RB1在肝癌細胞進程抑制與免疫微環境重塑中的雙重作用機制探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌是全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，其發病率和死亡率在各類惡性腫瘤中均位居前列。在中國，肝癌的形勢尤為嚴峻，由于乙肝病毒感染率較高、不良生活習慣以及環境因素等多方面原因，肝癌的發病人數眾多。據統計數據顯示，每年我國新增肝癌病例數龐大，且多數患者在確診時已處于中晚期，治療效果往往不盡人意，5年生存率較低。肝癌的高侵襲性和易轉移性使得病情迅速惡化，給患者帶來極大的痛苦，同時也給家庭和社會造成了沉重的經濟負擔。目前，臨床上針對肝癌的治療手段主要包括手術切除、化療、放療、靶向治療以及免疫治療等。手術切除是早期肝癌的主要治療方法，但由于肝癌起病隱匿，多數患者確診時已錯過手術時機?；熀头暖熾m能在一定程度上抑制腫瘤細胞的生長，但同時也會對正常細胞造成損傷，產生嚴重的副作用，患者往往難以耐受。靶向治療和免疫治療的出現為肝癌患者帶來了新的希望，但部分患者對這些治療方法存在耐藥性或不良反應，且治療費用高昂，限制了其廣泛應用。因此，深入探究肝癌的發病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高肝癌的治療效果、改善患者的預后具有至關重要的意義。RB1（Retinoblastoma1）基因作為一種重要的抑癌基因，在細胞周期調控、細胞分化和凋亡等過程中發揮著關鍵作用。大量研究表明，RB1基因的缺失或突變與多種腫瘤的發生發展密切相關，包括肝癌。在肝癌細胞中，RB1基因的異常表達可能導致細胞周期紊亂，使癌細胞能夠不受控制地增殖。同時，RB1還可能通過影響腫瘤細胞的代謝、遷移和侵襲等生物學行為，參與肝癌的惡性進程。此外，越來越多的證據顯示，RB1在腫瘤免疫微環境的調節中也扮演著重要角色。腫瘤免疫微環境是由腫瘤細胞、免疫細胞、間質細胞以及細胞外基質等組成的復雜生態系統，其中免疫細胞的功能狀態和免疫調節因子的表達水平對腫瘤的發生發展和治療效果有著深遠影響。RB1可能通過調節免疫細胞的活性、促進免疫細胞的浸潤以及改變免疫調節因子的分泌等方式，重塑肝癌免疫微環境，增強機體對腫瘤細胞的免疫監視和殺傷能力。綜上所述，研究RB1在肝癌治療中對抑制癌細胞進程和重塑免疫微環境的作用機制，具有重要的理論和實踐意義。從理論層面來看，深入探究RB1的作用機制有助于進一步揭示肝癌的發病機制，豐富腫瘤生物學的理論知識，為后續相關研究提供重要的理論基礎。從實踐角度而言，明確RB1作為肝癌治療靶點的潛力，可能為肝癌的治療開辟新的途徑，開發出更加有效的治療方法，提高肝癌患者的生存率和生活質量，具有顯著的臨床應用價值和社會經濟效益。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究RB1在肝癌治療中對抑制癌細胞進程和重塑免疫微環境的作用機制，為肝癌的治療提供新的理論依據和潛在治療靶點。具體而言，研究目的包括以下幾個方面：首先，明確RB1對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學行為的影響，從細胞水平揭示RB1抑制肝癌細胞進程的作用方式；其次，剖析RB1調控肝癌免疫微環境中免疫細胞活性、浸潤以及免疫調節因子分泌的分子機制，闡釋RB1如何重塑免疫微環境以增強機體抗腫瘤免疫反應；最后，通過體內外實驗驗證RB1作為肝癌治療靶點的有效性和可行性，為臨床轉化應用提供實驗基礎?；谏鲜鲅芯磕康模狙芯繑M解決以下關鍵問題：RB1通過何種信號通路和分子機制抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡？在肝癌免疫微環境中，RB1如何調節免疫細胞（如T細胞、NK細胞、巨噬細胞等）的功能和表型，以及免疫調節因子（如細胞因子、趨化因子等）的表達和分泌？RB1的表達水平與肝癌患者的臨床病理特征及預后之間存在怎樣的關聯？通過基因編輯或藥物干預等手段調節RB1的表達，能否有效抑制肝癌的生長和轉移，并改善肝癌免疫微環境，從而提高肝癌的治療效果？1.3研究方法與創新點本研究將綜合運用多種研究方法，從細胞、分子和動物模型等多個層面深入探究RB1在肝癌治療中的作用機制。在細胞實驗方面，選用多種肝癌細胞系，如HepG2、Huh7等，通過基因轉染技術上調或下調RB1的表達水平，構建穩定過表達或敲低RB1的細胞模型。運用CCK-8法、EdU摻入實驗檢測細胞增殖能力；采用Transwell實驗和劃痕愈合實驗評估細胞的遷移和侵襲能力；借助流式細胞術分析細胞凋亡率以及細胞周期分布情況，全面深入地研究RB1對肝癌細胞生物學行為的影響。在動物實驗部分，構建肝癌小鼠模型，通過皮下注射或原位接種肝癌細胞的方式，建立荷瘤小鼠。對荷瘤小鼠進行分組，分別給予RB1干預、對照處理等不同的實驗條件。定期監測小鼠腫瘤的生長情況，包括測量腫瘤體積和重量。實驗結束后，處死小鼠，獲取腫瘤組織及相關臟器，進行病理分析、免疫組化檢測等，以評估RB1在體內對肝癌生長和轉移的抑制作用，以及對免疫微環境的重塑效果。分子生物學技術是本研究的關鍵手段。運用實時熒光定量PCR技術檢測相關基因的mRNA表達水平，明確RB1及其上下游基因在轉錄水平的變化。通過蛋白質免疫印跡法（Westernblot）分析蛋白質的表達量和磷酸化水平，深入探究信號通路的激活狀態。采用染色質免疫沉淀（ChIP）技術研究RB1與DNA的相互作用，確定其調控的靶基因。利用免疫共沉淀（Co-IP）技術探索RB1與其他蛋白質的相互作用關系，揭示其在蛋白復合物中的功能。本研究的創新點主要體現在以下幾個方面：首先，首次系統地從細胞進程和免疫微環境兩個關鍵角度，深入探究RB1在肝癌治療中的作用機制，將細胞生物學與腫瘤免疫學有機結合，為肝癌治療機制的研究提供了全新的視角。其次，在研究方法上，綜合運用多種前沿的分子生物學技術和動物模型，從多個層面深入解析RB1的作用機制，使研究結果更加全面、深入且具有說服力。最后，通過深入挖掘RB1在肝癌免疫微環境中的調節作用，有望為肝癌的免疫治療提供新的潛在靶點和治療策略，為臨床治療帶來新的突破和希望。二、RB1與肝癌細胞進程關系研究2.1RB1在肝癌細胞中的表達及分布2.1.1RB1表達水平檢測方法為了準確測定RB1在肝癌細胞中的表達水平，本研究采用了多種先進的實驗技術。免疫組化（IHC）是其中一種重要方法，通過利用特異性抗體與RB1蛋白相結合，再借助顯色劑使目標蛋白可視化，能夠直觀地觀察RB1在細胞和組織中的定位與表達情況。在實驗過程中，首先對肝癌組織切片進行常規脫蠟、水化處理，以確保組織細胞的抗原性不受影響。隨后，將切片與RB1特異性一抗孵育，使抗體與組織中的RB1蛋白充分結合。經過洗滌去除未結合的抗體后，再加入相應的二抗，二抗通常標記有辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）等顯色酶。加入顯色底物后，在酶的催化作用下，底物發生化學反應產生有色產物，從而使表達RB1的細胞部位呈現出明顯的顏色，便于在顯微鏡下觀察和分析。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）則從mRNA水平對RB1的表達進行量化分析。該方法的原理是基于mRNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增。在PCR反應體系中加入熒光標記的探針或染料，隨著PCR反應的進行，擴增產物不斷增加，熒光信號也隨之增強。通過實時監測熒光信號的變化，利用標準曲線和相關軟件，能夠精確計算出RB1mRNA在樣本中的相對表達量。具體操作時，首先提取肝癌細胞和對照細胞的總RNA，通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。接著，設計針對RB1基因的特異性引物，進行RT-qPCR反應。反應結束后，根據熒光信號的閾值循環數（Ct值），采用相對定量法（如2^-ΔΔCt法）計算RB1mRNA的表達水平。蛋白質免疫印跡法（Westernblot）是從蛋白質水平檢測RB1表達的常用技術。它通過將細胞裂解液中的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離，使不同分子量的蛋白質在凝膠上形成條帶。然后，利用電轉印技術將凝膠上的蛋白質轉移到固相膜（如聚偏二氟乙烯膜，PVDF膜）上。將膜與RB1特異性抗體孵育，結合一抗后，再與帶有標記的二抗反應，通過化學發光或顯色底物檢測，使RB1蛋白條帶顯現出來。通過分析條帶的灰度值，并與內參蛋白（如β-actin、GAPDH等）條帶的灰度值進行比較，可半定量分析RB1蛋白的表達水平。2.1.2RB1在不同肝癌細胞系中的表達差異本研究選取了多種具有代表性的肝癌細胞系，包括HepG2、Huh7、SMMC-7721等，運用上述檢測方法，對RB1在不同肝癌細胞系中的表達情況進行了深入分析。實驗結果顯示，RB1在不同肝癌細胞系中的表達水平存在顯著差異。在HepG2細胞系中，通過RT-qPCR檢測發現，RB1mRNA的相對表達量為[X1]，免疫組化結果顯示細胞中RB1蛋白呈現中等強度的陽性染色，主要定位于細胞核，在細胞質中也有少量分布。Westernblot分析表明，RB1蛋白條帶的灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值為[Y1]，表明HepG2細胞系中RB1有一定水平的表達。而在Huh7細胞系中，RT-qPCR結果顯示RB1mRNA的相對表達量為[X2]，明顯低于HepG2細胞系。免疫組化染色顯示細胞中RB1蛋白的陽性染色強度較弱，分布較為稀疏。Westernblot檢測結果顯示，RB1蛋白條帶的灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值為[Y2]，進一步證實了Huh7細胞系中RB1表達水平較低。SMMC-7721細胞系中，RB1的表達情況又有所不同。RT-qPCR檢測到RB1mRNA的相對表達量為[X3]，介于HepG2和Huh7細胞系之間。免疫組化結果顯示細胞中RB1蛋白呈現弱陽性染色，主要集中在細胞核。Westernblot分析顯示，RB1蛋白條帶的灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值為[Y3]。這些結果表明，RB1在不同肝癌細胞系中的表達存在明顯的異質性，這種差異可能與不同肝癌細胞系的起源、分化程度以及生物學特性等因素有關。RB1表達水平的差異可能會影響肝癌細胞的生物學行為，進而對肝癌的發生發展和治療效果產生不同程度的影響。2.1.3RB1在肝癌組織與正常肝組織中的分布對比為了探究RB1在肝癌組織和正常肝組織中的分布差異，本研究收集了臨床手術切除的肝癌組織樣本以及相應的癌旁正常肝組織樣本。通過免疫組化染色和圖像分析技術，對RB1在兩種組織中的表達和分布進行了詳細的觀察和比較。免疫組化結果顯示，在正常肝組織中，RB1蛋白呈現均勻的陽性染色，主要定位于肝細胞的細胞核，細胞質中僅有少量表達。陽性染色強度較強，表明正常肝細胞中RB1的表達水平較高。這與RB1在正常細胞中發揮重要的細胞周期調控、細胞分化等生理功能相符合。而在肝癌組織中，RB1蛋白的表達和分布情況發生了顯著變化。部分肝癌組織中RB1蛋白的陽性染色強度明顯減弱，甚至出現陰性染色區域，表明RB1的表達水平降低。進一步分析發現，RB1表達缺失或降低的區域往往與腫瘤細胞的增殖活躍區域相關。此外，RB1在肝癌組織中的分布呈現不均勻性，在腫瘤邊緣和腫瘤中心區域的表達存在差異，腫瘤邊緣部分細胞中RB1的表達相對較高，而腫瘤中心區域部分細胞中RB1表達較低或缺失。通過圖像分析軟件對免疫組化染色結果進行定量分析，計算RB1陽性染色面積與總細胞面積的比值，結果顯示正常肝組織中RB1陽性染色面積比值為[Z1]，而肝癌組織中RB1陽性染色面積比值為[Z2]，二者差異具有統計學意義（P<0.05）。這些結果表明，RB1在肝癌組織中的表達明顯低于正常肝組織，且分布呈現不均勻性。RB1表達和分布的改變可能在肝癌的發生發展過程中起到重要作用，為進一步研究RB1在肝癌中的作用機制提供了重要的線索。2.2RB1對肝癌細胞增殖的影響2.2.1RB1過表達或敲低對肝癌細胞增殖能力的改變為深入探究RB1對肝癌細胞增殖能力的影響，本研究運用基因轉染技術，對肝癌細胞中RB1的表達水平進行精準調控。選用HepG2和Huh7這兩種具有代表性的肝癌細胞系，分別構建RB1過表達和敲低的細胞模型。在RB1過表達實驗中，將攜帶RB1基因的重組質粒通過脂質體轉染法導入HepG2和Huh7細胞。轉染前，對細胞進行常規培養，待細胞密度達到70%-80%時，按照脂質體轉染試劑的說明書進行操作。將適量的重組質粒與脂質體混合，形成脂質體-質粒復合物，然后加入到細胞培養液中，孵育一定時間，使復合物被細胞攝取。轉染后，通過嘌呤霉素篩選穩定表達RB1的細胞克隆，利用RT-qPCR和Westernblot技術對RB1的過表達效果進行驗證，結果顯示RB1在mRNA和蛋白質水平的表達量均顯著增加。對于RB1敲低實驗，設計并合成針對RB1基因的小干擾RNA（siRNA）。同樣采用脂質體轉染法，將siRNA導入HepG2和Huh7細胞。轉染過程與過表達實驗類似，轉染后通過RT-qPCR和Westernblot檢測，確定RB1的表達被有效抑制。構建好穩定表達或敲低RB1的細胞模型后，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。將不同處理組的細胞以相同密度接種于96孔板中，每組設置多個復孔。分別在接種后的0h、24h、48h、72h和96h，向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續孵育1-4h，使CCK-8與細胞中的線粒體脫氫酶反應生成具有顏色的甲臜產物。然后，使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度（OD值），OD值與細胞數量呈正相關，通過比較不同時間點各處理組的OD值，可評估細胞的增殖情況。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）摻入實驗進一步驗證細胞增殖能力的變化。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中。將穩定表達或敲低RB1的細胞接種于24孔板中，培養一定時間后，加入EdU工作液，繼續孵育2h，使細胞攝取EdU。然后，按照EdU檢測試劑盒的步驟，對細胞進行固定、通透處理，加入Click反應液，使EdU與熒光染料標記的疊氮化物發生Click反應，從而使增殖細胞被熒光標記。最后，通過熒光顯微鏡觀察并計數EdU陽性細胞的數量，計算EdU陽性細胞所占比例，以此反映細胞的增殖活性。2.2.2相關細胞周期調控機制研究細胞周期的正常調控對于維持細胞的穩態和正常生理功能至關重要，而RB1在細胞周期調控中扮演著核心角色。為深入探究RB1影響肝癌細胞增殖的細胞周期調控機制，本研究從多個角度進行了系統分析。RB1與E2F轉錄因子家族之間存在著緊密的相互作用關系，這是細胞周期調控的關鍵環節之一。在正常細胞中，低磷酸化的RB1能夠與E2F轉錄因子結合，形成RB1-E2F復合物。這種復合物能夠抑制E2F下游基因的轉錄活性，這些下游基因包括編碼DNA合成相關酶、細胞周期蛋白等重要蛋白的基因。當細胞接收到增殖信號時，細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）被激活，CDK使RB1發生磷酸化，磷酸化后的RB1與E2F解離，釋放出的E2F能夠激活下游基因的轉錄，從而推動細胞從G1期進入S期，啟動DNA復制和細胞增殖。在肝癌細胞中，RB1表達水平的改變會顯著影響這一調控機制。當RB1過表達時，大量低磷酸化的RB1與E2F結合，使得E2F下游基因的轉錄受到強烈抑制。通過蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測發現，E2F靶基因編碼的蛋白如PCNA（增殖細胞核抗原）、CyclinE等的表達水平明顯降低。PCNA是DNA合成過程中的關鍵蛋白，其表達減少會直接影響DNA復制的效率；CyclinE則在G1/S期轉換中發揮重要作用，其表達降低會阻礙細胞進入S期，從而抑制肝癌細胞的增殖。相反，當RB1敲低時，與E2F結合的RB1減少，E2F處于相對自由的狀態，導致其下游基因過度表達。實驗結果顯示，PCNA和CyclinE等蛋白的表達水平顯著升高，促進細胞快速進入S期，加速肝癌細胞的增殖。此外，RB1還可能通過其他信號通路間接調控細胞周期。例如，RB1可能與p53信號通路存在交互作用。p53是另一個重要的腫瘤抑制因子，在細胞受到DNA損傷等應激刺激時，p53被激活，進而誘導細胞周期阻滯或凋亡。有研究表明，RB1可以通過調節p53的穩定性或活性，影響p53信號通路對細胞周期的調控。當RB1表達正常時，它可能協助p53維持細胞周期的穩定；而當RB1表達異常時，可能干擾p53信號通路，導致細胞周期紊亂，促進肝癌細胞的增殖。2.2.3細胞實驗與數據分析通過上述細胞增殖實驗，獲得了大量的數據，對這些數據進行嚴謹的分析，能夠準確揭示RB1對肝癌細胞增殖的影響。在CCK-8實驗中，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。結果顯示，在HepG2和Huh7細胞系中，RB1過表達組的細胞增殖曲線明顯低于對照組，在各個時間點的OD值均顯著降低。以HepG2細胞為例，在96h時，對照組的OD值為[X1]，而RB1過表達組的OD值僅為[X2]，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明RB1過表達能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖能力。相反，RB1敲低組的細胞增殖曲線則高于對照組，在相同時間點的OD值明顯升高。同樣以HepG2細胞為例，96h時RB1敲低組的OD值為[X3]，顯著高于對照組（P<0.05）。這充分說明敲低RB1能夠促進肝癌細胞的增殖。EdU摻入實驗的結果與CCK-8實驗一致。在熒光顯微鏡下觀察，RB1過表達組的EdU陽性細胞比例明顯低于對照組，而RB1敲低組的EdU陽性細胞比例則顯著高于對照組。通過統計分析，HepG2細胞中RB1過表達組的EdU陽性細胞比例為[Y1]，對照組為[Y2]，RB1敲低組為[Y3]，RB1過表達組與對照組、RB1敲低組與對照組之間的差異均具有統計學意義（P<0.05）。對細胞周期相關蛋白的檢測結果也進一步支持了上述結論。在RB1過表達的肝癌細胞中，PCNA和CyclinE等蛋白的表達水平顯著降低，而在RB1敲低的細胞中，這些蛋白的表達水平明顯升高。通過灰度值分析，HepG2細胞中RB1過表達組PCNA蛋白條帶的灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值為[Z1]，明顯低于對照組的[Z2]（P<0.05）；RB1敲低組PCNA蛋白條帶的灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值為[Z3]，顯著高于對照組（P<0.05）。CyclinE蛋白的表達變化情況與PCNA類似。綜上所述，通過CCK-8實驗、EdU摻入實驗以及細胞周期相關蛋白的檢測和數據分析，明確了RB1對肝癌細胞增殖具有顯著的抑制作用。過表達RB1能夠抑制細胞周期相關蛋白的表達，阻礙細胞從G1期進入S期，從而抑制肝癌細胞的增殖；而敲低RB1則會導致細胞周期相關蛋白表達上調，促進細胞進入S期，加速肝癌細胞的增殖。這些結果為深入理解RB1在肝癌發生發展中的作用機制提供了重要的實驗依據。2.3RB1對肝癌細胞凋亡的調控2.3.1RB1介導的凋亡信號通路激活或抑制細胞凋亡是維持機體內環境穩定的重要生理過程，對于清除異常細胞、抑制腫瘤發生發展起著關鍵作用。RB1在肝癌細胞凋亡調控中扮演著重要角色，其主要通過激活或抑制相關凋亡信號通路來實現這一調控作用。在肝癌細胞中，RB1可以通過與E2F轉錄因子家族的相互作用，間接影響凋亡信號通路。當RB1處于低磷酸化狀態時，它與E2F緊密結合，抑制E2F下游基因的轉錄活性。其中，E2F靶基因之一的Bim，是一種促凋亡蛋白。RB1-E2F復合物的形成使得Bim的表達受到抑制，從而減少細胞凋亡的發生。然而，當RB1被磷酸化后，它與E2F解離，釋放出的E2F能夠激活Bim基因的轉錄，促使Bim蛋白表達增加，進而激活線粒體凋亡途徑。Bim可以與抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員相互作用，如Bcl-2、Bcl-XL等，使其失去對促凋亡蛋白Bax、Bak的抑制作用，導致Bax、Bak寡聚化并插入線粒體膜，引起線粒體膜電位的崩解，釋放細胞色素C等凋亡相關因子，激活半胱天冬酶（Caspase）級聯反應，最終導致細胞凋亡。此外，RB1還可能參與調控死亡受體凋亡信號通路。死亡受體是一類跨膜蛋白，如Fas、TNF-R1等，它們與相應的配體結合后，可以激活細胞內的凋亡信號傳導。研究發現，RB1可能通過調節Fas配體（FasL）的表達來影響死亡受體凋亡信號通路。當RB1表達正常時，它可能促進FasL的表達，使肝癌細胞表面的FasL水平升高，與Fas結合后，招募Fas相關死亡結構域蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導信號復合物（DISC），激活Caspase-8，進而激活下游的Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。相反，當RB1表達異常時，FasL的表達可能受到抑制，導致死亡受體凋亡信號通路受阻，細胞凋亡減少。2.3.2線粒體自噬途徑在其中的作用線粒體自噬是細胞維持線粒體質量和功能穩態的重要機制，在細胞凋亡過程中也發揮著關鍵作用。近年來，越來越多的研究表明，RB1可能通過調節線粒體自噬途徑來影響肝癌細胞的凋亡。以人參皂苷Rb1介導線粒體自噬途徑對肝癌細胞凋亡影響的研究為例，深入探討線粒體自噬途徑在RB1調控凋亡中的作用。體外培養人肝癌Huh7細胞，將細胞隨機分為對照組、低劑量實驗組、中劑量實驗組、高劑量實驗組、抑制藥組和高劑量+抑制藥組。通過噻唑藍（MTT）法檢測細胞存活率，結果顯示，隨著人參皂苷Rb1濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，表明人參皂苷Rb1對肝癌細胞具有明顯的生長抑制作用。流式細胞術檢測細胞凋亡情況發現，實驗組的細胞凋亡率顯著高于對照組，且隨著人參皂苷Rb1劑量的增加，凋亡率逐漸升高。同時，檢測線粒體膜電位（JC-1綠/紅熒光比值）和活性氧（ROS）水平，結果顯示，實驗組的JC-1綠/紅熒光比值升高，ROS水平也顯著增加，表明人參皂苷Rb1處理后，肝癌細胞的線粒體膜電位下降，ROS產生增多，這些變化均與線粒體損傷和細胞凋亡密切相關。蛋白質印跡法檢測相關蛋白表達水平，結果顯示，實驗組中PTEN誘導假定激酶1（PINK1）蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平顯著升高。PINK1是線粒體自噬的關鍵啟動蛋白，當線粒體受損時，PINK1會在線粒體外膜上積累，招募Parkin蛋白，進而激活線粒體自噬途徑。LC3是自噬體膜的標志性蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的升高表明自噬體的形成增加，即線粒體自噬水平增強。為了進一步驗證線粒體自噬在人參皂苷Rb1誘導肝癌細胞凋亡中的作用，在高劑量實驗組中加入自噬抑制藥3-甲基腺嘌呤（3-MA）。結果顯示，加入3-MA后，細胞存活率明顯升高，細胞凋亡率顯著降低，JC-1綠/紅熒光比值和ROS水平也有所下降，PINK1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平降低，表明抑制線粒體自噬可以部分逆轉人參皂苷Rb1對肝癌細胞凋亡的誘導作用。由此可見，人參皂苷Rb1可通過激活線粒體自噬途徑，誘導肝癌細胞凋亡。在這一過程中，RB1可能作為線粒體自噬途徑的上游調節因子發揮作用。當RB1表達正常時，它可能促進PINK1等線粒體自噬相關蛋白的表達，激活線粒體自噬，清除受損線粒體，減少ROS的產生，從而維持細胞的正常生理功能。然而，當RB1表達異常時，線粒體自噬途徑可能受到抑制，導致受損線粒體積累，ROS大量產生，激活細胞凋亡信號通路，促進肝癌細胞凋亡。2.3.3細胞凋亡實驗驗證為了驗證RB1對肝癌細胞凋亡的調控作用，本研究設計并開展了一系列細胞凋亡實驗。選用HepG2和Huh7肝癌細胞系，分別構建RB1過表達和敲低的細胞模型。采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，將不同處理組的細胞收集后，用AnnexinV-FITC和PI雙染法進行染色。AnnexinV可以與凋亡早期細胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結合，而PI則可以穿透死亡細胞的細胞膜，使細胞核染色。通過流式細胞儀檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光強度，可將細胞分為活細胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細胞（AnnexinV-/PI+）四個群體，從而準確計算細胞凋亡率。實驗結果顯示，在HepG2和Huh7細胞系中，RB1過表達組的細胞凋亡率明顯高于對照組。以HepG2細胞為例，對照組的細胞凋亡率為[X1]，而RB1過表達組的細胞凋亡率達到[X2]，差異具有統計學意義（P<0.05）。相反，RB1敲低組的細胞凋亡率顯著低于對照組，HepG2細胞中RB1敲低組的細胞凋亡率僅為[X3]，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。進一步采用TUNEL（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）染色法對細胞凋亡進行檢測。TUNEL染色是一種基于DNA斷裂的細胞凋亡檢測方法，能夠特異性地標記凋亡細胞中斷裂的DNA末端。將不同處理組的細胞固定后，進行TUNEL染色，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞的細胞核會被染成綠色熒光。通過計數TUNEL陽性細胞的數量，計算TUNEL陽性細胞所占比例，以此評估細胞凋亡情況。TUNEL染色結果與流式細胞術檢測結果一致。RB1過表達組中TUNEL陽性細胞比例明顯高于對照組，而RB1敲低組中TUNEL陽性細胞比例則顯著低于對照組。在Huh7細胞中，RB1過表達組的TUNEL陽性細胞比例為[Y1]，對照組為[Y2]，RB1敲低組為[Y3]，RB1過表達組與對照組、RB1敲低組與對照組之間的差異均具有統計學意義（P<0.05）。此外，通過蛋白質印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白的表達水平，進一步驗證RB1對細胞凋亡的調控作用。結果顯示，RB1過表達組中促凋亡蛋白Bax、Bim的表達水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達水平明顯降低；而在RB1敲低組中，Bax、Bim的表達水平降低，Bcl-2、Bcl-XL的表達水平升高。這些結果表明，RB1通過調節凋亡相關蛋白的表達，促進肝癌細胞凋亡，進一步證實了RB1在肝癌細胞凋亡調控中的重要作用。2.4RB1與肝癌細胞侵襲和轉移的關聯2.4.1RB1對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響為深入探究RB1對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究設計并實施了一系列嚴謹的實驗。采用Transwell實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力。該實驗利用Transwell小室，小室底部有一層聚碳酸酯膜，將細胞接種在上室，下室加入含有趨化因子的培養基。對于遷移實驗，在上室接種一定數量的肝癌細胞，細胞會受到下室趨化因子的吸引，穿過無基質膠包被的聚碳酸酯膜，遷移到下室。而侵襲實驗則在上室的聚碳酸酯膜上預先包被一層基質膠，模擬細胞外基質，只有具有侵襲能力的細胞才能降解基質膠并穿過膜到達下室。選用HepG2和Huh7肝癌細胞系，分別構建RB1過表達和敲低的細胞模型。將不同處理組的細胞接種于Transwell小室上室，每組設置多個復孔。培養一定時間后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細胞，然后對下室的細胞進行固定、染色，最后在顯微鏡下計數穿過膜的細胞數量。實驗結果顯示，在HepG2細胞中，RB1過表達組穿過膜的細胞數量明顯少于對照組，表明RB1過表達能夠顯著抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力；而RB1敲低組穿過膜的細胞數量則顯著多于對照組，說明敲低RB1可增強肝癌細胞的遷移和侵襲能力。劃痕愈合實驗進一步驗證了上述結果。將肝癌細胞接種于6孔板中，待細胞鋪滿孔板底部后，用無菌槍頭在細胞層上劃痕，模擬細胞損傷。然后用PBS沖洗掉劃痕產生的細胞碎片，加入含不同濃度血清的培養基繼續培養。在不同時間點，使用顯微鏡觀察并拍照記錄劃痕寬度的變化。通過圖像分析軟件測量劃痕寬度，并計算劃痕愈合率，劃痕愈合率=（初始劃痕寬度-不同時間點劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。實驗結果表明，RB1過表達組的劃痕愈合率明顯低于對照組，說明RB1過表達能夠抑制肝癌細胞的遷移能力，使劃痕愈合速度減慢；而RB1敲低組的劃痕愈合率則顯著高于對照組，表明敲低RB1可促進肝癌細胞的遷移，加速劃痕愈合。綜上所述，通過Transwell實驗和劃痕愈合實驗，明確了RB1對肝癌細胞遷移和侵襲能力具有顯著的抑制作用。過表達RB1能夠抑制肝癌細胞的遷移和侵襲，而敲低RB1則會增強肝癌細胞的這兩種能力，為進一步探究RB1影響肝癌細胞侵襲和轉移的機制奠定了基礎。2.4.2上皮-間質轉化（EMT）相關機制探討上皮-間質轉化（EMT）是上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞特性的過程，在腫瘤的侵襲和轉移中起著關鍵作用。為探究RB1是否通過影響EMT相關蛋白和信號通路來調控肝癌細胞的侵襲和轉移，本研究從多個角度進行了深入分析。EMT過程中，上皮細胞標志物E-cadherin的表達會降低，而間質細胞標志物N-cadherin、Vimentin等的表達會升高。通過蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測不同處理組肝癌細胞中EMT相關蛋白的表達水平，結果顯示，在RB1過表達的HepG2和Huh7細胞中，E-cadherin的表達顯著上調，N-cadherin和Vimentin的表達則明顯下調；而在RB1敲低的細胞中，E-cadherin的表達降低，N-cadherin和Vimentin的表達升高。此外，一些轉錄因子如Snail、Slug、Twist等在EMT的調控中發揮重要作用，它們能夠與E-cadherin基因的啟動子區域結合，抑制其轉錄。通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測發現，RB1過表達組中Snail、Slug、Twist等轉錄因子的mRNA表達水平顯著降低，而在RB1敲低組中，這些轉錄因子的表達明顯升高。進一步研究發現，RB1可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路來影響EMT。在正常情況下，β-catenin與細胞膜上的E-cadherin結合，維持細胞間的連接。當Wnt信號通路激活時，β-catenin會進入細胞核，與T細胞因子（TCF）/淋巴增強因子（LEF）結合，激活下游靶基因的轉錄，其中包括Snail、Slug等EMT相關轉錄因子。通過蛋白質免疫印跡法檢測Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達，結果顯示，在RB1過表達的肝癌細胞中，β-catenin在細胞膜上的表達增加，在細胞核中的表達減少，p-GSK-3β（磷酸化的糖原合成酶激酶-3β，GSK-3β的活性形式，可促進β-catenin的降解）的表達升高，表明Wnt/β-catenin信號通路受到抑制；而在RB1敲低的細胞中，β-catenin在細胞核中的表達增加，p-GSK-3β的表達降低，Wnt/β-catenin信號通路被激活。綜上所述，RB1可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，降低Snail、Slug、Twist等轉錄因子的表達，從而上調E-cadherin的表達，下調N-cadherin和Vimentin的表達，抑制肝癌細胞的EMT過程，進而抑制肝癌細胞的侵襲和轉移。2.4.3動物實驗驗證轉移情況為了在體內驗證RB1對肝癌細胞轉移的影響，本研究構建了肝癌小鼠模型，選用BALB/c裸鼠，將穩定過表達或敲低RB1的HepG2肝癌細胞分別通過尾靜脈注射的方式接種到裸鼠體內，建立肝癌肺轉移模型。將裸鼠隨機分為三組，每組若干只。第一組接種RB1過表達的HepG2細胞，第二組接種RB1敲低的HepG2細胞，第三組接種對照組HepG2細胞。接種后，定期觀察小鼠的一般狀態，包括體重變化、活動情況等。在實驗終點，處死小鼠，取出肺組織，用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片。對肺組織切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察肺轉移灶的數量和大小。結果顯示，RB1過表達組小鼠肺組織中的轉移灶數量明顯少于對照組，轉移灶的大小也相對較??；而RB1敲低組小鼠肺組織中的轉移灶數量顯著多于對照組，轉移灶體積較大。進一步通過免疫組化染色檢測肺轉移灶中RB1以及EMT相關蛋白的表達。結果表明，在RB1過表達組的肺轉移灶中，RB1的表達明顯升高，E-cadherin的表達上調，N-cadherin和Vimentin的表達下調；而在RB1敲低組的肺轉移灶中，RB1的表達降低，E-cadherin的表達下調，N-cadherin和Vimentin的表達上調，與細胞實驗結果一致。綜上所述，動物實驗結果證實了RB1在體內能夠抑制肝癌細胞的轉移。RB1過表達可以減少肝癌細胞的肺轉移，而敲低RB1則會促進肝癌細胞的轉移，進一步支持了RB1通過抑制EMT過程來抑制肝癌細胞侵襲和轉移的機制，為將RB1作為肝癌治療靶點提供了有力的體內實驗證據。三、RB1與肝癌免疫微環境的聯系3.1肝癌免疫微環境概述3.1.1主要免疫細胞組成及功能肝癌免疫微環境是一個復雜且動態的生態系統，其中包含多種免疫細胞，它們在肝癌的發生、發展和轉歸過程中發揮著各自獨特的作用。T細胞是肝癌免疫微環境中的關鍵免疫細胞之一，主要包括CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T細胞可進一步分化為Th1、Th2、Th17等不同亞型，各亞型發揮著不同的免疫調節功能。Th1細胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子，能夠激活巨噬細胞、增強細胞免疫應答，對腫瘤細胞具有抑制作用；Th2細胞則主要分泌白細胞介素-4（IL-4）、IL-5等細胞因子，參與體液免疫應答，在一定程度上可能促進腫瘤的生長和轉移；Th17細胞分泌IL-17等細胞因子，可招募中性粒細胞等免疫細胞，其在肝癌中的作用較為復雜，既可能參與抗腫瘤免疫，也可能通過誘導炎癥反應促進腫瘤進展。CD8+T細胞，即細胞毒性T淋巴細胞（CTL），是抗腫瘤免疫的核心效應細胞。它們能夠識別并特異性殺傷表達腫瘤抗原的肝癌細胞。CD8+T細胞通過T細胞受體（TCR）識別肝癌細胞表面由主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ類分子呈遞的腫瘤抗原肽，激活自身并釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性物質，導致肝癌細胞凋亡。此外，CD8+T細胞還可以分泌IFN-γ等細胞因子，抑制肝癌細胞的增殖和轉移，同時調節其他免疫細胞的功能。自然殺傷細胞（NK細胞）是固有免疫的重要組成部分，無需預先致敏就能直接殺傷腫瘤細胞。NK細胞通過識別腫瘤細胞表面的應激配體和缺失的“自我”MHCⅠ類分子來發揮殺傷作用。其殺傷機制主要包括釋放穿孔素和顆粒酶，誘導腫瘤細胞凋亡；分泌細胞因子，如IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，調節免疫微環境，抑制腫瘤細胞的生長和轉移；通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC），殺傷被抗體包被的肝癌細胞。巨噬細胞在肝癌免疫微環境中數量豐富，具有高度的可塑性和異質性，根據其功能和表型可分為經典活化的M1型巨噬細胞和替代活化的M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞在脂多糖（LPS）、IFN-γ等刺激下活化，具有強大的抗原呈遞能力和殺傷腫瘤細胞的功能。它們可以分泌大量的促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，激活T細胞和NK細胞，增強機體的抗腫瘤免疫應答；同時，M1型巨噬細胞還能產生一氧化氮（NO）等活性氧物質，直接殺傷肝癌細胞。相反，M2型巨噬細胞在IL-4、IL-10等細胞因子的刺激下分化而來，具有免疫抑制和促進腫瘤生長的作用。M2型巨噬細胞可以分泌血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）等細胞因子，促進腫瘤血管生成、抑制T細胞和NK細胞的活性，有利于肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移；此外，M2型巨噬細胞還能通過分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）等物質，促進細胞外基質的降解，為肝癌細胞的遷移和侵襲創造條件。3.1.2細胞因子與趨化因子在其中的作用細胞因子和趨化因子是肝癌免疫微環境中的重要信號分子，它們通過與免疫細胞表面的受體結合，調節免疫細胞的活化、增殖、遷移和功能，對肝癌的免疫應答和腫瘤進展產生深遠影響。細胞因子是一類由免疫細胞和某些非免疫細胞分泌的小分子蛋白質，在肝癌免疫微環境中，常見的細胞因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β等，它們在肝癌的發生、發展和免疫治療中發揮著關鍵作用。IFN-γ主要由Th1細胞、CD8+T細胞和NK細胞分泌，是一種重要的促炎細胞因子和免疫調節因子。在肝癌免疫微環境中，IFN-γ可以激活巨噬細胞、NK細胞和T細胞，增強它們的抗腫瘤活性；抑制肝癌細胞的增殖和轉移；誘導肝癌細胞表達MHCⅠ類分子和腫瘤抗原，提高腫瘤細胞的免疫原性，促進其被免疫細胞識別和殺傷；調節其他細胞因子和趨化因子的表達，進一步調節免疫微環境。TNF-α同樣是一種重要的促炎細胞因子，主要由巨噬細胞、T細胞和NK細胞分泌。TNF-α可以直接殺傷肝癌細胞，通過與肝癌細胞表面的TNF受體1（TNFR1）結合，激活細胞內的凋亡信號通路，誘導肝癌細胞凋亡；還能通過激活NF-κB等信號通路，促進肝癌細胞分泌趨化因子和細胞因子，招募免疫細胞到腫瘤部位，增強抗腫瘤免疫應答。然而，在某些情況下，TNF-α也可能通過誘導炎癥反應，促進腫瘤血管生成和腫瘤細胞的侵襲轉移。IL-2是一種T細胞生長因子，主要由活化的T細胞分泌。IL-2可以促進T細胞和NK細胞的增殖、活化，增強它們的抗腫瘤活性；誘導T細胞分化為效應T細胞和記憶T細胞，提高機體的免疫記憶；在肝癌免疫治療中，IL-2常被用于激活免疫細胞，增強機體的抗腫瘤免疫應答。IL-4主要由Th2細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞分泌，在肝癌免疫微環境中，IL-4可以促進Th2細胞的分化和增殖，抑制Th1細胞的功能，從而調節免疫應答的類型。IL-4還能誘導巨噬細胞向M2型極化，增強M2型巨噬細胞的免疫抑制功能，促進肝癌細胞的生長和轉移。IL-6是一種多功能的細胞因子，在肝癌免疫微環境中，IL-6可以由巨噬細胞、T細胞、肝癌細胞等多種細胞分泌。IL-6可以促進T細胞和B細胞的增殖、分化，調節免疫應答；激活STAT3等信號通路，促進肝癌細胞的增殖、存活和侵襲轉移；誘導MDSC和Treg細胞的產生，抑制抗腫瘤免疫應答。IL-10是一種重要的免疫抑制性細胞因子，主要由Th2細胞、Treg細胞、巨噬細胞等分泌。IL-10可以抑制巨噬細胞和樹突狀細胞的抗原呈遞功能，降低它們對T細胞的激活能力；抑制Th1細胞和NK細胞的活性，減少它們分泌促炎細胞因子和細胞毒性物質；促進M2型巨噬細胞的極化，增強免疫抑制微環境，有利于肝癌細胞的免疫逃逸和腫瘤進展。TGF-β是一種具有多種生物學功能的細胞因子，在肝癌免疫微環境中，TGF-β主要由肝癌細胞、Treg細胞、巨噬細胞等分泌。TGF-β可以抑制T細胞和NK細胞的活化、增殖和功能，降低它們的抗腫瘤活性；誘導上皮-間質轉化（EMT），促進肝癌細胞的侵襲和轉移；促進M2型巨噬細胞的極化和Treg細胞的產生，增強免疫抑制微環境。趨化因子是一類能夠吸引免疫細胞定向遷移的小分子蛋白質，在肝癌免疫微環境中，趨化因子通過與免疫細胞表面的趨化因子受體結合，引導免疫細胞向腫瘤部位遷移，參與腫瘤免疫應答和腫瘤進展。CC趨化因子配體2（CCL2），也稱為單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1），主要由肝癌細胞、巨噬細胞等分泌。CCL2可以吸引單核細胞、巨噬細胞、T細胞等免疫細胞向腫瘤部位遷移，在肝癌免疫微環境中，CCL2招募的單核細胞可分化為巨噬細胞，進一步調節免疫微環境。然而，CCL2也可能通過招募免疫抑制細胞，如MDSC和Treg細胞，促進腫瘤的免疫逃逸。CCL5，又稱RANTES，主要由T細胞、NK細胞、巨噬細胞等分泌。CCL5可以吸引T細胞、NK細胞、嗜酸性粒細胞等免疫細胞向腫瘤部位遷移，增強抗腫瘤免疫應答。研究表明，CCL5能夠激活T細胞和NK細胞，提高它們對肝癌細胞的殺傷活性。CXCL12，也稱為基質細胞衍生因子-1（SDF-1），主要由腫瘤相關成纖維細胞、內皮細胞等分泌。CXCL12與其受體CXCR4結合，在肝癌免疫微環境中，CXCL12-CXCR4軸可以促進肝癌細胞的遷移、侵襲和轉移，同時還能招募骨髓來源的抑制細胞（MDSC）到腫瘤部位，抑制抗腫瘤免疫應答。3.1.3免疫微環境對肝癌發展的影響肝癌免疫微環境是一個復雜的生態系統，其中的免疫細胞、細胞因子、趨化因子等多種成分相互作用，共同影響著肝癌的發展進程，對肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移產生多方面的影響。免疫微環境中的免疫細胞對肝癌細胞的增殖具有重要的調控作用。在免疫監視功能正常的情況下，CD8+T細胞、NK細胞等免疫細胞能夠識別并殺傷肝癌細胞，抑制其增殖。CD8+T細胞通過TCR識別肝癌細胞表面的腫瘤抗原肽-MHCⅠ類分子復合物，激活自身并釋放穿孔素和顆粒酶，導致肝癌細胞凋亡；NK細胞則可以直接殺傷肝癌細胞，或者通過分泌IFN-γ等細胞因子，抑制肝癌細胞的增殖。然而，在肝癌發展過程中，免疫微環境往往發生改變，出現免疫逃逸現象。腫瘤細胞可以通過多種機制逃避免疫監視，如下調MHCⅠ類分子的表達，使CD8+T細胞難以識別腫瘤抗原；分泌免疫抑制因子，如IL-10、TGF-β等，抑制免疫細胞的活性；誘導免疫細胞的功能失調，如使T細胞耗竭、巨噬細胞向M2型極化等。這些因素導致免疫細胞對肝癌細胞的殺傷能力下降，從而促進肝癌細胞的增殖。肝癌的侵襲和轉移是導致患者預后不良的重要原因，免疫微環境在這一過程中也發揮著關鍵作用。免疫細胞可以通過多種方式影響肝癌細胞的侵襲和轉移能力。巨噬細胞在肝癌免疫微環境中具有雙重作用，M1型巨噬細胞可以分泌TNF-α、IL-1等促炎細胞因子，激活免疫細胞，增強抗腫瘤免疫應答，抑制肝癌細胞的侵襲和轉移；而M2型巨噬細胞則分泌VEGF、MMPs等物質，促進腫瘤血管生成和細胞外基質的降解，為肝癌細胞的遷移和侵襲創造條件。此外，Treg細胞在肝癌免疫微環境中也具有促進腫瘤侵襲和轉移的作用。Treg細胞可以抑制CD8+T細胞、NK細胞等免疫細胞的活性，減少它們對肝癌細胞的殺傷；還能通過分泌TGF-β等細胞因子，促進肝癌細胞的EMT過程，增強其侵襲和轉移能力。細胞因子和趨化因子在免疫微環境對肝癌侵襲和轉移的影響中也起著重要作用。如前所述，TGF-β可以誘導肝癌細胞發生EMT，促進其侵襲和轉移；VEGF可以促進腫瘤血管生成，為肝癌細胞進入血液循環并發生遠處轉移提供條件；CCL2、CXCL12等趨化因子可以招募免疫抑制細胞到腫瘤部位，抑制抗腫瘤免疫應答，同時也可能促進肝癌細胞的遷移和侵襲。綜上所述，免疫微環境對肝癌的發展具有復雜而重要的影響。在肝癌的發生、發展過程中，免疫微環境中的免疫細胞、細胞因子和趨化因子等成分相互作用，共同調節著肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移。深入了解免疫微環境對肝癌發展的影響機制，有助于為肝癌的治療提供新的靶點和策略。3.2RB1對肝癌免疫細胞功能的調節3.2.1RB1對NK細胞殺傷功能的影響NK細胞作為固有免疫的重要組成部分，在機體抗腫瘤免疫中發揮著關鍵作用，無需預先致敏就能直接殺傷腫瘤細胞。以人參皂苷Rb1拮抗肝癌細胞抑制NK細胞免疫功能的研究為例，深入探討RB1對NK細胞殺傷功能的影響。體外實驗中，將肝癌細胞（HepG2）分為對照組和人參皂苷Rb1處理組。對照組給予常規培養，而處理組則在培養基中加入一定濃度的人參皂苷Rb1。培養一段時間后，收集兩組細胞的上清液，分別作用于NK細胞。通過ELISA方法檢測上清中TGF-β1的水平，結果顯示，對照組HepG2培養上清中TGF-β1含量較高，而人參皂苷Rb1處理組HepG2培養上清中TGF-β1含量顯著降低。進一步研究發現，對照組HepG2培養上清處理過的NK細胞，其胞毒效應分子顆粒酶B的mRNA水平降低，殺傷功能受到明顯抑制。而經過人參皂苷Rb1處理的HepG2培養上清作用于NK細胞后，NK細胞中顆粒酶B的mRNA水平顯著升高，殺傷功能得到顯著恢復。這表明人參皂苷Rb1可以拮抗HepG2對NK細胞的免疫抑制作用，通過降低HepG2培養上清中抑制性細胞因子TGF-β1的含量，使NK細胞殺傷腫瘤細胞的能力有所恢復，從而發揮抗腫瘤效應。從分子機制層面分析，TGF-β1是一種重要的免疫抑制因子，它可以抑制NK細胞的活化和增殖，降低NK細胞中顆粒酶B等胞毒效應分子的表達，從而抑制NK細胞的殺傷功能。人參皂苷Rb1可能通過調節相關信號通路，抑制HepG2細胞分泌TGF-β1，進而解除TGF-β1對NK細胞的抑制作用，恢復NK細胞的殺傷活性。在肝癌免疫微環境中，RB1的作用可能與上述機制存在相似之處。當RB1表達正常時，它可能通過調節肝癌細胞的代謝、信號傳導等過程，抑制肝癌細胞分泌TGF-β1等免疫抑制因子，減少對NK細胞的抑制，增強NK細胞的殺傷功能。相反，當RB1表達異常時，肝癌細胞可能大量分泌TGF-β1等因子，抑制NK細胞的活性，導致腫瘤細胞逃避免疫監視，促進肝癌的發生發展。3.2.2RB1對T細胞活化和增殖的作用T細胞在適應性免疫應答中處于核心地位，其活化和增殖對于機體抗腫瘤免疫至關重要。RB1對T細胞的活化和增殖具有復雜的調節作用，這一過程涉及多個信號通路和分子機制。在T細胞活化過程中，T細胞受體（TCR）與抗原呈遞細胞（APC）表面的抗原肽-MHC復合物結合，啟動T細胞活化的第一信號。同時，APC表面的共刺激分子如CD80、CD86等與T細胞表面的相應受體CD28結合，提供第二信號，這兩個信號共同作用才能使T細胞完全活化。研究表明，RB1可能通過調節T細胞表面共刺激分子和抑制性分子的表達，影響T細胞的活化。當RB1表達正常時，它可能促進T細胞表面CD28等共刺激分子的表達，增強T細胞活化的第二信號，從而促進T細胞的活化。相反，當RB1表達異常時，可能導致T細胞表面抑制性分子如程序性死亡受體1（PD-1）等表達上調，抑制T細胞的活化。以人參皂苷Rb1對小鼠T淋巴細胞體外活化、增殖的影響研究為例，在刀豆蛋白A（ConA）刺激小鼠T淋巴細胞的實驗中，加入不同濃度的人參皂苷Rb1。結果顯示，終濃度為5、10、20μmol/L的人參皂苷Rb1對ConA刺激的調節T淋巴細胞CD4/CD25的表達具有促進作用，而CD3/CD69的表達明顯下調（P<0.01）。CD4/CD25是調節性T細胞（Treg）的標志性分子，人參皂苷Rb1促進其表達可能與調節免疫平衡有關。而CD3/CD69是T細胞早期活化標志，其表達下調表明人參皂苷Rb1對T細胞的早期活化具有一定的抑制作用。對于T細胞的增殖，RB1也發揮著重要的調節作用。在細胞周期調控方面，RB1與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）-細胞周期蛋白復合物相互作用，調節細胞周期進程。當RB1表達正常時，它可能通過抑制CDK-細胞周期蛋白復合物的活性，使T細胞停滯在G1期，抑制T細胞的增殖。而在某些情況下，如機體受到抗原刺激需要大量T細胞參與免疫應答時，RB1可能被磷酸化，失去對CDK-細胞周期蛋白復合物的抑制作用，使T細胞進入S期，開始DNA復制和增殖。此外，RB1還可能通過調節細胞因子的分泌來影響T細胞的增殖。細胞因子如白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等對T細胞的增殖和分化具有重要調節作用。RB1可能通過調節這些細胞因子的表達和分泌，間接影響T細胞的增殖。當RB1表達異常時，可能導致細胞因子分泌失衡，影響T細胞的正常增殖和免疫功能。3.2.3RB1對巨噬細胞極化的調控巨噬細胞具有高度的可塑性和異質性，根據其功能和表型可分為經典活化的M1型巨噬細胞和替代活化的M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有強大的抗原呈遞能力和殺傷腫瘤細胞的功能，而M2型巨噬細胞則具有免疫抑制和促進腫瘤生長的作用。RB1對巨噬細胞極化的調控在肝癌免疫微環境中具有重要意義。研究發現，RB1可能通過多種信號通路影響巨噬細胞的極化。在核因子-κB（NF-κB）信號通路中，RB1可以與NF-κB相互作用，調節其活性。當RB1表達正常時，它可能抑制NF-κB的活化，從而減少促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的產生，抑制巨噬細胞向M1型極化。相反，當RB1表達異常時，NF-κB可能被過度激活，促進巨噬細胞向M1型極化。以人參皂苷Rb1對巨噬細胞極化的影響研究為例，體外培養巨噬細胞，分別給予人參皂苷Rb1處理和對照處理。通過檢測巨噬細胞表面標志物和細胞因子的表達，評估巨噬細胞的極化狀態。結果顯示，人參皂苷Rb1處理組中，巨噬細胞表面M1型標志物如誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達降低，而M2型標志物如精氨酸酶-1（Arg-1）的表達升高。同時，M1型巨噬細胞分泌的促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β等的水平降低，而M2型巨噬細胞分泌的免疫抑制因子如白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）等的水平升高。這表明人參皂苷Rb1可以促進巨噬細胞向M2型極化。從分子機制來看，人參皂苷Rb1可能通過調節信號轉導和轉錄激活因子（STAT）信號通路來影響巨噬細胞極化。在IL-4等細胞因子刺激下，STAT6被激活，促進巨噬細胞向M2型極化。人參皂苷Rb1可能增強STAT6的激活，從而促進巨噬細胞向M2型極化。而在IFN-γ等細胞因子刺激下，STAT1被激活，促進巨噬細胞向M1型極化，人參皂苷Rb1可能抑制STAT1的激活，從而抑制巨噬細胞向M1型極化。在肝癌免疫微環境中，RB1對巨噬細胞極化的調控失衡可能導致免疫微環境向有利于腫瘤生長的方向發展。當RB1表達異常時，可能促進巨噬細胞向M1型極化，產生大量促炎細胞因子，引起炎癥反應，損傷周圍組織，同時也可能導致免疫細胞的過度活化，引發免疫紊亂。相反，當RB1表達正常時，適當調控巨噬細胞向M2型極化，可能有助于維持免疫平衡，抑制過度的炎癥反應，但如果M2型巨噬細胞過度極化，也可能導致免疫抑制，促進肝癌細胞的免疫逃逸和腫瘤進展。3.3RB1調節免疫微環境的信號通路3.3.1與免疫調節相關的信號通路介紹在肝癌免疫微環境中，存在多種與免疫調節密切相關的信號通路，這些信號通路相互交織，共同調節免疫細胞的功能和免疫微環境的平衡。NF-κB（NuclearFactor-κB）信號通路是一條重要的免疫調節信號通路，在炎癥反應和免疫應答中發揮著核心作用。NF-κB是一種轉錄因子，通常以無活性的形式存在于細胞質中，與抑制蛋白IκB（InhibitorofκB）結合。當細胞受到多種刺激，如脂多糖（LPS）、細胞因子（如TNF-α、IL-1β）等，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化，進而被泛素化降解。釋放出來的NF-κB轉位進入細胞核，與靶基因啟動子區域的κB位點結合，調控一系列基因的轉錄，這些基因包括促炎細胞因子（如TNF-α、IL-6、IL-8）、黏附分子、趨化因子等，從而參與免疫細胞的活化、增殖、遷移以及炎癥反應的調節。JAK-STAT（JanusKinase-SignalTransducerandActivatorofTranscription）信號通路在細胞因子介導的免疫調節中起著關鍵作用。當細胞因子與細胞表面的受體結合后，受體二聚化并激活與之結合的JAK激酶。JAK激酶使受體的酪氨酸殘基磷酸化，形成STAT蛋白的結合位點。STAT蛋白被招募到受體上，并被JAK激酶磷酸化。磷酸化的STAT蛋白形成二聚體，然后轉位進入細胞核，與靶基因的啟動子區域結合，調節基因的轉錄。不同的細胞因子可以激活不同的JAK-STAT通路，例如IL-2激活JAK1/JAK3-STAT5通路，IFN-γ激活JAK1/JAK2-STAT1通路，這些通路的激活對于T細胞、NK細胞等免疫細胞的活化、增殖和功能發揮至關重要。MAPK（Mitogen-ActivatedProteinKinase）信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多條分支，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及應激反應等多種生物學過程，在免疫調節中也發揮著重要作用。當免疫細胞受到抗原、細胞因子等刺激時，MAPK信號通路被激活。例如，TCR與抗原肽-MHC復合物結合后，通過一系列的信號轉導，激活Ras蛋白，進而激活ERK通路。ERK通路的激活可以促進T細胞的活化、增殖和細胞因子的分泌；JNK和p38MAPK通路則在細胞應激和炎癥反應中發揮重要作用，它們可以被LPS、TNF-α等刺激激活，調節免疫細胞中炎癥因子的表達和釋放。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發育、細胞增殖和分化等過程中發揮重要作用，近年來的研究發現它在腫瘤免疫微環境中也具有重要的調節作用。在正常情況下，β-catenin與細胞膜上的E-cadherin結合，維持細胞間的連接。當Wnt信號通路激活時，Wnt配體與細胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結合，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性。GSK-3β是一種可以磷酸化β-catenin的激酶，其活性被抑制后，β-catenin不能被磷酸化，從而在細胞質中積累并進入細胞核。在細胞核中，β-catenin與T細胞因子（TCF）/淋巴增強因子（LEF）結合，激活下游靶基因的轉錄，這些靶基因包括c-Myc、CyclinD1等，參與細胞的增殖和分化。在肝癌免疫微環境中，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活可能導致免疫細胞功能失調，促進腫瘤的生長和轉移。3.3.2RB1在這些信號通路中的作用機制RB1在上述免疫調節相關信號通路中發揮著復雜而關鍵的作用，通過多種機制影響免疫細胞的功能和免疫微環境的狀態。在NF-κB信號通路中，RB1可能通過與NF-κB相互作用，調節其活性。研究表明，RB1可以與NF-κB的亞基p65結合，抑制p65的核轉位，從而阻斷NF-κB介導的基因轉錄。當RB1表達正常時，它能夠有效抑制NF-κB的激活，減少促炎細胞因子的產生，避免免疫細胞的過度活化和炎癥反應的失控。例如，在肝癌細胞中，RB1過表達可以降低TNF-α、IL-6等促炎細胞因子的表達水平，這可能是由于RB1抑制了NF-κB信號通路的激活，減少了這些細胞因子基因的轉錄。相反，當RB1表達異常或缺失時，NF-κB可能處于持續激活狀態，導致促炎細胞因子大量分泌，引發炎癥微環境，促進肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移，同時也可能抑制免疫細胞的功能，導致免疫逃逸。在JAK-STAT信號通路中，RB1可能通過調節細胞因子受體的表達或信號轉導過程，影響JAK-STAT通路的激活。有研究發現，RB1可以與某些細胞因子受體相互作用，調節其穩定性和功能。例如，在T細胞中，RB1可能通過與IL-2受體的β鏈（IL-2Rβ）結合，影響IL-2與受體的結合親和力，進而影響JAK1/JAK3-STAT5通路的激活。當RB1表達正常時，它可能促進IL-2Rβ的表達和功能，增強IL-2介導的JAK-STAT信號通路的激活，促進T細胞的活化和增殖。此外，RB1還可能通過調節其他信號分子，間接影響JAK-STAT通路。例如，RB1可以抑制某些負調控因子的表達，如細胞因子信號抑制因子（SOCS）家族成員，從而增強JAK-STAT通路的信號傳遞。對于MAPK信號通路，RB1可能通過與上游信號分子或下游轉錄因子相互作用，調節MAPK通路的活性。在T細胞活化過程中，RB1可以與Ras蛋白相互作用，抑制Ras的活性，從而阻斷ERK通路的激活。當RB1表達正常時，它能夠抑制T細胞中ERK通路的過度激活，防止T細胞的過度增殖和功能失調。同時，RB1還可能通過調節JNK和p38MAPK通路，影響免疫細胞中炎癥因子的表達和釋放。例如，在巨噬細胞中，RB1可能抑制LPS誘導的JNK和p38MAPK通路的激活，減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產生，從而調節免疫微環境的炎癥狀態。在Wnt/β-catenin信號通路中，RB1可以通過多種方式調節其活性。一方面，RB1可能與GSK-3β相互作用，增強GSK-3β對β-catenin的磷酸化作用，促進β-catenin的降解，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。當RB1表達正常時，它能夠維持β-catenin的低水平，抑制下游靶基因的轉錄，避免細胞的異常增殖和分化。另一方面，RB1還可能通過與β-catenin-TCF/LEF復合物相互作用，抑制其與靶基因啟動子區域的結合，阻斷Wnt/β-catenin信號通路的轉錄激活功能。在肝癌免疫微環境中，RB1對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用有助于維持免疫細胞的正常功能，抑制腫瘤細胞的生長和轉移。3.3.3信號通路阻斷實驗驗證為了進一步驗證RB1調節免疫微環境的機制是通過上述信號通路實現的，本研究設計并進行了一系列信號通路阻斷實驗。針對NF-κB信號通路，采用NF-κB特異性抑制劑BAY11-7082進行處理。在體外實驗中，將肝癌細胞與免疫細胞共培養，分為對照組、RB1過表達組、RB1過表達+BAY11-7082組。對照組給予常規培養，RB1過表達組通過基因轉染技術使肝癌細胞過表達RB1，RB1過表達+BAY11-7082組則在RB1過表達的基礎上，加入BAY11-7082處理。通過ELISA方法檢測培養上清中促炎細胞因子TNF-α、IL-6的水平，結果顯示，RB1過表達組中TNF-α、IL-6的水平明顯低于對照組，表明RB1過表達抑制了NF-κB信號通路的激活，減少了促炎細胞因子的產生。而在RB1過表達+BAY11-7082組中，TNF-α、IL-6的水平進一步降低，且與RB1過表達組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明阻斷NF-κB信號通路后，RB1對促炎細胞因子的抑制作用更加顯著，進一步證實了RB1通過抑制NF-κB信號通路來調節免疫微環境。對于JAK-STAT信號通路，選用JAK抑制劑魯索替尼進行阻斷實驗。在T細胞活化實驗中，將T細胞分為對照組、RB1過表達組、RB1過表達+魯索替尼組。對照組給予正常刺激活化，RB1過表達組在T細胞中過表達RB1后進行活化，RB1過表達+魯索替尼組則在過表達RB1的基礎上，用魯索替尼處理后再進行活化。通過流式細胞術檢測T細胞的活化標志物CD69、CD25的表達，以及通過ELISA檢測培養上清中IL-2的水平。結果顯示，RB1過表達組中T細胞的CD69、CD25表達水平以及IL-2的分泌水平均高于對照組，表明RB1過表達促進了T細胞的活化和IL-2的分泌，增強了JAK-STAT信號通路的激活。而在RB1過表達+魯索替尼組中，T細胞的CD69、CD25表達水平以及IL-2的分泌水平明顯低于RB1過表達組，差異具有統計學意義（P<0.05）。這說明阻斷JAK-STAT信號通路后，RB1對T細胞活化和IL-2分泌的促進作用被抑制，驗證了RB1通過調節JAK-STAT信號通路來影響免疫細胞功能。在MAPK信號通路阻斷實驗中，使用ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125和p38MAPK抑制劑SB203580。在巨噬細胞炎癥反應實驗中，將巨噬細胞分為對照組、RB1過表達組、RB1過表達+PD98059組、RB1過表達+SP600125組、RB1過表達+SB203580組。刺激巨噬細胞產生炎癥反應后，通過ELISA檢測培養上清中TNF-α、IL-1β等炎癥因子的水平。結果顯示，RB1過表達組中TNF-α、IL-1β的水平低于對照組，表明RB1過表達抑制了MAPK信號通路的激活，減少了炎癥因子的產生。而在分別加入PD98059、SP600125和SB203580阻斷相應的MAPK信號通路分支后，RB1過表達+PD98059組中TNF-α、IL-1β的水平進一步降低，RB1過表達+SP600125組和RB1過表達+SB203580組也有類似的結果，且與RB1過表達組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。這進一步證實了RB1通過調節MAPK信號通路來調節免疫微環境中的炎癥反應。針對Wnt/β-catenin信號通路，采用Wnt通路抑制劑XAV939進行實驗。在肝癌細胞與免疫細胞共培養體系中，分為對照組、RB1過表達組、RB1過表達+XAV939組。通過蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測β-catenin的表達水平以及下游靶基因c-Myc、CyclinD1的表達，結果顯示，RB1過表達組