ICS71.040CCSB0422吉林省地方標準DB22/T3646—2024長白山林蛙油鑒別高效液相色譜蛋白質特征圖譜法AuthentificationofChangbaimountainRanaeOviductus-highperformanceliquidchromotography(HPLC)basedproteincharacteristicchromatogram吉林省市場監督管理廳發布DB22/T3646—2024前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》和GB/T20001.4—2015《標準編寫規則第4部分：試驗方法標準》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由吉林省農業農村廳提出并歸口。本文件由吉林省農業農村廳負責組織實施。本文件起草單位：吉林農業大學、吉林大學、吉林省林蛙標準化技術委員會、吉林黃梔花藥業有限公司。本文件主要起草人：王詩涵、王志寒、王永生、王道君、伊常青。IDB22/T3646—2024長白山林蛙油鑒別高效液相色譜蛋白質特征圖譜法1范圍本文件規定了林蛙油鑒別蛋白質組成的特征圖譜法的分析原理、試劑及材料、試劑配制、儀器設備、樣品、試驗步驟及實驗數據分析的要求。本文件適用于長白山林蛙油真實性的鑒別。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。蛙科動物中國林蛙（RanatemporariachensinensisDavid）雌蛙的輸卵管。主產于長白山地區，4中藥特征圖譜可采用特征峰保留時間評價，供試品特征圖譜的相關色譜峰應與相應的參照物色譜峰保留時間相同。特征峰相對保留時間規定值范圍一般應不超過±10%。實驗以溶菌酶作參照物，通過分析林蛙油蛋白質特征峰與參照峰的相對保留時間確定目標峰，根據指紋圖譜軟件提取長白山林蛙油中蛋白質組成成分的特征峰，建立蛋白質對照特征圖譜，進行真實性鑒別。5警示——使用本文件的人員應有正規實驗室工作的實踐經驗。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責任采取適當的安全和健康措施，并保證符合國家有關法規規定的條件。二硫蘇糖醇（C4H10O2S2，DTT）。三氟乙酸（C2HF3O2，TFA）。1DB22/T3646—2024無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）硫酸銨（(NH4)2SO4）。鹽酸胍（CH5N3?HCl）。水（H2O）：GB/T6682規定的一級水。6試劑配制磷酸鹽緩沖液（PBS）（0.1mol/LpH7.4）：使用天平稱取6.04g二水合磷酸二氫鈉和8.71g的無水磷酸氫二鈉，混合后用水定容至1L。60%飽和度的硫酸銨溶液：在25℃下，使用天平稱取390g硫酸銨，加水至1L后攪拌溶解即獲得60%飽和度的硫酸銨溶液。鹽酸胍（1mL6mol/L）含DTT（10mmol/L）：使用天平稱取57.3g鹽酸胍和0.1542gDTT混合，加入水溶解定容至100mL。7儀器設備高效液相色譜儀-紫外檢測器。冷凍離心機：0rpm～12000rpm，0℃～4℃。電熱鼓風干燥箱。旋轉蒸發儀。粉碎機：頻率：50Hz～60Hz。磁力攪拌器。天平：感量：0.001g和0.00001g。300?C8色譜柱：250mm×4.6mm，5μm。二號篩。具塞錐形瓶：100mL。離心管：100mL。89應符合《中華人民共和國藥典》（2020年版）一部中哈蟆油項下性狀、鑒別和檢查的相關要求。2DB22/T3646—2024取10g±1g的林蛙油樣品混勻后，經粉碎機粉碎后過二號篩，取上述粉碎后樣品2g，稱定，置于具塞錐形瓶中經20mL石油醚室溫攪拌脫脂1h，用布氏漏斗和抽濾瓶濾過后，粉末置于電熱鼓風干燥箱中55℃烘干1h，保存備用。供試品溶液制備9.2.19.2.2取試樣0.5g，稱定，置于具塞錐形瓶中，加磷酸鹽緩沖液50mL。磁力攪拌器連續25℃攪拌8h后，以5000r/min離心15min，收集上清液，再次提取沉淀物，合并全部上清液。9.2.3向上清液中（9.2.2）加入1.5倍含0.085%三氟乙酸（v/v）的乙腈放置1h后，以5000r/min離心15min，收集全部上清液。9.2.49.2.59.2.69.2.7上清液（9.2.3）在50℃下使用旋轉蒸發儀回收乙腈，得到濃縮液0.5mL～1.5mL。取濃縮液（9.2.4）緩慢加入30mL60%飽和度的硫酸銨。混合物（9.2.5）在0℃～4℃靜置1h后，以8000r/min離心20min。離心管中的沉淀（9.2.6），使用1mL6mol/L鹽酸胍（含10mmol/LDTT）渦旋充分溶解后完全轉入透析袋中，將透析袋懸浮于裝有一級水的燒杯中，磁力攪拌燒杯中的水，持續透析12h，將透析袋中溶液轉移至5mL容量瓶中，用一級水沖洗透析袋并轉移至容量瓶中，定容至刻度，充分搖勻，備用。9.2.89.2.9取溶液（9.2.7），使用濾膜過濾至樣品瓶。將樣品溶液（9.2.8）與參照物溶液（9.3.2）按4:1比例混合作為供試品溶液待用。參照物溶液的制備對照品儲備液配制取溶菌酶標準品6.5mg，精密稱定，用一級水充分溶解，轉移至5mL容量瓶中，定容至刻度，充分搖勻，配置成濃度為1.3mg/mL的對照品儲備液，0℃～4℃冰箱保存，保存期30天。9.3.2對照品工作溶液配制精密量取對照品儲備液125μL，用一級水定容至1mL，將1.3mg/mL溶液稀釋成0.1625mg/mL的參照物溶液，吸取參照物溶液，使用濾膜過濾至樣品瓶，于0℃～4℃冰箱保存，作為參照物溶液待用。高效液相色譜儀，色譜柱，流動相：含0.085%三氟乙酸（v/v）的乙腈（A）-含0.1%三氟乙酸（v/v）的一級水（B），線性梯度洗脫，按照表1設置洗脫條件；檢測波長：215nm；柱溫：45℃；進樣量：20μL。表1時間流動相A%流速（含0.085%TFA的乙腈溶液）（含0.1%TFA的水溶液）3DB22/T3646—2024試樣測定按9.4中色譜條件進行測定，記錄色譜圖。數據處理使用相應液相色譜儀工作站對數據進行記錄和處理，積分參數：斜率靈敏度為1，峰寬為0.02，最小峰面積為50，最小峰高為3.5。10試驗數據分析在相同條件下，將樣品特征圖譜（圖A.1）與溶菌酶參照物圖譜（圖A.2）進行比較。以樣品相對保留時間均值（n≥6）標定共有特征峰，以參照物溶菌酶保留時間相對應的峰為S峰，計算特征色譜峰與S峰的相對保留時間。規定值為：0.651（峰1）、0.730（峰2）、0.904（峰3）、1.000（峰S）、1.126（峰4）、1.172（峰5）。樣品圖譜應與標準圖譜峰形（圖A.1）保留時間一致，其相對保留時間應在規定值的±5%之內。4DB22/T3646—2024附錄A（規范性）對照特征圖譜