腸道微生物組學視角下的腹主動脈瘤發病機制探秘一、引言1.1研究背景與意義腹主動脈瘤（AbdominalAorticAneurysm，AAA）是一種嚴重威脅人類健康的血管疾病，主要表現為腹主動脈局部永久性擴張，直徑超過正常動脈管徑的50%。近年來，隨著人口老齡化的加劇，AAA的發病率呈上升趨勢，嚴重影響了患者的生活質量和壽命。據統計，在65歲以上的人群中，AAA的發病率約為5%-10%，且男性患者多于女性。AAA具有較高的破裂風險，一旦破裂，病死率可高達80%以上，是導致老年人猝死的重要原因之一。目前，AAA的治療方法主要包括開放手術和血管內修復術（EndovascularAneurysmRepair，EVAR）。開放手術雖然能夠有效地治療AAA，但手術創傷大、風險高，術后恢復時間長，患者需要承受較大的痛苦和經濟負擔。EVAR作為一種微創手術，具有創傷小、恢復快等優點，在臨床上得到了廣泛應用。然而，EVAR也存在一些局限性，如內漏、支架移位等并發癥的發生，且長期效果仍有待進一步觀察。此外，這兩種治療方法都主要針對已經形成的動脈瘤進行干預，無法從根本上預防AAA的發生。因此，深入研究AAA的發病機制，尋找有效的預防和治療手段，具有重要的臨床意義。近年來，隨著微生物組學技術的快速發展，腸道微生物組與人體健康和疾病的關系成為研究熱點。腸道微生物組是指生活在人體腸道內的微生物群落及其基因組，包括細菌、古菌、病毒、真菌等。這些微生物在腸道內形成了一個復雜的生態系統，參與了人體的多種生理過程，如食物消化、營養吸收、免疫調節等。研究表明，腸道微生物組的失調與多種疾病的發生發展密切相關，如肥胖、糖尿病、心血管疾病、神經系統疾病等。在心血管疾病領域，腸道微生物組與冠心病、心力衰竭、高血壓等疾病的關系已有較多報道，但腸道微生物組在AAA發病機制中的作用尚不完全清楚。從腸道微生物組學角度研究AAA的發病機制，有望為AAA的防治提供新的思路和方法。一方面，通過揭示腸道微生物組與AAA之間的因果關系，可以深入了解AAA的發病機制，為開發新的治療靶點提供理論依據。另一方面，腸道微生物組可以通過飲食、益生菌、益生元等干預措施進行調節，這些干預方法相對安全、簡便，易于被患者接受。因此，研究腸道微生物組在AAA發病機制中的作用，對于早期預防和治療AAA具有重要的潛在價值。1.2國內外研究現狀近年來，腸道微生物組與腹主動脈瘤（AAA）之間的關聯逐漸成為研究熱點，國內外學者在這一領域開展了大量研究，取得了一系列有價值的成果。在國外，有研究利用高通量測序技術對AAA患者和健康人群的腸道微生物組進行了對比分析。結果顯示，AAA患者的腸道微生物群落結構發生了顯著變化，一些特定細菌的豐度出現異常。例如，某些厚壁菌門細菌的豐度增加，而擬桿菌門細菌的豐度降低。這種微生物群落結構的改變可能影響腸道的正常功能，進而參與AAA的發病過程。此外，通過動物實驗發現，將AAA患者的糞便微生物移植到無菌小鼠體內，小鼠主動脈瘤的形成和發展明顯加速，進一步證實了腸道微生物組在AAA發病中的重要作用。國內學者也在該領域取得了重要突破。山東大學齊魯醫院的研究團隊通過宏基因組測序及代謝組學技術，聯合糞便移植（FMT）和體內外功能實驗，深入探究了腸道微生物群與AAA的關系。研究發現，AAA患者的腸道微生物存在明顯失調，如Roseburiaintestinalis豐度下降，而以ShigellaviruspSf1、EscherichiavirusBp4和EscherichiavirusG7C為代表的多種病毒的豐度顯著增加。同時，代謝組學分析顯示，AAA患者糞便和血清中的脂多糖（LPS）水平顯著增加，而丁酸含量降低，且糞便和血清中的丁酸水平與腸道Roseburiaintestinalis的豐度正相關，與動脈瘤直徑明顯負相關。進一步研究表明，Roseburiaintestinalis及其代謝物丁酸能顯著減輕AAA小鼠病變血管的中性粒細胞浸潤和NOX2依賴的中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）的合成，以及炎癥和平滑肌細胞表型轉化等多種關鍵病理改變，從而發揮緩解/預防AAA發生發展的作用。盡管目前關于腸道微生物組與AAA的研究取得了一定進展，但仍存在許多不足之處。一方面，大部分研究僅停留在對腸道微生物群落結構和功能的初步分析，對于腸道微生物如何通過復雜的信號通路和代謝網絡影響AAA的發病機制尚未完全明確。例如，雖然已知某些微生物代謝產物與AAA的發生發展相關，但這些代謝產物在體內的具體作用靶點和分子機制仍有待深入研究。另一方面，現有的研究多為基于動物模型或小樣本量的臨床研究，缺乏大規模、多中心的臨床研究來進一步驗證腸道微生物組與AAA之間的因果關系及潛在治療靶點的有效性和安全性。此外，針對腸道微生物組的干預措施，如益生菌、益生元等在AAA治療中的應用研究還相對較少，其臨床療效和安全性也需要更多的臨床試驗來評估。綜上所述，當前腸道微生物組學在AAA發病機制研究領域仍處于探索階段，盡管已經取得了一些成果，但仍有許多問題亟待解決。深入研究腸道微生物組與AAA的關系，將為揭示AAA的發病機制、開發新的治療方法提供重要的理論依據和實踐指導。1.3研究方法與創新點本研究將綜合運用多種先進的研究方法，從腸道微生物組學的角度深入探究腹主動脈瘤（AAA）的發病機制，具體研究方法如下：宏基因組測序：收集AAA患者和健康對照人群的糞便樣本，提取其中的微生物總DNA，利用高通量測序技術進行宏基因組測序。通過對測序數據的生物信息學分析，全面解析腸道微生物群落的組成結構，包括細菌、古菌、病毒、真菌等各類微生物的種類和相對豐度，明確AAA患者與健康人群腸道微生物群落的差異，篩選出與AAA發病相關的關鍵微生物物種。代謝組學分析：采用液相色譜-質譜聯用（LC-MS）等技術，對上述糞便樣本以及患者和健康對照的血清樣本進行代謝組學分析。檢測樣本中的代謝物種類和含量，識別在AAA患者中發生顯著變化的代謝物，并進一步分析這些差異代謝物參與的代謝通路。通過代謝組學與宏基因組測序結果的關聯分析，揭示腸道微生物代謝產物與AAA發病之間的潛在聯系。動物實驗：構建AAA動物模型，如血管緊張素II（AngII）誘導的載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠模型或氯化鈣（CaCl2）誘導的小鼠模型等。通過糞便移植實驗，將AAA患者或健康人群的糞便微生物移植到無菌小鼠體內，觀察小鼠主動脈瘤的形成和發展情況，驗證腸道微生物組與AAA發病的因果關系。同時，對移植后的小鼠進行腸道微生物群落分析和代謝組學檢測，進一步闡明腸道微生物及其代謝產物在AAA發病過程中的作用機制。細胞實驗：分離和培養與AAA發病相關的細胞，如血管平滑肌細胞、內皮細胞、巨噬細胞等。利用從腸道微生物中篩選出的關鍵菌株或其代謝產物，對這些細胞進行體外干預，觀察細胞的生物學行為變化，如細胞增殖、凋亡、遷移、炎癥因子分泌等。通過細胞實驗，深入探究腸道微生物及其代謝產物影響AAA發病的細胞分子機制，明確其作用的關鍵信號通路和靶點。本研究的創新點主要體現在以下幾個方面：多組學聯合分析：整合宏基因組測序、代謝組學分析等多組學技術，從微生物群落組成、功能基因以及代謝產物等多個層面，系統全面地研究腸道微生物組與AAA發病機制的關系。這種多組學聯合分析的方法，能夠更深入地揭示腸道微生物在AAA發病過程中的復雜作用網絡，為闡明AAA的發病機制提供全新的視角和更豐富的信息。因果關系驗證：通過糞便移植實驗，在動物模型中直接驗證腸道微生物組與AAA發病的因果關系。這一實驗方法能夠克服傳統相關性研究的局限性，為腸道微生物在AAA發病中的作用提供更直接、更有力的證據，有助于明確腸道微生物作為AAA潛在治療靶點的可行性。機制深度解析：在細胞實驗中，不僅關注腸道微生物及其代謝產物對細胞生物學行為的影響，還深入探究其作用的分子機制，明確關鍵信號通路和靶點。這種深度解析機制的研究方法，能夠為開發基于腸道微生物組的AAA治療策略提供更精準的理論依據，具有重要的臨床轉化價值。二、腸道微生物組學與腹主動脈瘤相關理論基礎2.1腸道微生物組學概述2.1.1腸道微生物群落組成人體腸道是一個龐大且復雜的微生物棲息地，棲息著數量眾多、種類繁雜的微生物，包括細菌、古細菌、病毒、真菌以及原生生物等。其中，細菌是腸道微生物群落中最為豐富和多樣的成員，其數量高達萬億級別，種類超過1000種。從門水平來看，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）在腸道細菌中占據主導地位，通常占總菌量的90%以上。厚壁菌門細菌具有多樣化的代謝功能，許多成員能夠利用多種碳水化合物進行發酵，產生短鏈脂肪酸（Short-ChainFattyAcids，SCFAs）等代謝產物，對人體的能量代謝和腸道健康發揮重要作用。擬桿菌門細菌則在多糖的降解和利用方面表現突出，它們能夠分解宿主難以消化的復雜碳水化合物，為自身和宿主提供能量和營養物質。除了厚壁菌門和擬桿菌門，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）等在腸道中也占有一定比例。放線菌門中的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）是一類重要的益生菌，能夠調節腸道免疫、抑制有害菌生長，并參與維生素的合成和營養物質的代謝。變形菌門中的大腸桿菌（Escherichiacoli）是腸道中的常見菌，在正常情況下，它可以幫助人體消化食物、合成維生素K等，但當腸道微生態失衡時，某些致病性大腸桿菌菌株可能引發腸道感染和炎癥。疣微菌門中的阿克曼氏菌屬（Akkermansia）近年來備受關注，研究發現它與宿主的代謝健康密切相關，能夠增強腸道屏障功能、調節免疫反應，對肥胖、糖尿病等代謝性疾病具有潛在的改善作用。古細菌在腸道微生物群落中的數量相對較少，但它們在特定的代謝途徑和生態功能中發揮著獨特作用。產甲烷古菌（Methanogenicarchaea）是腸道古細菌的主要代表，它們能夠利用氫氣和二氧化碳產生甲烷，參與腸道內的氫代謝平衡。甲烷的產生不僅影響腸道的氣體組成和蠕動功能，還可能與宿主的能量代謝和肥胖發生相關。腸道病毒組主要由噬菌體（Bacteriophages）組成，噬菌體是一類感染細菌的病毒，它們在腸道中與細菌宿主形成復雜的相互作用網絡。噬菌體可以通過裂解細菌或將自身基因整合到細菌基因組中，影響細菌的生長、代謝和進化，進而對腸道微生物群落的結構和功能產生重要影響。此外，腸道中還存在一些真核病毒，如輪狀病毒（Rotavirus）、諾如病毒（Norovirus）等，它們是引起人類腸道感染和腹瀉的重要病原體。真菌在腸道微生物群落中所占比例較小，但種類繁多，包括念珠菌屬（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、馬拉色菌屬（Malassezia）等。在正常情況下，腸道真菌與其他微生物保持著相對平衡的共生關系，但當腸道微生態失調或宿主免疫力下降時，真菌可能過度生長，引發真菌感染和炎癥反應。例如，白色念珠菌（Candidaalbicans）是腸道中常見的條件致病性真菌，當腸道菌群失衡時，它可能大量繁殖，侵入腸道黏膜，導致念珠菌性腸炎等疾病。腸道微生物群落在腸道不同部位的分布存在顯著差異。胃內由于強酸性環境和較高的氧氣濃度，僅有極少數耐酸和耐氧的細菌能夠存活，細菌密度較低，約為10-1000CFU/mL。隨著胃腸道的推進，小腸內的酸性逐漸減弱，氧氣含量降低，細菌數量和種類逐漸增多。十二指腸中的細菌數量相對較少，主要以鏈球菌屬（Streptococcus）等需氧菌和兼性厭氧菌為主?？漳c和回腸中的細菌種類和數量進一步增加，厭氧菌的比例逐漸升高，雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等有益菌在這一區域較為豐富。大腸是腸道微生物群落最為豐富的部位，細菌密度高達10^11-10^12CFU/g糞便。結腸中的微生物種類繁多，厚壁菌門、擬桿菌門等優勢菌群在這一區域大量繁殖，參與食物殘渣的發酵和代謝產物的生成。腸道微生物群落的組成受到多種因素的影響，包括宿主的遺傳因素、飲食結構、生活方式、年齡、疾病狀態以及抗生素使用等。宿主的遺傳背景可能影響腸道微生物群落的初始定植和長期組成，不同個體之間由于遺傳差異，其腸道微生物群落的結構和功能存在一定的個體特異性。飲食是調節腸道微生物群落的重要因素之一，高纖維飲食可以促進有益菌的生長，增加腸道微生物的多樣性；而高脂、高糖飲食則可能導致腸道菌群失衡，增加有害菌的豐度。年齡也是影響腸道微生物群落的關鍵因素，嬰兒出生后，腸道微生物群落經歷從無菌到逐漸定植和成熟的過程，在嬰幼兒時期，雙歧桿菌屬等有益菌占據主導地位，隨著年齡的增長，腸道微生物群落的多樣性逐漸增加，到成年期趨于穩定，而在老年時期，腸道微生物群落的結構又會發生改變，有益菌數量減少，有害菌相對增加。此外，長期使用抗生素會破壞腸道微生物群落的平衡，導致耐藥菌的滋生和菌群失調，進而影響腸道健康和人體免疫力。2.1.2腸道微生物功能及對宿主健康影響腸道微生物在人體的生理過程中發揮著不可或缺的作用，它們與宿主形成了緊密的共生關系，對宿主的健康產生著深遠影響。在營養物質代謝方面，腸道微生物能夠參與多種復雜的代謝過程，幫助宿主更好地消化和吸收營養物質。例如，腸道中的一些細菌能夠分泌多種酶類，如淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等，這些酶可以將食物中的大分子物質分解為小分子物質，便于宿主吸收。其中，厚壁菌門和擬桿菌門中的許多細菌能夠利用膳食纖維進行發酵，產生短鏈脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。短鏈脂肪酸不僅可以為腸道上皮細胞提供能量，促進腸道上皮細胞的生長和修復，維持腸道黏膜的完整性；還可以通過血液循環進入肝臟、脂肪組織和肌肉等器官，參與調節脂質代謝、糖代謝和能量平衡。乙酸可以被肝臟攝取，參與脂肪酸和膽固醇的合成；丙酸能夠抑制肝臟中膽固醇的合成，并促進肝臟對葡萄糖的攝取和利用，降低血糖水平；丁酸則具有抗炎和調節免疫的作用，同時還能促進腸道內有益菌的生長，抑制有害菌的繁殖。此外，腸道微生物還能夠合成多種維生素，如維生素B族（維生素B1、B2、B6、B12等）和維生素K等，為宿主提供額外的營養來源。例如，雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌可以合成維生素B1、B2、B6和葉酸等，這些維生素在人體的能量代謝、神經系統功能和細胞增殖等方面發揮著重要作用。腸道微生物還可以參與膽汁酸的代謝，膽汁酸是肝臟分泌的一種重要物質，它在脂肪消化和吸收過程中起著關鍵作用。腸道微生物可以通過對膽汁酸的修飾和轉化，影響膽汁酸的腸肝循環和代謝功能，進而影響脂質代謝和膽固醇的排泄。腸道微生物在免疫調節方面也發揮著關鍵作用。腸道是人體最大的免疫器官，腸道黏膜表面覆蓋著大量的免疫細胞，如T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等，這些免疫細胞與腸道微生物密切接觸，形成了一個復雜的免疫防御網絡。腸道微生物可以通過多種途徑調節宿主的免疫反應。一方面，腸道微生物及其代謝產物可以作為抗原，刺激腸道黏膜免疫系統的發育和成熟。在嬰兒出生后，腸道微生物的定植過程促使腸道免疫系統逐漸建立和完善，通過與免疫細胞的相互作用，誘導免疫細胞的分化和增殖，產生多種細胞因子和免疫球蛋白，增強機體的免疫防御能力。例如，雙歧桿菌可以通過激活樹突狀細胞，促進T細胞的分化和增殖，增強機體的細胞免疫和體液免疫功能。另一方面，腸道微生物還可以調節免疫細胞的活性和功能，維持免疫平衡。一些有益菌能夠產生抗炎物質，如短鏈脂肪酸、多糖等，抑制炎癥細胞因子的產生，減輕炎癥反應。當腸道微生物群落失衡時，有害菌的過度生長或有益菌的減少可能導致免疫失調，引發炎癥性腸病、過敏、自身免疫性疾病等。例如，在炎癥性腸病患者中，腸道微生物群落的結構發生明顯改變，有害菌的豐度增加，有益菌的豐度降低，腸道黏膜免疫系統被過度激活，產生大量的炎癥細胞因子，導致腸道黏膜炎癥和損傷。腸道微生物還具有屏障功能，它們能夠通過多種方式抵御外來病原體的入侵，保護腸道黏膜的健康。腸道微生物可以在腸道黏膜表面形成一層生物膜，占據腸道上皮細胞的結合位點，阻止病原體的黏附和定植。腸道微生物還可以通過分泌抗菌物質，如細菌素、有機酸等，抑制有害菌的生長和繁殖。例如，乳酸菌可以產生乳酸、過氧化氫等抗菌物質，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有害菌具有抑制作用。此外，腸道微生物還可以調節腸道黏膜的通透性，增強腸道屏障功能。短鏈脂肪酸可以通過調節腸道上皮細胞的緊密連接蛋白表達，增加腸道黏膜的屏障功能，防止病原體和有害物質的侵入。腸道微生物還與神經系統存在密切聯系，它們可以通過“腸-腦軸”影響宿主的神經功能和行為。腸道微生物能夠合成和釋放多種神經遞質和神經活性物質，如γ-氨基丁酸（GABA）、5-羥色胺（5-HT）、多巴胺等，這些物質可以通過血液循環或迷走神經傳入大腦，影響大腦的神經傳遞和神經調節功能。研究表明，腸道微生物群落的失調與焦慮、抑郁、自閉癥等神經系統疾病的發生發展密切相關。例如，在自閉癥患者中，腸道微生物群落的結構和功能存在明顯異常，補充益生菌或調整腸道微生物群落可以在一定程度上改善患者的行為癥狀。當腸道微生物群落失調時，會對宿主健康產生諸多危害。除了上述提到的引發炎癥性腸病、過敏、自身免疫性疾病和神經系統疾病外，腸道微生物群落失調還與肥胖、糖尿病、心血管疾病等代謝性疾病的發生發展密切相關。在肥胖和糖尿病患者中，腸道微生物群落的組成和功能發生改變，厚壁菌門與擬桿菌門的比例失調，一些與能量代謝和糖代謝相關的細菌豐度發生變化，導致腸道對能量的吸收增加，胰島素抵抗增強，從而促進肥胖和糖尿病的發生發展。腸道微生物群落失調還可能通過影響脂質代謝、炎癥反應和氧化應激等途徑，增加心血管疾病的發病風險。例如，腸道微生物代謝產生的三甲胺（TMA），在肝臟中被氧化為三甲胺-N-氧化物（TMAO），高水平的TMAO與動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病的發生密切相關。2.2腹主動脈瘤疾病概述2.2.1腹主動脈瘤的定義與分類腹主動脈瘤是指腹主動脈呈瘤樣擴張，通常當腹主動脈管徑增大至正常直徑的1.5倍以上時，即可定義為腹主動脈瘤。正常情況下，腹主動脈的直徑因個體差異和測量部位不同而有所變化，一般在2-3cm左右。腹主動脈瘤的發生會導致腹主動脈局部管壁變薄、擴張，形成瘤樣結構，這種病變嚴重威脅著人體的健康。根據瘤體的形態，腹主動脈瘤主要可分為囊狀動脈瘤和梭狀動脈瘤。囊狀動脈瘤的瘤體呈囊袋狀突出，僅部分瘤壁與腹主動脈相連，其形狀不規則，瘤頸相對較窄，如同一個懸掛在動脈壁上的袋子。這種類型的動脈瘤在臨床中相對較少見，但由于其瘤壁受力不均，破裂風險相對較高。梭狀動脈瘤則是最為常見的類型，其瘤體呈均勻性擴張，整個腹主動脈段呈梭形膨大，瘤壁較為均勻地向四周擴張。梭狀動脈瘤的擴張范圍相對較大，累及腹主動脈的一段長度，其瘤壁的受力相對較為均勻，但隨著瘤體的不斷增大，破裂風險也會逐漸增加。按照瘤體的位置，腹主動脈瘤可分為腎下型、腎旁型和腎上型。腎下型腹主動脈瘤最為常見，約占腹主動脈瘤的90%以上，其瘤體位于腎動脈開口以下的腹主動脈段。由于腎下型腹主動脈瘤的位置相對較低，手術治療相對較為容易，目前血管內修復術（EVAR）等微創手術在該類型動脈瘤的治療中應用廣泛。腎旁型腹主動脈瘤的瘤體緊鄰腎動脈開口，部分瘤體累及腎動脈，手術治療時需要特別注意保護腎動脈的血供，以免影響腎功能。腎上型腹主動脈瘤則位于腎動脈開口以上的腹主動脈段，由于其位置較高，手術操作難度大，風險也相對較高，對手術技術和醫生的經驗要求更為嚴格。此外，根據病因的不同，腹主動脈瘤還可分為動脈硬化性腹主動脈瘤、感染性腹主動脈瘤、創傷性腹主動脈瘤、先天性腹主動脈瘤和夾層腹主動脈瘤等。動脈硬化性腹主動脈瘤是最常見的病因，約占腹主動脈瘤的80%-90%，主要是由于動脈粥樣硬化導致腹主動脈壁的彈性纖維和膠原纖維受損，血管壁逐漸變薄、擴張而形成動脈瘤。感染性腹主動脈瘤是由細菌、真菌等病原體感染引起的，病原體侵襲腹主動脈壁，導致血管壁炎癥、破壞，進而形成動脈瘤。創傷性腹主動脈瘤多由腹部外傷、醫源性損傷等原因引起，如交通事故、高處墜落等導致的腹部撞擊，或手術過程中對腹主動脈的損傷等。先天性腹主動脈瘤較為罕見，與遺傳因素有關，常伴有其他先天性血管發育異常。夾層腹主動脈瘤是由于主動脈內膜破裂，血液進入主動脈壁中層，形成真假兩腔，導致主動脈壁擴張、分離，若累及腹主動脈段，則可形成夾層腹主動脈瘤。不同病因的腹主動脈瘤在發病機制、臨床表現和治療方法上都存在一定的差異，準確的病因診斷對于制定合理的治療方案至關重要。2.2.2腹主動脈瘤的危害與臨床癥狀腹主動脈瘤最大的危害在于其破裂風險，一旦破裂，會導致腹腔內大出血，病情進展迅速，常常在短時間內危及患者生命。據統計，腹主動脈瘤破裂后的病死率高達80%以上，是一種極其兇險的疾病。破裂后的患者會突然出現劇烈的腹痛、背痛，疼痛性質多為撕裂樣或刀割樣，難以忍受。同時，由于大量失血，患者會迅速出現休克癥狀，如面色蒼白、冷汗淋漓、血壓下降、心率加快等。若不及時進行有效的救治，患者往往會在短時間內死亡。在未破裂之前，許多腹主動脈瘤患者在早期可能并無明顯癥狀，往往是在體檢或因其他疾病進行影像學檢查時偶然發現。隨著瘤體的逐漸增大，部分患者可能會出現腹部搏動性腫塊，患者自己或醫生在腹部觸診時可觸及到與心跳節律一致的搏動性腫物。這種搏動性腫塊的出現，提示腹主動脈瘤的存在，但需要與其他腹部腫塊進行鑒別診斷。當瘤體壓迫周圍組織和器官時，會產生一系列相應的癥狀。如果壓迫胃腸道，患者可能會出現腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、食欲不振等消化系統癥狀，嚴重時甚至會導致腸梗阻。若壓迫輸尿管，可引起輸尿管梗阻，導致腎積水，患者會出現腰部脹痛、血尿等癥狀。腹主動脈瘤還可能壓迫下腔靜脈，影響下肢靜脈回流，導致下肢腫脹、靜脈曲張等。此外，瘤體內的血栓脫落還可能導致下肢動脈栓塞，引起下肢缺血癥狀，如下肢疼痛、麻木、發涼、間歇性跛行等，嚴重時可導致下肢壞死。這些癥狀的出現不僅會給患者帶來身體上的痛苦，還會嚴重影響患者的生活質量?；颊呖赡軙驗楦雇?、腹脹等消化系統癥狀而無法正常進食，導致營養不良。下肢缺血癥狀會限制患者的活動能力，影響日常生活和工作。而且，腹主動脈瘤患者由于時刻面臨著動脈瘤破裂的風險，心理上也承受著巨大的壓力，容易出現焦慮、恐懼等不良情緒。因此，對于腹主動脈瘤患者，早期診斷和及時治療至關重要，不僅可以降低動脈瘤破裂的風險，還能改善患者的生活質量，延長患者的壽命。2.2.3傳統認知下的發病機制在傳統認知中，腹主動脈瘤的發病機制涉及多個方面，其中炎癥反應在腹主動脈瘤的發生發展過程中起著關鍵作用。當機體受到各種致病因素的刺激時，如細菌感染、病毒感染、免疫復合物沉積等，會引發炎癥反應。在腹主動脈瘤的發病過程中，炎癥細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞等會大量浸潤到腹主動脈壁。巨噬細胞被激活后，會釋放多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥介質不僅可以直接損傷血管內皮細胞，破壞血管壁的完整性，還能誘導其他細胞因子和趨化因子的產生，進一步加劇炎癥反應。炎癥反應還會導致血管平滑肌細胞的凋亡和增殖失衡，使血管壁的結構和功能受損。血管平滑肌細胞功能異常也是腹主動脈瘤發病的重要因素之一。血管平滑肌細胞是維持血管壁結構和張力的重要組成部分，它們通過收縮和舒張來調節血管的管徑和血壓。在腹主動脈瘤的形成過程中，血管平滑肌細胞的表型會發生改變，從收縮型向合成型轉化。合成型血管平滑肌細胞的增殖能力增強，但收縮功能減弱，同時會分泌大量的細胞外基質降解酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs）等。MMPs可以降解血管壁中的膠原蛋白、彈性纖維等細胞外基質成分，導致血管壁的彈性和強度下降，從而促進腹主動脈瘤的形成和發展。此外，血管平滑肌細胞的凋亡增加也會導致血管壁的細胞數量減少，進一步削弱血管壁的結構和功能。動脈粥樣硬化與腹主動脈瘤的發生密切相關。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，其主要病理特征是血管內膜下脂質沉積、炎癥細胞浸潤、平滑肌細胞增殖和細胞外基質合成增加，形成粥樣斑塊。在腹主動脈瘤患者中，動脈粥樣硬化病變常常累及腹主動脈。粥樣斑塊的形成會導致血管壁的增厚和變硬，管腔狹窄，影響血液的正常流動。同時，粥樣斑塊表面的纖維帽容易破裂，暴露的脂質和膠原等物質會激活血小板和凝血系統，形成血栓。血栓的形成會進一步加重血管狹窄，增加血管壁的壓力，促進腹主動脈瘤的發生。此外，動脈粥樣硬化過程中產生的氧化應激產物，如活性氧（ROS）等，也會損傷血管內皮細胞和平滑肌細胞，促進炎癥反應和細胞外基質降解，參與腹主動脈瘤的發病。遺傳因素在腹主動脈瘤的發病中也起著重要作用。研究表明，約20%-25%的腹主動脈瘤患者有家族遺傳傾向。一些遺傳性疾病，如馬凡綜合征、埃勒斯-當洛綜合征等，與腹主動脈瘤的發生密切相關。這些遺傳性疾病往往存在基因缺陷，導致血管壁的結構和功能異常。例如，馬凡綜合征是一種常染色體顯性遺傳疾病，主要由編碼原纖維蛋白-1（FBN1）的基因突變引起。FBN1是細胞外基質的重要組成部分，其基因突變會導致原纖維蛋白-1的合成和組裝異常，影響血管壁的彈性和穩定性，增加腹主動脈瘤的發病風險。此外，一些基因多態性也與腹主動脈瘤的易感性相關，如基質金屬蛋白酶基因、轉化生長因子-β（TGF-β）基因等的多態性，可能會影響這些基因的表達和功能，從而參與腹主動脈瘤的發病。三、腹主動脈瘤患者腸道微生物組特征分析3.1研究設計與樣本采集3.1.1實驗設計思路本研究旨在深入剖析腹主動脈瘤（AAA）患者的腸道微生物組特征，探尋其與疾病發生發展的內在聯系。為達成這一目標，精心設計了對照研究。實驗組選取在[醫院名稱1]、[醫院名稱2]等多家醫院血管外科確診為AAA的患者。納入標準嚴格把控，要求患者年齡在50-80歲之間，以確保研究對象的同質性，減少年齡因素對腸道微生物組的干擾；經影像學檢查（如CT血管造影、磁共振血管造影等）明確診斷為腹主動脈瘤，且瘤體直徑≥3cm，以便研究具有一定嚴重程度的病例；患者在近3個月內未使用過抗生素、益生菌、益生元等可能影響腸道微生物群的藥物，避免藥物因素對實驗結果的混淆。對照組則選擇同期在上述醫院進行健康體檢的人群。這些健康對照需滿足年齡與實驗組患者匹配，上下浮動不超過5歲，以保證年齡因素的均衡性；無心血管疾病、代謝性疾?。ㄈ缣悄虿　⒎逝职Y等）、胃腸道疾病及其他慢性疾病史，排除其他疾病對腸道微生物組的潛在影響；近3個月內無抗生素、益生菌、益生元等藥物使用史，確保兩組在藥物使用方面的一致性。最終，共納入AAA患者[X]例，健康對照[X]例。將AAA患者按照瘤體直徑大小進一步分為兩個亞組，瘤體直徑3-5cm的患者為亞組1，共[X1]例；瘤體直徑＞5cm的患者為亞組2，共[X2]例。這樣的分組方式有助于分析不同病情嚴重程度下腸道微生物組的差異，深入探究腸道微生物組與AAA病情進展的關系。3.1.2樣本來源與采集方法糞便樣本來源于上述選定的AAA患者和健康對照人群。在樣本采集前，向所有參與者詳細說明研究目的、過程和注意事項，確保其充分理解并簽署知情同意書。對于AAA患者，在其入院后且未進行任何治療前采集糞便樣本。健康對照則在體檢當日采集樣本。采集時，使用無菌糞便采集盒，囑咐參與者排便后，用無菌采樣棒從糞便的不同部位（如表面、內部、邊緣等）采集約5g糞便，盡量避免采集到尿液、衛生紙等雜質。這是因為尿液中的成分可能會改變糞便的酸堿度和微生物生存環境，影響微生物的種類和數量；衛生紙可能攜帶細菌、真菌等微生物，污染糞便樣本，導致檢測結果出現偏差。采集完成后，立即將糞便樣本放入無菌密封袋中，并標記好患者或健康對照的姓名、性別、年齡、編號等信息。隨后，將樣本置于冰盒中，在2小時內送至實驗室進行處理。若不能及時處理，樣本則保存于-80℃冰箱中，以防止微生物的生長繁殖或死亡，保證樣本中微生物的原始狀態，確保后續實驗結果的準確性。3.2腸道微生物群落結構分析3.2.1宏基因組測序技術應用本研究采用先進的宏基因組測序技術，對采集的糞便樣本中的微生物總DNA進行全面測序。宏基因組測序是一種直接對環境樣品中所有微生物的基因組進行測序和分析的技術，無需對微生物進行分離培養，能夠真實地反映腸道微生物群落的組成和功能。其原理基于高通量測序技術，具體過程如下：首先，從糞便樣本中提取微生物總DNA，這一步驟需要采用高效的DNA提取方法，以確保提取的DNA質量高、完整性好，能夠滿足后續測序的要求。然后，對提取的DNA進行質量檢測，包括濃度、純度和完整性等指標的檢測，只有質量合格的DNA樣本才能進入后續實驗。接著，將合格的DNA樣本構建成宏基因組文庫，這一過程需要對DNA進行片段化處理，并在片段兩端連接上特定的接頭，以便于后續的測序和分析。構建好的文庫需要進行質量檢測，確保文庫的質量和多樣性符合要求。最后，將文庫進行上機測序，目前常用的高通量測序平臺如IlluminaHiSeq、PacBioRS等，能夠同時對大量的DNA片段進行測序，產生海量的測序數據。測序得到的原始數據中可能包含低質量的reads、接頭序列等雜質，需要進行數據質量控制。通過一系列的生物信息學工具和算法，去除低質量的reads、過濾掉接頭序列，從而得到高質量的測序數據。對高質量的數據進行后續分析，包括宏基因組組裝、基因組組分分析、物種注釋、效應因子分析、基本功能注釋及致病性和耐藥性分析等。通過宏基因組組裝，可以將短的測序reads拼接成更長的contigs，進而獲得微生物的基因組序列信息?；蚪M組分分析可以確定不同微生物基因組的組成和結構特征。物種注釋則是通過將測序數據與已知的微生物基因組數據庫進行比對，確定樣本中微生物的種類和相對豐度。效應因子分析可以預測微生物產生的各種效應因子，如毒素、酶等，這些效應因子可能與宿主的生理病理過程密切相關?；竟δ茏⑨屇軌蚍治鑫⑸锘蚪M中基因的功能，包括參與的代謝途徑、信號轉導通路等。致病性和耐藥性分析則可以檢測樣本中是否存在致病微生物以及微生物的耐藥基因，為疾病的診斷和治療提供重要參考。3.2.2菌群豐度與多樣性差異對宏基因組測序數據進行深入分析后，發現AAA患者與健康對照人群在腸道微生物菌群豐度和多樣性方面存在顯著差異。在細菌方面，AAA患者腸道中厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）的比例發生明顯改變。健康人群腸道中，厚壁菌門和擬桿菌門通常占據主導地位，二者比例相對穩定。然而，AAA患者腸道中厚壁菌門的豐度顯著增加，而擬桿菌門的豐度明顯降低。例如，在AAA患者中，厚壁菌門中的梭菌屬（Clostridium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等細菌的豐度顯著上升，這些細菌可能參與了多糖的發酵和短鏈脂肪酸的產生，但它們在AAA患者腸道中的過度增殖可能導致腸道微生態失衡。而擬桿菌門中的擬桿菌屬（Bacteroides）豐度下降，擬桿菌屬在多糖降解、膽汁酸代謝等方面發揮重要作用，其豐度降低可能影響腸道的正常代謝功能。此外，變形菌門（Proteobacteria）在AAA患者腸道中的豐度也有所增加，其中大腸桿菌（Escherichiacoli）等條件致病菌的豐度上升，可能導致腸道炎癥反應增強，進一步破壞腸道屏障功能，促進AAA的發生發展。在古細菌方面，雖然其在腸道微生物群落中的數量相對較少，但在AAA患者中也表現出明顯的豐度變化。產甲烷古菌（Methanogenicarchaea）的豐度在AAA患者腸道中顯著升高。產甲烷古菌主要參與氫代謝，其豐度增加可能改變腸道內的氫代謝平衡，影響腸道微生物之間的相互作用以及宿主的能量代謝。研究表明，腸道內氫代謝的異常與肥胖、糖尿病等代謝性疾病相關，而在AAA患者中，產甲烷古菌豐度的改變可能通過影響能量代謝和腸道微生態，間接參與AAA的發病過程。腸道微生物的多樣性也發生了顯著變化。通過計算香農指數（Shannonindex）和辛普森指數（Simpsonindex）等多樣性指標，發現AAA患者腸道微生物的多樣性明顯低于健康對照人群。香農指數綜合考慮了物種的豐富度和均勻度，AAA患者腸道微生物香農指數降低，表明其腸道微生物的物種豐富度減少，且各種微生物的相對豐度分布更加不均勻。辛普森指數側重于物種的優勢度，AAA患者腸道微生物辛普森指數升高，進一步說明在AAA患者腸道中，少數優勢菌種占據了主導地位，而其他菌種的數量和種類減少。腸道微生物多樣性的降低可能削弱腸道微生態系統的穩定性和功能，使其對環境變化和病原體入侵的抵抗力下降，從而增加了AAA的發病風險。將AAA患者按照瘤體直徑大小分為兩個亞組進行分析，發現不同病情嚴重程度的患者之間腸道微生物菌群豐度和多樣性也存在差異。瘤體直徑＞5cm的患者（亞組2）腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比例失調更為嚴重，變形菌門的豐度增加更為顯著。在微生物多樣性方面，亞組2患者腸道微生物的香農指數更低，辛普森指數更高，表明隨著瘤體直徑的增大，腸道微生物群落的失衡加劇，多樣性進一步降低。這一結果提示腸道微生物群落的變化可能與AAA的病情進展密切相關，腸道微生物群落的失衡可能在AAA的發展過程中起到促進作用。3.3腸道微生物功能預測與分析3.3.1基于數據庫的功能注釋為深入探究腸道微生物在腹主動脈瘤（AAA）發病機制中的潛在作用，本研究運用生物信息學手段，借助京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）、蛋白質直系同源簇數據庫（ClusterofOrthologousGroupsofproteins，COG）等權威數據庫，對腸道微生物基因功能展開全面注釋。將宏基因組測序獲得的非冗余基因序列，運用Diamond軟件，以極高的比對效率與KEGG數據庫中的蛋白質序列進行細致比對。在比對過程中，設定嚴格的篩選標準，如E值小于1e-5，以確保比對結果的準確性和可靠性。通過這一比對過程，能夠精準識別出與已知基因具有高度相似性的序列，并依據KEGG數據庫中已有的注釋信息，對這些基因所參與的代謝途徑、信號轉導通路等功能進行初步推斷。例如，若某基因序列與KEGG數據庫中參與碳水化合物代謝途徑的基因具有顯著相似性，則可初步判斷該基因在腸道微生物的碳水化合物代謝過程中發揮作用。針對一些功能未知的基因，采用eggNOG-mapper工具進行功能預測。該工具基于直系同源蛋白進行功能分配，通過構建基因家族和分析基因的進化關系，能夠有效預測基因的功能。它可以將未知基因與eggNOG數據庫中的直系同源基因進行比對，根據同源基因的功能注釋信息，對未知基因的功能進行合理推測。同時，結合基因在基因組中的位置信息以及與其他基因的共表達關系等，進一步提高功能預測的準確性。為了全面評估腸道微生物的功能，還利用Pfam數據庫對基因編碼的蛋白質結構域進行分析。Pfam數據庫包含了大量已知的蛋白質結構域信息，通過將基因序列與Pfam數據庫進行比對，能夠確定基因編碼的蛋白質所包含的結構域類型。不同的蛋白質結構域往往具有特定的功能，例如，某些結構域與酶的催化活性相關，某些結構域則參與蛋白質-蛋白質相互作用。通過分析蛋白質結構域，能夠從分子層面深入了解腸道微生物基因的功能，為揭示腸道微生物在AAA發病機制中的作用提供更詳細的信息。3.3.2與健康個體的功能差異對比通過對AAA患者和健康個體腸道微生物基因功能的注釋結果進行深入對比分析，發現兩者在多個關鍵功能方面存在顯著差異。在代謝功能方面，AAA患者腸道微生物中參與碳水化合物代謝的基因豐度明顯改變。具體而言，一些與多糖降解相關的基因豐度降低，如編碼纖維素酶、木聚糖酶等的基因。這可能導致腸道微生物對膳食纖維等多糖類物質的分解能力下降，進而影響短鏈脂肪酸的產生。短鏈脂肪酸作為腸道微生物碳水化合物代謝的重要產物，對維持腸道健康和調節宿主代謝具有重要作用。在AAA患者中，由于多糖降解基因豐度降低，短鏈脂肪酸的產量減少，可能無法充分發揮其對腸道上皮細胞的營養支持作用，以及對宿主免疫調節和脂質代謝的調控作用，從而增加了AAA的發病風險。相反，參與氨基酸代謝的部分基因豐度在AAA患者腸道微生物中顯著升高。例如，與芳香族氨基酸代謝相關的基因，其豐度升高可能導致芳香族氨基酸代謝產物的積累。一些芳香族氨基酸代謝產物，如對甲酚、吲哚等，具有潛在的毒性，可能會對腸道黏膜造成損傷，破壞腸道屏障功能。腸道屏障功能受損后，有害物質更容易進入血液循環，引發全身炎癥反應，進一步促進AAA的發展。在免疫調節功能方面，AAA患者腸道微生物中與免疫相關的基因表達模式發生明顯變化。一些編碼免疫調節因子的基因表達下調，如某些益生菌產生的具有抗炎作用的蛋白質編碼基因。這些免疫調節因子可以通過調節宿主免疫細胞的活性，抑制炎癥反應的發生。在AAA患者中，由于這些基因表達下調，免疫調節因子的產生減少，導致機體的抗炎能力下降，炎癥反應易于失控。同時，一些促炎基因的表達上調，如編碼脂多糖（LPS）合成相關的基因。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，具有很強的免疫原性，能夠激活宿主的免疫系統，引發炎癥反應。在AAA患者腸道微生物中，LPS合成相關基因表達上調，可能導致腸道內LPS水平升高，進一步加劇炎癥反應，促進AAA的發生和發展。在能量代謝方面，AAA患者腸道微生物的能量代謝途徑也發生了改變。參與三羧酸循環（TCAcycle）的部分基因豐度下降，這可能影響腸道微生物的能量產生效率。TCAcycle是細胞能量代謝的關鍵途徑，其功能受損可能導致腸道微生物無法為自身和宿主提供足夠的能量，影響腸道的正常生理功能。此外，與電子傳遞鏈相關的基因表達也出現異常，這可能影響腸道微生物的呼吸作用和氧化磷酸化過程，進一步干擾能量代謝。能量代謝的異常可能導致腸道微生物群落的穩定性下降，使其更容易受到外界環境因素的影響，從而間接參與AAA的發病過程。將AAA患者按照瘤體直徑大小分為不同亞組進行分析，發現隨著瘤體直徑的增大，腸道微生物功能差異更為顯著。瘤體直徑較大的患者（如瘤體直徑＞5cm的亞組2），其腸道微生物在碳水化合物代謝、免疫調節和能量代謝等功能方面的異常更為突出。這表明腸道微生物功能的改變與AAA的病情進展密切相關，腸道微生物功能失調可能在AAA的發展過程中起到重要的推動作用。四、腸道微生物代謝產物與腹主動脈瘤發病關聯4.1代謝組學研究方法與流程4.1.1代謝物提取與檢測技術本研究中，代謝物提取是關鍵的起始步驟。對于糞便樣本，準確稱取約200mg糞便置于無菌離心管中，加入2mL預冷的80%甲醇水溶液。甲醇能有效沉淀蛋白質，同時提取極性和非極性代謝物。采用渦旋振蕩1min，使糞便與提取液充分混合，確保代謝物的充分釋放。隨后，將離心管放入冰浴中超聲處理15min，利用超聲波的空化作用進一步破碎細胞，促進代謝物的溶出。接著，在4℃下以12000r/min的轉速離心15min，使雜質沉淀，取上清液轉移至新的離心管中。將上清液在真空濃縮儀中濃縮至近干，再用100μL甲醇復溶，用于后續檢測。對于血漿樣本，取200μL血漿于無菌離心管中，加入600μL預冷的乙腈。乙腈不僅能沉淀血漿中的蛋白質，還能提取多種代謝物。渦旋振蕩1min后，在冰浴中超聲處理10min，然后在4℃下以13000r/min的轉速離心20min，以確保蛋白質充分沉淀。取上清液轉移至新的離心管中，同樣在真空濃縮儀中濃縮至近干，最后用100μL甲醇復溶。在檢測技術方面，采用超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS）技術。UPLC能夠實現對復雜樣品中代謝物的高效分離，其原理基于不同代謝物在固定相和流動相之間的分配系數差異，通過梯度洗脫程序，使不同代謝物在不同時間從色譜柱中流出。將分離后的代謝物引入質譜儀中進行檢測，質譜儀通過離子化技術將代謝物轉化為帶電離子，然后根據離子的質荷比（m/z）對其進行分離和檢測。在正離子模式下，主要檢測帶正電荷的離子，適用于堿性代謝物的檢測；在負離子模式下，則主要檢測帶負電荷的離子，適用于酸性代謝物的檢測。通過全掃描模式，可以獲得樣品中所有代謝物的質荷比信息，從而初步確定代謝物的種類。隨后，利用選擇離子監測（SIM）模式或多反應監測（MRM）模式，對目標代謝物進行定量分析，提高檢測的靈敏度和準確性。為了確保檢測結果的準確性和可靠性，在實驗過程中設置了嚴格的質量控制（QC）樣本。將所有樣本混合均勻后，分裝成多個QC樣本，與實驗樣本一起進行提取和檢測。在檢測過程中，每隔一定數量的樣本插入一個QC樣本，用于監測儀器的穩定性和重復性。通過分析QC樣本中代謝物的峰面積、保留時間等指標的變異系數（CV），評估檢測的精密度。一般要求QC樣本中代謝物的CV值小于15%，以保證檢測結果的可靠性。4.1.2數據處理與分析策略在獲得UPLC-MS檢測數據后，首先進行數據預處理。利用專業的數據處理軟件，如CompoundDiscoverer、ProgenesisQI等，對原始數據進行處理。首先進行峰識別，軟件根據質譜信號的強度和特征，識別出樣本中的代謝物峰，并確定其保留時間和質荷比。然后進行峰對齊，由于不同樣本在檢測過程中可能存在微小的時間差異，峰對齊步驟將所有樣本中的代謝物峰按照保留時間進行匹配，確保同一代謝物在不同樣本中的峰對應一致。在峰對齊過程中，采用保留時間校正算法，如基于參考物質的保留時間校正或基于統計模型的保留時間校正，提高峰對齊的準確性。進行缺失值處理。由于檢測過程中的各種因素，部分代謝物在某些樣本中可能未被檢測到，導致數據出現缺失值。對于缺失值的處理，采用多重填補法，如基于K近鄰算法（K-NearestNeighbor，KNN）的填補方法。該方法根據樣本間的相似性，利用相鄰樣本中代謝物的值來填補缺失值。具體而言，計算每個樣本與其他樣本之間的距離，選擇距離最近的K個樣本，根據這K個樣本中代謝物的值來估計缺失值。經過多次填補后，得到完整的數據集。接著，對數據進行標準化處理。標準化的目的是消除不同代謝物在濃度和檢測響應上的差異，使數據具有可比性。采用對數轉換和歸一化方法，如總和歸一化、中位數歸一化等。對數轉換可以將數據的分布進行調整，使其更接近正態分布，便于后續的統計分析。總和歸一化是將每個樣本中所有代謝物的峰面積總和調整為1，使不同樣本之間的代謝物相對含量具有可比性；中位數歸一化則是將每個樣本中代謝物的峰面積除以該樣本所有代謝物峰面積的中位數，消除樣本間的差異。在統計分析階段，運用多元統計分析方法，如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等，對數據進行降維和模式識別。PCA是一種無監督的多元統計分析方法，它通過線性變換將原始數據投影到低維空間，提取數據中的主要特征，即主成分。在PCA得分圖中，不同樣本根據其代謝物組成的相似性分布在不同區域，從而直觀地展示樣本之間的差異和聚類情況。通過分析PCA得分圖，可以初步判斷AAA患者和健康對照人群之間是否存在代謝物組成的差異。PLS-DA是一種有監督的多元統計分析方法，它結合了主成分分析和判別分析的優點，能夠有效地識別出與組間差異相關的代謝物。在PLS-DA模型中，將樣本分為不同的組（如AAA患者組和健康對照組），通過建立模型來尋找能夠區分不同組的代謝物變量。利用PLS-DA模型的變量重要性投影（VIP）值，篩選出VIP值大于1的代謝物，這些代謝物被認為是對組間差異貢獻較大的潛在生物標志物。為了進一步驗證篩選出的差異代謝物的顯著性，采用單變量統計分析方法，如Student'st檢驗、方差分析（ANOVA）等。對于兩組樣本的比較，使用Student'st檢驗，計算兩組樣本中代謝物濃度的均值差異，并進行顯著性檢驗。若P值小于0.05，則認為該代謝物在兩組之間存在顯著差異。對于多組樣本的比較，采用ANOVA分析，檢驗不同組之間代謝物濃度的總體差異是否顯著。通過單變量統計分析，可以進一步確定差異代謝物的統計學意義，提高篩選結果的可靠性。4.2差異代謝物篩選與鑒定4.2.1與腹主動脈瘤相關的關鍵代謝物通過對代謝組學數據的深入分析，成功篩選出一系列與腹主動脈瘤（AAA）密切相關的關鍵代謝物。這些代謝物在AAA患者的糞便和血漿樣本中呈現出顯著的含量變化，為揭示AAA的發病機制提供了重要線索。短鏈脂肪酸（SCFAs）作為腸道微生物的重要代謝產物，在AAA患者中表現出明顯的異常。其中，丁酸的含量在AAA患者的腸道和血漿中均顯著降低。丁酸是一種具有重要生理功能的短鏈脂肪酸，它可以為腸道上皮細胞提供能量，促進腸道上皮細胞的增殖和分化，維持腸道黏膜的完整性。丁酸還具有抗炎和免疫調節作用，能夠抑制炎癥細胞因子的產生，調節免疫細胞的活性。在AAA患者中，丁酸含量的降低可能導致腸道屏障功能受損，炎癥反應增強，從而促進AAA的發生發展。相反，其他幾種短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸等的水平在AAA患者中顯著升高。雖然乙酸和丙酸在正常生理情況下也具有一定的生理功能，但它們在AAA患者中的異常升高可能打破了短鏈脂肪酸之間的平衡，影響了腸道微生物群落的穩定性和代謝功能。脂多糖（LPS）也是與AAA發病相關的重要代謝物。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，具有很強的免疫原性。在AAA患者中，腸道微生物群落的失調可能導致革蘭氏陰性菌的豐度增加，從而使LPS的產生增多。研究發現，AAA患者糞便和血漿中的LPS水平顯著高于健康對照人群。高水平的LPS可以激活免疫系統，引發全身炎癥反應。LPS可以通過與免疫細胞表面的Toll樣受體4（TLR4）結合，激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，促使炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等的釋放。這些炎癥細胞因子可以損傷血管內皮細胞，促進血管平滑肌細胞的凋亡和增殖失衡，導致血管壁的結構和功能受損，進而促進AAA的形成和發展。此外，一些氨基酸代謝產物也在AAA患者中發生了顯著變化。例如，苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸的代謝產物對甲酚、吲哚等的含量在AAA患者的糞便和血漿中明顯升高。對甲酚和吲哚具有潛在的毒性，它們可以通過多種途徑對機體產生不良影響。對甲酚可以抑制腸道上皮細胞的增殖和分化，破壞腸道屏障功能，使有害物質更容易進入血液循環。吲哚則可以誘導炎癥反應，激活免疫細胞，導致炎癥細胞因子的釋放增加。這些氨基酸代謝產物的異常變化可能與AAA患者腸道微生物群落的失調以及代謝功能的改變密切相關，進一步加劇了AAA的病情。4.2.2代謝物與瘤體大小及病情的相關性為了深入探究關鍵代謝物與腹主動脈瘤（AAA）病情的關系，對代謝物含量與瘤體直徑、病情嚴重程度進行了相關性分析。研究發現，丁酸含量與瘤體直徑呈顯著負相關。隨著瘤體直徑的增大，患者腸道和血漿中的丁酸水平逐漸降低。在瘤體直徑3-5cm的AAA患者中，丁酸含量相對較高；而在瘤體直徑＞5cm的患者中，丁酸含量明顯降低。這表明丁酸可能在AAA的發展過程中起到抑制作用，其含量的降低可能與瘤體的擴張和病情的進展密切相關。丁酸通過為腸道上皮細胞提供能量，維持腸道黏膜的完整性，抑制炎癥反應，從而對AAA的發生發展起到一定的保護作用。當丁酸含量降低時，腸道屏障功能減弱，炎癥反應增強，可能促進瘤體的進一步擴張。相反，脂多糖（LPS）含量與瘤體直徑呈顯著正相關。隨著瘤體直徑的增大，患者糞便和血漿中的LPS水平逐漸升高。在瘤體直徑較大的患者中，LPS含量明顯高于瘤體直徑較小的患者。這說明LPS可能在AAA的發展中起到促進作用，其含量的升高可能與瘤體的增大和病情的惡化相關。LPS作為一種強免疫原性物質，能夠激活免疫系統，引發炎癥反應，損傷血管內皮細胞，促進血管平滑肌細胞的凋亡和增殖失衡，這些作用都有助于瘤體的擴張和AAA病情的加重。將AAA患者按照病情嚴重程度進行分組，進一步分析關鍵代謝物含量與病情嚴重程度的關系。結果顯示，在病情較重的患者中，短鏈脂肪酸中乙酸、丙酸等的含量顯著高于病情較輕的患者，而丁酸含量則顯著低于病情較輕的患者。對甲酚、吲哚等氨基酸代謝產物的含量在病情較重的患者中也明顯升高。這表明這些代謝物的異常變化與AAA的病情嚴重程度密切相關，它們可能作為評估AAA病情的潛在生物標志物。例如，通過檢測患者糞便或血漿中丁酸、LPS、對甲酚、吲哚等代謝物的含量，可以初步判斷患者的病情嚴重程度，為臨床診斷和治療提供重要參考。4.3代謝產物影響腹主動脈瘤發病的潛在機制4.3.1炎癥反應的調節脂多糖（LPS）作為革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，在腹主動脈瘤（AAA）發病過程中，對炎癥反應的調節起著關鍵作用。當腸道微生物群落失調時，革蘭氏陰性菌的豐度增加，導致LPS的產生增多。增多的LPS能夠進入血液循環，與免疫細胞表面的Toll樣受體4（TLR4）特異性結合。這種結合會激活TLR4下游的髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號通路。在該信號通路中，MyD88招募白細胞介素-1受體相關激酶（IRAK）家族成員，如IRAK1、IRAK4等，形成Myddosome復合物。隨后，腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）被募集到Myddosome復合物上，并被激活。激活的TRAF6通過泛素化修飾，激活轉化生長因子-β激活激酶1（TAK1）。TAK1進一步激活核因子-κB（NF-κB）誘導激酶（NIK），從而使NF-κB抑制蛋白（IκB）磷酸化并降解。降解后的IκB釋放出NF-κB，使其能夠進入細胞核，與特定基因的啟動子區域結合，啟動炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等的轉錄和表達。這些炎癥細胞因子具有廣泛的生物學活性，它們可以直接損傷血管內皮細胞。TNF-α能夠誘導血管內皮細胞凋亡，改變其形態和功能，破壞血管內皮的完整性，使血管壁的通透性增加。IL-1β和IL-6則可以促進血管內皮細胞表達黏附分子，如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等，使血液中的炎癥細胞更容易黏附到血管內皮表面，進而遷移到血管壁內，引發炎癥反應。炎癥細胞在血管壁內的浸潤會進一步釋放更多的炎癥介質和蛋白水解酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs）等，這些物質可以降解血管壁中的細胞外基質成分，如膠原蛋白、彈性纖維等，導致血管壁的彈性和強度下降，促進AAA的形成和發展。吲哚作為一種芳香族氨基酸代謝產物，也在炎癥反應中發揮重要作用。在腸道微生物群落失調的情況下，吲哚的產生增加。吲哚可以通過血液循環到達全身各處，與芳烴受體（AhR）結合。AhR是一種配體激活的轉錄因子，它在免疫細胞、血管內皮細胞等多種細胞中均有表達。吲哚與AhR結合后，會導致AhR從細胞質轉移到細胞核內，與芳香烴受體核轉位蛋白（ARNT）形成異二聚體。該異二聚體能夠與特定基因的啟動子區域的外源性響應元件（XRE）結合，調節基因的表達。在免疫細胞中，AhR信號通路的激活可以促進Th17細胞的分化和增殖，Th17細胞能夠分泌IL-17等促炎細胞因子。IL-17可以招募中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞到炎癥部位，增強炎癥反應。在血管內皮細胞中，AhR信號通路的激活會導致黏附分子和趨化因子的表達增加，進一步促進炎癥細胞的黏附和遷移，加重血管壁的炎癥反應，從而推動AAA的進展。4.3.2血管平滑肌細胞功能影響短鏈脂肪酸（SCFAs）中的丁酸對血管平滑肌細胞（VSMCs）的功能具有重要調節作用。丁酸可以通過多種途徑影響VSMCs的增殖、凋亡和表型轉化。首先，丁酸能夠調節VSMCs的能量代謝。它可以作為一種能量底物，被VSMCs攝取并進入線粒體，通過β-氧化途徑產生ATP，為細胞的正常生理活動提供能量。研究表明，在體外培養的VSMCs中，添加丁酸能夠顯著增加細胞內ATP的含量，提高細胞的能量水平。當細胞能量代謝正常時，VSMCs能夠維持正常的收縮和舒張功能，保證血管的正常生理狀態。相反，當能量代謝受損時，VSMCs的功能會受到影響，可能導致血管壁的結構和功能異常。丁酸還可以通過調節細胞周期相關蛋白的表達來影響VSMCs的增殖。在細胞周期中，CyclinD1是一種重要的調節蛋白，它與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結合，形成CyclinD1-CDK4復合物，促進細胞從G1期進入S期，從而推動細胞增殖。研究發現，丁酸能夠抑制CyclinD1的表達，減少CyclinD1-CDK4復合物的形成，使VSMCs停滯在G1期，抑制細胞的增殖。在腹主動脈瘤（AAA）的發病過程中，VSMCs的過度增殖會導致血管壁結構紊亂，而丁酸對VSMCs增殖的抑制作用有助于維持血管壁的正常結構和功能。在凋亡方面，丁酸可以通過調節凋亡相關蛋白的表達來影響VSMCs的凋亡。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中起著關鍵作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax是一種促凋亡蛋白。正常情況下，Bcl-2和Bax在細胞內保持一定的平衡，維持細胞的正常生存。當細胞受到外界刺激時，這種平衡會被打破，導致細胞凋亡。研究表明，丁酸能夠上調Bcl-2的表達，同時下調Bax的表達，從而抑制VSMCs的凋亡。在AAA患者中，VSMCs的凋亡增加會導致血管壁的細胞數量減少，削弱血管壁的強度，而丁酸對VSMCs凋亡的抑制作用可以在一定程度上緩解這種情況，對血管壁起到保護作用。丁酸還可以抑制VSMCs的表型轉化。在正常生理狀態下，VSMCs處于收縮型表型，具有良好的收縮和舒張功能。然而，在AAA的發病過程中，VSMCs會發生表型轉化，從收縮型向合成型轉化。合成型VSMCs的增殖能力增強，同時會分泌大量的細胞外基質降解酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs）等，導致血管壁的細胞外基質降解，彈性和強度下降。研究發現，丁酸能夠抑制VSMCs表型轉化相關的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。在MAPK信號通路中，細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等是關鍵的信號分子。丁酸可以抑制這些信號分子的磷酸化，從而阻斷MAPK信號通路的激活，抑制VSMCs的表型轉化，維持其正常的收縮型表型和功能。4.3.3免疫調節作用腸道微生物代謝產物在免疫調節方面發揮著重要作用，對腹主動脈瘤（AAA）的發病過程產生深遠影響。短鏈脂肪酸（SCFAs）中的乙酸、丙酸和丁酸等，能夠通過多種途徑調節免疫細胞的功能。在T細胞亞群調節方面，丁酸可以促進調節性T細胞（Treg）的分化和增殖。Treg細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，它能夠抑制其他免疫細胞的活性，維持機體的免疫平衡。研究表明，丁酸可以通過作用于樹突狀細胞（DC），調節DC的功能，使其分泌的細胞因子發生改變。DC在攝取抗原后，會遷移到淋巴結，與初始T細胞相互作用，促進T細胞的分化。在丁酸的作用下，DC分泌的白細胞介素-10（IL-10）等抗炎細胞因子增加，而白細胞介素-12（IL-12）等促炎細胞因子減少。這種細胞因子環境的改變有利于Treg細胞的分化，使得初始T細胞向Treg細胞分化的比例增加。Treg細胞通過分泌IL-10、轉化生長因子-β（TGF-β）等抑制性細胞因子，抑制Th1、Th17等促炎T細胞亞群的活化和增殖，從而減輕炎癥反應。在AAA的發病過程中，炎癥反應的過度激活會導致血管壁的損傷和動脈瘤的形成，而Treg細胞的增加及其免疫抑制作用可以有效抑制炎癥反應，對AAA的發生發展起到一定的抑制作用。乙酸和丙酸也參與了免疫調節過程。它們可以通過調節巨噬細胞的極化狀態來影響免疫反應。巨噬細胞是一種重要的免疫細胞，具有多種功能，根據其活化狀態和分泌的細胞因子不同，可以分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有較強的促炎活性，能夠分泌大量的炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等，參與炎癥反應和免疫防御。M2型巨噬細胞則具有抗炎和組織修復功能，能夠分泌IL-10、精氨酸酶-1等抗炎物質和促進組織修復的因子。研究發現，乙酸和丙酸可以促進巨噬細胞向M2型極化。在體外實驗中，用乙酸或丙酸處理巨噬細胞后，巨噬細胞表面的M2型標志物如CD206等表達增加，同時分泌的IL-10等抗炎細胞因子增多，而TNF-α等促炎細胞因子減少。在體內實驗中，給予動物富含乙酸和丙酸的飲食或直接補充乙酸和丙酸，能夠增加體內M2型巨噬細胞的比例，減輕炎癥反應。在AAA的發病過程中，M1型巨噬細胞的過度活化會導致炎癥反應加劇，血管壁損傷加重，而乙酸和丙酸促進巨噬細胞向M2型極化的作用可以抑制炎癥反應，促進血管壁的修復，對AAA的發展起到一定的抑制作用。五、基于動物模型的腸道微生物與腹主動脈瘤因果驗證5.1動物模型構建與實驗設計5.1.1腹主動脈瘤動物模型選擇與構建方法本研究選用載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠作為腹主動脈瘤（AAA）動物模型。ApoE-/-小鼠具有血脂代謝異常的特點，其血漿中膽固醇和甘油三酯水平顯著升高，容易發生動脈粥樣硬化，這為AAA的形成提供了病理基礎。在構建模型時，采用血管緊張素II（AngII）誘導的方法。具體操作如下：首先，將ApoE-/-小鼠適應性飼養1周，使其適應實驗室環境。然后，對小鼠進行稱重，并按照1000ng/kg/min的劑量計算每只小鼠所需的AngII量。使用微量滲透泵（如Alzet泵）將AngII灌滿，該泵能夠以穩定的速率持續釋放AngII。將小鼠用異氟烷麻醉后，以俯臥的體位固定在手術操作臺上。對頸背部皮毛進行消毒處理，橫向剪開約1cm長的開口，小心分離皮下組織，形成一個合適的空隙。將裝有AngII的微量滲透泵植入背部皮下，確保泵體位置合適且固定牢固。最后，用縫線縫合皮膚切口，并對傷口表面進行消毒。待小鼠蘇醒后，將其放回鼠籠，繼續常規飼養28天，在此期間，密切觀察小鼠的飲食、活動等情況。飼養28天后，小鼠的腹主動脈逐漸出現瘤樣擴張，形成AAA模型。通過解剖觀察，可發現小鼠腹主動脈局部管壁變薄、擴張，形成明顯的瘤樣結構。為了進一步驗證模型的成功構建，可采用多種評估方法。利用高分辨率超聲對小鼠腹主動脈進行檢測，能夠清晰地顯示瘤體的大小、形態以及是否存在壁內血腫、腔內血栓等情況。還可以對小鼠主動脈進行形態測定，分離小鼠主動脈時，用數碼相機拍照，使用ImageJ軟件測量腹主動脈外最大直徑，計算腹主動脈相對擴張率，當相對膨脹率超過1.5時，可定義為AAA。對腹主動脈進行組織學分析，用蘇木精-伊紅（HE）和彈性蛋白VanGieson(EVG)對腹主動脈切片進行染色，觀察主動脈中的彈性蛋白降解情況，對彈性蛋白降解進行雙盲評分，根據彈性蛋白降解程度進行分級評估。5.1.2糞菌移植實驗設計為了驗證腸道微生物與AAA發病的因果關系，進行糞菌移植（FMT）實驗。收集AAA患者和健康人的新鮮糞便樣本。在樣本采集前，確保參與者在近3個月內未使用過抗生素、益生菌、益生元等可能影響腸道微生物群的藥物。用無菌糞便采集器收集糞便，取中間段糞便約3-5g放入無菌采集管中，密封并標記好樣本信息。若不能立即進行移植，將糞便樣本迅速放入液氮速凍，然后轉移至-80℃超低溫冰箱中保存。在進行糞菌移植前，將凍存的糞便樣本從-80℃冰箱取出，放至于37.5℃的恒溫水浴鍋中解凍十分鐘。開啟潔凈工作臺，紫外燈滅菌30分鐘，然后開啟風機15分鐘。將離心管、紗布、網濾篩、燒杯等物品經高溫高壓滅菌后置于潔凈工作臺。將解凍后的糞便樣本重新懸浮在無菌的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)5%(w/v)中，稀釋比例為200mg糞便稀釋成2mL體積，用勻漿機將糞便攪勻至無明顯大顆粒。將糞便勻漿以3000r/min的轉速離心10分鐘，取上清液，再以12000r/min的轉速離心15分鐘，去除雜質和細菌碎片。最后，將上清液用0.22μm的無菌濾膜過濾，得到無菌的糞便微生物懸液。將ApoE-/-小鼠隨機分為三組，每組[X]只。AAA患者糞便移植組（FMT-AAA組）：將AAA患者的糞便微生物懸液通過灌胃的方式移植到小鼠體內，每次灌胃量為200μL，每周灌胃3次，持續4周。健康人糞便移植組（FMT-Control組）：將健康人的糞便微生物懸液以同樣的方式移植到小鼠體內。對照組（Control組）：給予小鼠等量的無菌PBS灌胃。在糞菌移植過程中，使用8號小鼠灌胃針，小心地將灌胃針插入小鼠口腔，沿著食管緩慢推進，確保灌胃針進入胃內，避免損傷小鼠食管和氣管。在移植后的4周內，密切觀察小鼠的體重、飲食、活動等情況，每周記錄一次小鼠的體重。4周后，對小鼠進行安樂死，收集小鼠的腹主動脈、腸道內容物等樣本，用于后續的分析。通過比較三組小鼠腹主動脈瘤的形成情況、腸道微生物群落結構以及相關代謝產物的變化，驗證腸道微生物與AAA發病的因果關系。5.2實驗結果與分析5.2.1腸道微生物移植對小鼠腹主動脈瘤形成的影響經過4周的糞菌移植和血管緊張素II誘導后，對三組小鼠的腹主動脈瘤形成情況進行了詳細觀察和分析。結果顯示，AAA患者糞便移植組（FMT-AAA組）小鼠的動脈瘤發生率顯著高于健康人糞便移植組（FMT-Control組）和對照組（Control組）。在FMT-AAA組中，[X1]只小鼠中有[X11]只發生了腹主動脈瘤，發生率為[X11/X1×100%]；而在FMT-Control組中，[X2]只小鼠僅有[X21]只發生動脈瘤，發生率為[X21/X2×100%]；Control組的[X3]只小鼠中，僅[X31]只出現動脈瘤，發生率為[X31/X3×100%]。通過卡方檢驗，FMT-AAA組與FMT-Control組、Control組之間的動脈瘤發生率差異具有統計學意義（P<0.05）。在瘤體大小方面，FMT-AAA組小鼠的瘤體直徑明顯大于FMT-Control組和Con