將脫氧核苷酸連接成單鏈DNA連接酶連接被限制酶切割形成的黏性末端或平末端，是基因工程的重要工具酶解旋酶DNA復制時將DNA解旋，需要消耗能量自然形成遵循堿基互補配對原則二DNA連接酶-“分子縫合針”小結：與核酸相關酶二DNA連接酶-“分子縫合針”都是催化兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵不需要需要雙鏈單鏈兩個DNA片段單個核苷酸加到已存在的核苷酸片段基因表達載體構建DNA復制（擴增）三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”任務三：閱讀教材P72關于基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”，回答下列問題。1.“分子運輸車”通常利用的是什么？2.質粒的本質什么？質粒存在在哪里？3.質粒有什么特點？4.作為“分子運輸車”需要什么條件？三三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”任務三：閱讀教材P72關于基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”，回答下列問題。1.“分子運輸車”常利用的是什么？質粒2.質粒的本質什么？質粒存在在哪里？補充：噬菌體、動植物病毒（滅活后使用）環狀的DNA分子真核細胞核或原核細胞擬核之外3.質粒有什么特點？雙鏈、一個至多個酶切位點、自我復制4.作為“分子運輸車”需要什么條件？三三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”任務三：閱讀教材P72關于基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”，回答下列問題。4.作為“分子運輸車”需要什么條件？Ⅰ、能夠在受體細胞中自我復制或整合到受體DNA上目的：使目的基因在受體細胞中穩定地存在（復制）復制的原點：質粒含有控制環狀質粒在細菌細胞中復制的基因，稱為復制原點（Ori）三三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”任務三：閱讀教材P72關于基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”，回答下列問題。4.作為“分子運輸車”需要什么條件？Ⅱ、具有多個酶切位點，以便與外源基因連接目的：多個酶切位點以便連接外源基因三三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”任務三：閱讀教材P72關于基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”，回答下列問題。4.作為“分子運輸車”需要什么條件？Ⅲ、具有特殊的標記基因目的：便于重組DNA的篩選標記基因通常有①抗生素的抗性基因如：抗氨芐青霉素基因（ampr）、抗四環素基因（tetr)②熒光蛋白基因如：綠色熒光蛋白基因（GFP）、紅色熒光蛋白基因（RFP）三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”任務三：閱讀教材P72關于基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”，回答下列問題。4.作為“分子運輸車”需要什么條件？Ⅲ、具有特殊的標記基因目的：便于重組DNA的篩選③生化標記基因如：lacZ(β半乳糖苷酶基因）④營養缺陷型基因如：合成某些氨基酸標記基因通常有①抗生素的抗性基因②熒光蛋白基因三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”含目的基因的DNA片段導入三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”載體攜帶目的基因導入受體細胞的成功率不高，因此需要篩選出導入目的基因的受體細胞存活并增殖死亡在含有抗生素的培養基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”任務三：閱讀教材P72關于基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”，回答下列問題。在進行基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行人工改造的。例如：酶切位點、抗性基因、復制原點等。三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”膠帶膠帶三基因進入受體細胞的載體-“分子運輸車”討論：問題1：剪刀和膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；膠帶代表DNA連接酶。問題2：插入DNA片段能稱得上一個基因嗎？不能，因為基因的長度一般在100個堿基以上三三拓展：目的基因與運載體連接的酶切問題分析思考：目的基因是要與運載體結合的，那如何處理質粒？用相同的限制酶切割目的基因與運載體。產生相同的末端，便于連接。EcoRⅠ酶切后EcoRⅠ酶切后拓展：目的基因與運載體連接的酶切問題分析重組質粒的形成：（1）單酶切割法：思考：將被同一種限制酶切的質粒和目的基因片段混合，加入DNA連接酶，兩兩連接的產物有幾種？EcoRⅠ酶切后EcoRⅠ酶切后×拓展：目的基因與運載體連接的酶切問題分析重組質粒的形成：（1）單酶切割法：單一相同黏性末端存在以下問題:目的基因雙向插入載體（即正向或反向）容易出現目的基因的自身環化和載體的自身環化拓展：目的基因與運載體連接的酶切問題分析重組質粒的形成：（2）雙酶切割法：使用兩種不同的限制酶切同一種DNA分子切割產生的DNA片段的兩個末端是不同優點：定向插入目的基因練習獲取目的基因和切割載體時，通常使用同種限制酶，目的是為了

。但是使用該方法的缺點是容易發生

以及

，為了避免上述情況發生，可采取的措施是

。產生相同的黏性末端，便于連接目的基因、質粒的自身環化目的基因與質粒的反向連接分別使用兩種限制酶取切割目的基因和運載體練習練習練習氨芐青霉素抗性基因四環素抗性基因能夠切下目的基因不破壞目的基因至少保留一個完整的標記基因，便于篩選DNA粗提取和鑒定任務四：閱讀教材P74-75關于DNA粗提取與鑒定”，回答下列問題。1.DNA和蛋白質如何分開？2.DNA如何鑒定？3.你能歸納DNA提取的步驟嗎？4.研磨后取上清液還是沉淀？5.上清液加入預冷95%酒精的目的是？DNA粗提取和鑒定任務四：閱讀教材P74-75關于DNA粗提取與鑒定”，回答下列問題。1.DNA和蛋白質如何分開？2.DNA如何鑒定？3.你能歸納DNA提取的步驟嗎？DNA、RNA、蛋白質、脂質等的物理性質和化學性質不同DNA不溶于酒精，某些蛋白質溶于酒精，初步分離DNA和蛋白質DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/l的NaCl溶液中DNA+二苯胺試劑藍色沸水浴取材過濾分離鑒定DNA粗提取和鑒定不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。新鮮洋蔥（也可以選擇香蕉、菠菜、菜花或豬肝等作為實驗材料，提取DNA的方法可能稍有不同）用洋蔥做材料，為什么要充分研磨？充分研磨，可以破壞細胞壁，裂解細胞，釋放DNA。豬血和雞血，哪個適合用作提取DNA的材料？操作時如何防止血液凝固？豬血（哺乳動物的成熟紅細胞）無細胞核，不適合；雞血中紅細胞有核DNA，且核DNA的量較多，適合。雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。P117DNA粗提取和鑒定SDS（十二烷基疏酸鈉）可使蛋白質變性與DNA分離EDTA（乙二胺四乙酸）DNA酶抑制劑，可防止細胞破碎后DNA降解DNATris（三羥甲基氨基甲烷）提供緩沖體系，使DNA在緩沖體系中呈穩定狀態研磨液DNA粗提取和鑒定任務四：閱讀教材P74-75關于DNA粗提取與鑒定”，回答下列問題。注意：（1）研磨時間不宜太長防止研磨時產生的熱量影響DNA的提取量（2）上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質？可能含有核蛋白、多糖等雜質4.研磨后取上清液還是沉淀？上清液(1)研磨的目的破碎細胞，使核物質容易溶解在研磨液中(2)研磨時間不宜太長防止研磨時產生的熱量影響DNA的提取量(3)有條件的可以在材料處理的過程中加入纖維素酶、果膠酶研磨效果好（有利于充分研磨）(4)研磨不宜太用力（3)低溫放置幾分鐘的作用可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少其斷裂；任務四：閱讀教材P74-75關于DNA粗提取與鑒定”，回答下列問題。5.上清液加入預冷