DBS13河北省衛生和計劃生育委員會發布IDBS13/001—2015本標準按GB/T1.1-2009規定的格式編寫。本標準的附錄A為規范性附錄。本標準由河北省衛生和計劃生育委員會歸口。本標準于2015年4月23日首次發布。1DBS13/001—2015食品安全地方標準食品中諾如病毒檢測本標準規定了貝類、生食葉類蔬菜和包裝飲用水等食品中諾如病毒普通RT-PCR和實時熒光RT-PCR檢測方法。本標準適用于貝類、生食葉類蔬菜和包裝飲用水等食品中GⅠ型和GⅡ型諾如病毒的檢測。2術語和定義下列術語和定義適用于本標準。諾如病毒norovirus諾如病毒屬于人類杯狀病毒科，諾如病毒屬，是一組形態相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。諾如病毒直徑約為26nm～35nm，無包膜，表面粗糙，球形，呈二十面體對稱。諾如病毒基因組是單股正鏈RNA，組成長約7kb～7.5kb，電鏡下缺乏顯著的形態學特征，負染色電鏡照片顯示，諾如病毒是具有典型的羽狀邊緣、表面有凹痕的小圓狀結構病毒。諾如病毒共可分為GⅠ~GⅤ5個基因型，其中感染人的主要是GⅠ型和GⅡ型。3設備和材料3.1電子天平：感量0.1g。3.2組織勻漿器或其他可以破碎樣品的工具。3.3普通冰箱：2℃~8℃。3.4超低溫冰箱：-80℃±5℃。3.5高速冷凍離心機：最大離心力大于15000g。3.6恒溫水浴箱或金屬浴：37℃~65℃。3.7PCR擴增儀。3.8實時熒光PCR擴增儀。3.9電泳儀。3.10凝膠成像系統。3.11震蕩混勻器。3.12電熱干燥箱。DBS13/001—201523.13pH計。3.14水過濾系統。3.16洗耳球或電動移液器。3.17無RNA酶的玻璃容器、微量加樣器吸頭、無菌50mL離心管、無菌1.5mL離心管和PCR管。3.18無RNA酶的一次性移液管：10mL、25mL。3.19混合硝酸纖維素膜：孔徑0.22μm。4試劑除有特殊說明外，所有實驗用試劑均為分析純。4.1無RNA酶的超純水：見附錄A.1。4.2甘氨酸緩沖液：見附錄A.2。4.35XPEG8000溶液：見附錄A.3。4.42.5mol/L氯化鎂(MgCl2)溶液：見附錄A.4。4.5牛肉膏-甘氨酸洗脫液:見附錄A.5。4.6氯仿。4.71mol/L鹽酸溶液。4.81mol/L氫氧化鈉溶液。4.9病毒RNA提取試劑盒。4.10TaqDNA聚合酶：-20℃保存，避免反復凍融。4.11逆轉錄酶：-20℃保存，避免反復凍融。4.12RNA酶抑制劑：-20℃保存，避免反復凍融。4.13dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。4.14引物和探針：使用濃度為25μmol/L，-20℃保存，引物和探針序列見表1和表2。表1普通RT-PCR檢測引物正向引物F:5’-ATACCACTATGATGCAGATTA-3’反向引物R:5’-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3’3表2實時熒光RT-PCR檢測引物和探針正向引物F:5'-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3’反向引物R:5’-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’探針:5’-FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA-3’正向引物F:5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’反向引物R:5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’探針:5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA-3’4.151×TAE：見附錄A.6。4.16分子量標記：100bp～1000bp。4.17諾如病毒陽性對照。4.18諾如病毒陰性對照。4.19溴化乙錠（EB）溶液（10μg/μL）：見附錄A.7。4.2010×上樣緩沖液：見附錄A.8。4.21含0.5μg/mL溴化乙錠（或5%GoldView）的1.5%瓊脂糖凝膠：見附錄A.9。5檢測程序諾如病毒檢測程序見圖1。4貝類消化腺5g+35mL甘氨酸緩沖液生食葉類蔬菜25g+40mL甘氨酸緩沖液包裝飲用水500mL+10mLMgCl?溶液切碎，孵育或震蕩，4℃離心30min調pH至3.0,過濾上清+10mL氯仿萃取，4℃夜，離心5夜，離心5min濾膜+10mL牛肉膏-甘氨酸洗脫20-30min,去除濾膜冰上1h或4℃過夜，離心5min60℃溶解5min,離心取上清。病毒粗提產物結果報告運輸過程中保持樣品溫度在0℃~5℃。實驗室接到樣品后應盡快進行檢測。如果暫時不能檢測應6.2.1.2按無菌操作取5g消化腺組織，在組織勻漿器中高速勻漿3min或切碎成2mm3以下的小塊，放入50mL離心管中，加入35mL甘氨酸緩沖液(樣品重量與緩沖液體積之比為1:7),37℃孵育30minDBS13/001—20155或室溫下劇烈振蕩10min。4℃,10000g離心30min。6.2.1.3轉移上清液至另一個50mL離心管中，加入10mL或更多氯仿，充分振蕩，放置10min，4℃,10000g離心30min。如上清較渾濁，可重復用氯仿再抽提一次。6.2.1.4轉移上清至另一個50mL離心管中，用1mol/L鹽酸調節pH至7.0±0.5，加入0.25倍體積的PEG8000溶液（PEG終濃度為8%），上下顛倒離心管以充分混勻。6.2.1.5冰上放置至少1h或4℃放置過夜。4℃,10000g離心5min。棄去上清，保留沉淀。6.2.1.6加入200μL無RNA酶的超純水，60℃加熱5min充分溶解沉淀。4℃,10000g離心3min，取上清，得到病毒粗提產物。6.2.2生食葉類蔬菜6.2.2.1使用無菌的剪刀和鑷子將25g生食葉類蔬菜剪成約2.5cm×2.5cm×2.5cm的小塊，裝入50mL6.2.2.2轉移上清至另一個50mL離心管中，用1mol/L鹽酸溶液調節pH至7.0±0.5，加入0.25倍體積的PEG8000溶液，上下顛倒離心管以充分混勻。6.2.2.3冰上放置至少1h或4℃放置過夜。4℃,10000g離心5min。棄去上清，保留沉淀。6.2.2.4加入200μL無RNA酶的超純水，60℃加熱5min充分溶解沉淀。4℃,10000g離心3min，取上清，得到病毒粗提產物。6.2.3包裝飲用水6.2.3.1500mL水樣中加入10mL的2.5mol/L氯化鎂溶液，使其終濃度達到0.05mol/L；用1mol/L鹽酸調節水樣pH至3.0±0.5。6.2.3.2采用真空抽濾使之通過孔徑為0.22μm的混合硝酸纖維素膜（混濁度較大的污水,需預先澄清），然后用10mL牛肉膏-甘氨酸洗脫液（pH9.5）震蕩洗脫濾膜20～30min。6.2.3.3去除濾膜，用1mol/L鹽酸溶液調節洗脫液pH至7.0±0.5，向洗脫液中加入0.25倍體積的PEG8000溶液，上下顛倒離心管以充分混勻。6.2.3.4將離心管及樣液一起放在冰上放置至少1h或4℃放置過夜。4℃,10000g離心5min。棄去上清，保留沉淀。6.2.3.5加入200μL無RNA酶的超純水，60℃加熱5min充分溶解沉淀。4℃,10000g離心3min，取上清，得到病毒粗提產物。6.3病毒RNA的提取和純化使用病毒RNA提取試劑盒進行RNA的提取和純化，采用如下方法，或根據儀器和試劑盒要求調整操作步驟。6.3.1在核酸提取板每孔中加入20μL磁珠混合物，加入200μL病毒粗提產物，加入500μL含有CarrierRNA的裂解/結合混合液，混勻后震蕩5min使裂解完全。6.3.2提取板放置磁性抽提架上至少3min以捕獲磁珠（捕獲的時間取決于磁架的類別和型號）。當捕獲完全，磁珠會在磁架上形成顆粒。DBS13/001—201566.3.3棄去上清，加入300μL漂洗液1，震蕩1min，在磁架上放置1min，棄去上清。6.3.4重復上一步驟一次。6.3.5加入450μL漂洗液2，震蕩1min，在磁架上放置1min，棄去上清。6.3.6重復上一步驟一次。6.3.7離心2min，去除漂洗液和酒精。6.3.8加入60μL室溫或預熱至60℃~65℃的洗脫液，震蕩3min，放置磁架上1min，轉移上清至另一個1.5mL離心管中，-20℃保存純化的RNA。注意事項：為防止RNA降解，所用實驗用具及溶液應無RNA酶，操作過程中應自始至終佩戴一次性橡膠或乳膠手6.4病毒核酸檢測兩種方法可任選一種。6.4.1普通RT-PCR法6.4.1.1普通RT-PCR反應體系一步法普通RT-PCR反應體系見表3。每個反應體系設置兩個平行反應。反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行適當調整。以諾如病毒RNA為陽性對照，以不含有諾如病毒RNA作為陰性對照，以水代替模板作為空白對照。表3普通RT-PCR反應體系————6.4.1.2普通RT-PCR反應條件反應條件為：7或根據試劑要求調整反應條件。6.4.1.3PCR擴增產物的電泳檢測用電泳緩沖液（1×TAE）、0.5μg/mL溴化乙錠（或GoldView等核酸染料）配制1.5%的瓊脂糖凝膠（見附錄A.9）。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將9μLPCR擴增產物，加1μL10×上樣緩沖液，點樣，電泳。電壓根據電泳槽長度來確定，一般控制在3V/cm～5V/cm，當溴酚藍移動到凝膠邊緣時關閉電源。凝膠成像系統觀察電泳結果，獲取并保存圖像。6.4.2實時熒光RT-PCR法6.4.2.1實時熒光RT-PCR反應體系一步法RT-PCR反應體系見表4。反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行適當調整。以諾如病毒RNA為陽性對照，以不含有諾如病毒RNA作為陰性對照，以水代替模板作為空白對照。表4實時熒光RT-PCR反應體系————6.4.2.2實時熒光RT-PCR反應條件反應條件為：或根據試劑要求調整反應條件。45個循環7結果判定標準7.1普通RT-PCR法如果陰性對照和空白對照均未出現條帶，陽性對照出現一條326bp大小的條帶，而樣品未出現預期大小的條帶，則可判定樣品為諾如病毒陰性。如果陰性對照和空白對照均未出現條帶，陽性對照出現一條326bp大小的條帶，樣品也出現預期大小條帶，則可判定樣品為諾如病毒陽性。7.2實時熒光RT-PCR法DBS13/001—20158待測樣品的Ct值大于或等于45時，則判定諾如病毒陰性。待測樣品的Ct值小于或等于30時，則判定諾如病毒陽性。待測樣品的Ct值小于45而大于30時，應重新進行測試，如果重測樣品的Ct值大于或等于45時，則判定諾如病毒陰性；如果重測樣品的Ct值小于45時，則判定諾如病毒陽性。8結果報告8.1陰性結果報告方式若貝類檢測結果為陰性，則結果報告為5g貝類消化腺未檢出諾如病毒。若生食葉類蔬菜檢測結果為陰性，則結果報告為25g生食葉類蔬菜未檢出諾如病毒。若包裝飲用水檢測結果為陰性，則結果報告為500mL包裝飲用水未檢出諾如病毒。8.2陽性結果報告方式若貝類檢測結果為陽性，則結果報告為5g貝類消化腺檢出諾如病毒。若生食葉類蔬菜檢測結果為陽性，則結果報告為25g生食葉類蔬菜檢出諾如病毒。若包裝飲用水檢測結果為陽性，則結果報告為500mL包裝飲用水檢出諾如病毒。DBS13/001—20159（規范性附錄）試劑的配制除有特殊說明外，所有實驗用試劑均為分析純。RNA酶的去除和無RNA酶溶液的配制：配制溶液用的液體和固體應采用未開封的新品。配制溶液所用的超純水、玻璃容器、移液器吸頭、藥匙等用具應無RNA酶。操作過程中應始終佩戴乳膠手套，并經常更換，以避免皮膚上的細菌和真菌及人體自身分泌的RNA酶污染用具或帶入溶液。玻璃容器應在240℃烘烤4h以去除RNA酶。離心管、移液器吸頭、藥匙等用具可購買無RNA酶級別的，或用0.1%的焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液室溫浸泡過夜，然后高壓滅菌并烘干。A.1無RNA酶的超純水A.1.1成分超純水1000.0mL焦炭酸二乙酯（DEPC）1.0mLA.1.2制法避光，室溫攪拌過夜，121℃高壓滅菌15min，備用。A.2甘氨酸緩沖液（含0.1mol/L甘氨酸，0.3mol/L氯化鈉，pH9.5）A.2.1成分甘氨酸7.50g氯化鈉17.55gA.2.2制法將上述各成分攪拌溶解于超純水中，調節pH至9.5，用超純水定容至1000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.35XPEG8000溶液[含40%（w/v）PEG8000，1.5mol/L氯化鈉]A.3.1成分PEG8000400.0g氯化鈉87.0gA.3.2制法將上述各成分攪拌溶解于超純水中，用超純水定容至1000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備A.42.5mol/L氯化鎂(MgCl2)溶液A.4.1成分氯化鎂（MgCl2）238.0gA.4.2制法將上述各成分攪拌溶解于超純水中，用超純水定容至1000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.5牛肉膏-甘氨酸洗脫液（含3％牛肉膏,0.05mol/L甘氨酸,pH9.5）A.5.1成分牛肉膏30.0g甘氨酸3.75gA.5.2制法將上述各成分攪拌溶解于超純水中，調節pH至9.5，用超純水定容至1000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.61×TAE電泳緩沖液A.6.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2）溶液，pH8.0A.6.1.1成分乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2·2H2O）186.1gA.6.1.2制法將上述各成分攪拌溶解于超純水中，調節pH至8.0，用超純水定容至1000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.6.250×TA