番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5：抗煙粉虱的功能剖析與機(jī)制探索一、引言1.1研究背景1.1.1煙粉虱對(duì)番茄的危害煙粉虱（Bemisiatabaci）屬半翅目粉虱科，是一種世界性的重大農(nóng)業(yè)害蟲，被世界糧農(nóng)組織認(rèn)定為全球第二大農(nóng)業(yè)害蟲，有“超級(jí)害蟲”的惡名。其寄主范圍極為廣泛，涵蓋了600多種植物，包括茄科、葫蘆科、十字花科等多種蔬菜作物，以及棉花、玉米、豆科及多種花卉。在眾多寄主中，番茄是受煙粉虱危害較為嚴(yán)重的作物之一。煙粉虱對(duì)番茄的危害主要體現(xiàn)在三個(gè)方面。其一，煙粉虱通過口針刺吸番茄韌皮部，取食植物維管束中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，干擾番茄的正常生長(zhǎng)。大量煙粉虱的取食會(huì)導(dǎo)致番茄植株生長(zhǎng)遲緩、葉片發(fā)黃、萎蔫，嚴(yán)重時(shí)甚至整株死亡，直接影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。其二，煙粉虱在取食過程中會(huì)分泌蜜露，蜜露覆蓋在番茄葉片和果實(shí)表面，易誘發(fā)煤污病。煤污病不僅影響番茄的光合作用，還會(huì)降低果實(shí)的商品價(jià)值，使果實(shí)表面失去光澤，品質(zhì)下降。其三，煙粉虱能夠傳播多種植物病毒病，這是其對(duì)番茄危害最為嚴(yán)重的方式。煙粉虱可傳播包括番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）、番茄褪綠病毒（ToCV）等雙生病毒在內(nèi)的200多種植物病毒病。例如，由煙粉虱傳毒引起的番茄黃化曲葉病毒病在多個(gè)番茄產(chǎn)區(qū)相繼暴發(fā)，給番茄生產(chǎn)造成了巨大損失。2009年，入侵煙粉虱傳番茄雙生病毒病在13個(gè)省市大暴發(fā)成災(zāi)，嚴(yán)重發(fā)病田塊病株率達(dá)95%以上，許多地區(qū)的番茄幾乎絕收。在福建省，煙粉虱傳播雙生病毒引起番茄黃化曲葉病毒病的暴發(fā)流行，致使番茄產(chǎn)量和品質(zhì)降低，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失可達(dá)90%以上甚至絕收。隨著全球氣候變暖以及設(shè)施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，煙粉虱的發(fā)生范圍不斷擴(kuò)大，危害程度日益加重。在我國(guó)，煙粉虱自20世紀(jì)90年代入侵以來，已迅速擴(kuò)散至全國(guó)各地，對(duì)番茄種植產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。在北方地區(qū)，設(shè)施番茄為煙粉虱提供了適宜的越冬場(chǎng)所，使其能夠周年發(fā)生，危害時(shí)間延長(zhǎng)；在南方地區(qū)，溫暖濕潤(rùn)的氣候條件有利于煙粉虱的繁殖和生長(zhǎng)，種群數(shù)量迅速增長(zhǎng)。因此，有效解決煙粉虱對(duì)番茄的危害問題，對(duì)于保障番茄種植產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有至關(guān)重要的意義。1.1.2化學(xué)防治煙粉虱的弊端長(zhǎng)期以來，化學(xué)防治一直是控制煙粉虱的主要手段。化學(xué)農(nóng)藥具有快速高效、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，在煙粉虱防治初期確實(shí)取得了一定的效果。然而，隨著化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期大量使用，其弊端也日益凸顯。首先，煙粉虱對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性。由于煙粉虱繁殖速度快、世代周期短，且在田間頻繁接觸化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致其對(duì)有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等傳統(tǒng)殺蟲劑以及新煙堿類等新型殺蟲劑都產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。在一些地區(qū)，煙粉虱對(duì)常用殺蟲劑的抗性倍數(shù)已達(dá)到幾十倍甚至上百倍，使得化學(xué)農(nóng)藥的防治效果大打折扣。例如，在江蘇、浙江等地，煙粉虱對(duì)吡蟲啉、噻蟲嗪等新煙堿類殺蟲劑的抗性水平較高，田間防效明顯下降。其次，化學(xué)農(nóng)藥的使用導(dǎo)致蔬菜農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重威脅食品安全。消費(fèi)者食用了農(nóng)藥殘留超標(biāo)的番茄，可能會(huì)對(duì)身體健康造成潛在危害，引發(fā)各種疾病。近年來，因蔬菜農(nóng)藥殘留問題引發(fā)的食品安全事件時(shí)有發(fā)生，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。此外，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用還會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。農(nóng)藥殘留會(huì)進(jìn)入土壤、水體和大氣中，破壞生態(tài)平衡，影響非靶標(biāo)生物的生存和繁衍。例如，化學(xué)農(nóng)藥可能會(huì)殺死害蟲的天敵，如捕食性昆蟲、寄生性昆蟲等，導(dǎo)致害蟲的自然控制作用減弱，進(jìn)一步加劇煙粉虱的危害。同時(shí)，農(nóng)藥的使用還會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生負(fù)面影響，降低土壤肥力，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康。綜上所述，化學(xué)防治煙粉虱帶來的抗藥性、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題，已嚴(yán)重制約了番茄種植產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，尋求綠色、安全、有效的煙粉虱防控技術(shù)迫在眉睫。1.1.3植物抗蟲基因研究進(jìn)展在植物和昆蟲漫長(zhǎng)的共同進(jìn)化過程中，植物進(jìn)化出了復(fù)雜的防御機(jī)制來抵抗植食性昆蟲，包括物理和化學(xué)的組成型防御、直接或間接的誘導(dǎo)型防御。組成型防御是指植物用本身固有的物理和化學(xué)屏障來阻礙昆蟲的取食，如植物表面的刺、毛狀體和角質(zhì)層等。誘導(dǎo)型防御是指植物在受到植食性昆蟲為害后產(chǎn)生的防御反應(yīng)，一種是植物直接產(chǎn)生防御蛋白或有毒次生代謝物的防御，包括芥子油苷、生氰糖苷、生物堿、酚類和蛋白酶抑制劑等，起到毒素、驅(qū)蟲或抗消化的作用；另一種是植物通過釋放揮發(fā)物和花蜜吸引寄生蜂等天敵昆蟲的間接防御。一般而言，植食性昆蟲的取食會(huì)激發(fā)一系列植物的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，植物可以識(shí)別植食性昆蟲/損傷/微生物相關(guān)的分子模式(herbivore-/damage-/microbe-associatedmolecularpattern，HAMP/DAMP/MAMP)并作出相應(yīng)的防御。植物通過復(fù)雜的動(dòng)態(tài)防御系統(tǒng)來應(yīng)對(duì)植食性昆蟲的攻擊，這種高度動(dòng)態(tài)的防御機(jī)制是從識(shí)別昆蟲的口腔分泌物和損傷植物細(xì)胞傳遞的信號(hào)開始啟動(dòng)的，這些初始的信號(hào)通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物中傳遞，包括鈣離子流、磷酸化級(jí)聯(lián)，以及在廣譜抗蟲性中發(fā)揮重要作用的茉莉酸信號(hào)途徑。植物對(duì)刺吸式口器昆蟲的防御得到了廣泛的研究，到目前為止，植物體內(nèi)的刺吸式口器昆蟲抗性基因已有諸多報(bào)道，例如，在番茄中，mi基因能夠介導(dǎo)植物對(duì)煙粉虱和蚜蟲的抗性；在受到煙粉虱的侵染后，辣椒中膜聯(lián)蛋白CaAnnD4-like的表達(dá)量明顯上升；干擾掉轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY81和GhWRKY70表達(dá)的棉花在受到煙粉虱侵染時(shí)，對(duì)煙粉虱的抗性明顯降低；RNAi干擾擬南芥CP基因后，蚜蟲的繁殖力明顯下降；蚜蟲取食小麥后，蚜蟲抗性基因Dnx通過調(diào)節(jié)植株內(nèi)固醇和茉莉酸酯的含量、Ca2+信號(hào)途徑傳導(dǎo)、脫落酸和赤霉素水平實(shí)現(xiàn)小麥對(duì)蚜蟲的防御。挖掘植物中更多抗刺吸式口器昆蟲的基因，對(duì)于抗蟲植株的育種有著深遠(yuǎn)的指導(dǎo)意義。其中，膜聯(lián)蛋白在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫中的功能逐漸受到關(guān)注，其在植物抗蟲中的作用研究也為植物抗蟲機(jī)制的解析提供了新的方向。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的抗煙粉虱功能，從分子、生理和生化等多個(gè)層面揭示其抗蟲機(jī)制，為番茄抗煙粉虱育種提供新的基因資源和理論依據(jù)。具體研究目的如下：明確SlAnn5基因在番茄抗煙粉虱過程中的作用：通過基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9，敲除番茄中的SlAnn5基因，獲得基因敲除突變體；同時(shí)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建SlAnn5過表達(dá)番茄植株。通過比較野生型、基因敲除突變體和過表達(dá)植株在煙粉虱侵染后的生長(zhǎng)狀況、煙粉虱的取食行為、繁殖能力等指標(biāo)，明確SlAnn5基因?qū)Ψ芽篃煼凼芰Φ挠绊憽＝馕鯯lAnn5抗煙粉虱的分子機(jī)制：研究煙粉虱侵染后，SlAnn5基因的表達(dá)模式變化，以及SlAnn5蛋白在番茄細(xì)胞中的定位和相互作用蛋白。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，分析SlAnn5基因調(diào)控下的番茄差異表達(dá)基因和差異表達(dá)蛋白，揭示SlAnn5參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和代謝通路，從而深入解析其抗煙粉虱的分子機(jī)制。評(píng)估SlAnn5在番茄抗煙粉虱育種中的應(yīng)用潛力：將SlAnn5基因?qū)雰?yōu)良番茄品種中，培育具有抗煙粉虱特性的轉(zhuǎn)基因番茄植株。通過田間試驗(yàn)，評(píng)估轉(zhuǎn)基因番茄植株的抗煙粉虱效果、農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀，為SlAnn5基因在番茄抗煙粉虱育種中的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。本研究對(duì)于深入理解植物與昆蟲的相互作用機(jī)制，推動(dòng)番茄抗煙粉虱育種技術(shù)的發(fā)展，具有重要的理論和實(shí)踐意義。理論意義：膜聯(lián)蛋白在植物抗蟲領(lǐng)域的研究相對(duì)較少，本研究聚焦于番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的抗煙粉虱功能，有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白。通過解析SlAnn5的抗蟲分子機(jī)制，可以豐富植物抗蟲的理論體系，為進(jìn)一步研究植物與昆蟲的協(xié)同進(jìn)化提供新的視角。研究結(jié)果還可能揭示新的植物抗蟲信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為其他植物抗蟲基因的挖掘和功能研究提供參考。實(shí)踐意義：煙粉虱對(duì)番茄產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，化學(xué)防治帶來的諸多問題限制了其可持續(xù)發(fā)展。本研究若能成功揭示SlAnn5的抗煙粉虱功能和機(jī)制，將為番茄抗煙粉虱育種提供新的基因資源。利用該基因培育抗煙粉虱的番茄新品種，不僅可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低生產(chǎn)成本，還能提高番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，保障食品安全和生態(tài)環(huán)境。這對(duì)于推動(dòng)番茄產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要的實(shí)踐意義，有望在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，為農(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)增效提供有力支持。二、煙粉虱與番茄的相互作用2.1煙粉虱的生物學(xué)特性2.1.1形態(tài)特征煙粉虱屬漸變態(tài)昆蟲，個(gè)體發(fā)育歷經(jīng)卵、若蟲、成蟲3個(gè)階段，其中若蟲又分為3齡，通常將第3齡若蟲蛻皮后形成的蛹稱為偽蛹或擬蛹。卵：呈長(zhǎng)梨形，長(zhǎng)約0.20mm，寬約0.095mm，有光澤，基部具有小柄，與葉面垂直，卵柄通過產(chǎn)卵器插入葉表裂縫中，這不僅起到附著作用，在授精時(shí)還能導(dǎo)入精子。卵大多不規(guī)則散產(chǎn)于葉背面，少數(shù)見于葉正面，初產(chǎn)時(shí)為淡黃綠色，隨著發(fā)育，顏色逐漸加深，孵化前呈深褐色。若蟲：1齡若蟲體長(zhǎng)約0.29mm，體寬約0.16mm，淡綠色至黃色，具有足和觸角，能活動(dòng)，孵化時(shí)體軀半彎，前足抓住葉片后脫掉卵殼，腹末端有一對(duì)明顯剛毛，有3對(duì)足，在找到合適的取食位點(diǎn)后便固定取食，直至成蟲羽化。2、3齡時(shí)，若蟲的足和觸角退化至只有一節(jié)，固定在植株上取食。3齡若蟲蛻皮后形成偽蛹，蛻下的皮硬化成蛹?xì)ぁ斡迹河細(xì)こ实S色，長(zhǎng)0.6-0.9毫米，邊緣薄或自然下垂，無周緣蠟絲，背面有17對(duì)粗壯的剛毛或無毛，有2根尾剛毛。在分類上，其瓶形孔長(zhǎng)三角形，舌狀突長(zhǎng)匙狀，頂部三角形，具有1對(duì)剛毛，尾溝基部有5-7個(gè)瘤狀突起。成蟲：主要寄生于葉背面，體淡黃白色，翅2對(duì)，白色，被蠟粉無斑點(diǎn)，體長(zhǎng)0.85-0.91毫米，比溫室白粉虱小。前翅脈1條不分叉，靜止時(shí)左右翅合攏呈屋脊?fàn)睿贡秤幸粭l明顯的縫，復(fù)眼紅色，腎形，單眼兩個(gè)，觸角發(fā)達(dá)，共7節(jié)，足3對(duì)，跗節(jié)2節(jié)，爪2個(gè)。2.1.2生活習(xí)性煙粉虱的生活習(xí)性獨(dú)特，在不同發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的行為特點(diǎn)，對(duì)番茄的生長(zhǎng)環(huán)境也有特定要求。繁殖習(xí)性：在熱帶和亞熱帶地區(qū)，煙粉虱1年可發(fā)生11-15代，且世代重疊現(xiàn)象嚴(yán)重。成蟲羽化后，嗜好在中上部成熟葉片上產(chǎn)卵，卵不規(guī)則散產(chǎn)，多產(chǎn)于葉背。每頭雌蟲可產(chǎn)卵30-300粒，在適宜的植物上平均產(chǎn)卵200粒以上，產(chǎn)卵能力與溫度、寄主植物、地理種群密切相關(guān)。例如，在棉花上，每頭雌蟲產(chǎn)卵48-394粒，且在28.5oC以下，產(chǎn)卵數(shù)隨溫度下降而減少，在美國(guó)亞利桑那州，棉花品系的煙粉虱在恒溫和光照條件下，低于14.9oC時(shí)不產(chǎn)卵。取食習(xí)性：剛孵化的煙粉虱若蟲在葉背爬行，數(shù)小時(shí)后固定刺吸取食，直到成蟲羽化。成蟲喜歡群集于植株上部嫩葉背面吸食汁液，隨著番茄植株生長(zhǎng)，新葉長(zhǎng)出，成蟲不斷向上部新葉轉(zhuǎn)移，呈現(xiàn)出由下向上擴(kuò)散危害的垂直分布規(guī)律，即最下部是蛹和剛羽化的成蟲，中下部為若蟲，中上部為即將孵化的黑色卵，上部嫩葉是成蟲及其剛產(chǎn)下的卵。棲息與活動(dòng)習(xí)性：成蟲喜群集，不善飛翔，對(duì)黃色有強(qiáng)烈的趨性。在25-30℃時(shí)，成蟲表現(xiàn)活躍，短距離飛行能力較強(qiáng)，稍有驚動(dòng)，就四處飛散；當(dāng)溫度降到15℃以下時(shí)，反應(yīng)遲鈍，氣溫降到10℃以下時(shí)逐漸死亡。在我國(guó)，煙粉虱在露地不能越冬，多以各種蟲態(tài)在雙大棚或溫室內(nèi)茄果類蔬菜上越冬，立春后氣溫回升，其在雙大棚內(nèi)繁殖加快，5-6月揭棚膜后向外界擴(kuò)散。2.1.3危害特點(diǎn)煙粉虱對(duì)番茄的危害是多方面的，不僅直接影響番茄植株的生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)通過傳播病毒等方式造成間接危害，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。直接危害：煙粉虱以刺吸式口器刺入番茄韌皮部，取食植物維管束中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，干擾番茄的正常生理代謝。大量煙粉虱的取食會(huì)導(dǎo)致番茄植株生長(zhǎng)遲緩，葉片褪綠變黃、萎蔫，嚴(yán)重時(shí)甚至整株死亡。同時(shí)，煙粉虱在取食過程中會(huì)分泌蜜露，蜜露覆蓋在番茄葉片和果實(shí)表面，易誘發(fā)煤污病，使葉片光合作用受阻，果實(shí)表面失去光澤，品質(zhì)下降，商品價(jià)值降低。間接危害：煙粉虱是多種植物病毒的傳播介體，能夠傳播包括番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）、番茄褪綠病毒（ToCV）等200多種植物病毒病。以番茄黃化曲葉病毒病為例，該病毒由煙粉虱傳播，在多個(gè)番茄產(chǎn)區(qū)相繼暴發(fā)，嚴(yán)重發(fā)病田塊病株率達(dá)95%以上，許多地區(qū)的番茄幾乎絕收。病毒感染后的番茄植株，生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重抑制，果實(shí)畸形，產(chǎn)量大幅下降，給番茄種植產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失。2.2番茄對(duì)煙粉虱的防御機(jī)制2.2.1物理防御番茄的物理防御機(jī)制主要體現(xiàn)在其表皮結(jié)構(gòu)和毛狀體等方面，這些結(jié)構(gòu)能夠?qū)煼凼娜∈场a(chǎn)卵和生存產(chǎn)生阻礙作用。番茄葉片表面覆蓋著一層角質(zhì)層，角質(zhì)層是由角質(zhì)和蠟質(zhì)組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，具有一定的硬度和韌性。角質(zhì)層的存在增加了煙粉虱口針刺入葉片的難度，使得煙粉虱在取食時(shí)需要花費(fèi)更多的能量和時(shí)間來穿透這一物理屏障。研究表明，角質(zhì)層較厚的番茄品種，煙粉虱的取食頻率相對(duì)較低，這說明角質(zhì)層能夠有效地減少煙粉虱對(duì)番茄的侵害。番茄的表皮毛也是其重要的物理防御結(jié)構(gòu)之一。表皮毛的密度、長(zhǎng)度和形態(tài)因番茄品種而異，這些差異會(huì)影響煙粉虱的行為。例如，多毛番茄具有密集且較長(zhǎng)的表皮毛，煙粉虱在其上的產(chǎn)卵量明顯低于表皮毛稀疏的品種。表皮毛可以干擾煙粉虱的爬行和尋找合適的產(chǎn)卵位點(diǎn)，使其難以在葉片上順利移動(dòng)和產(chǎn)卵。同時(shí)，一些表皮毛還能夠分泌粘性物質(zhì)，當(dāng)煙粉虱接觸到這些物質(zhì)時(shí)，會(huì)被黏附，從而限制其活動(dòng)能力，增加其被捕食者發(fā)現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，番茄的葉片厚度和質(zhì)地也與抗煙粉虱能力有關(guān)。較厚的葉片能夠?yàn)闊煼凼娜∈吃O(shè)置更大的障礙，使得煙粉虱在取食過程中需要消耗更多的能量，從而降低其取食效率。葉片質(zhì)地堅(jiān)韌的番茄品種，煙粉虱口針難以刺入，也能在一定程度上抵御煙粉虱的侵害。2.2.2化學(xué)防御番茄在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，形成了復(fù)雜的化學(xué)防御體系，能夠產(chǎn)生多種次生代謝物來抵御煙粉虱的侵害。這些次生代謝物主要包括生物堿、酚類化合物、萜類化合物等，它們對(duì)煙粉虱具有驅(qū)避、抑制生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等作用。生物堿是一類含氮的有機(jī)化合物，在番茄的化學(xué)防御中發(fā)揮著重要作用。例如，番茄堿是番茄中含有的一種重要生物堿，它具有一定的毒性。煙粉虱取食含有番茄堿的番茄組織后，其消化系統(tǒng)會(huì)受到損害，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而抑制煙粉虱的生長(zhǎng)發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，番茄堿能夠降低煙粉虱的存活率和繁殖率，使煙粉虱若蟲的發(fā)育歷期延長(zhǎng)，成蟲的壽命縮短。此外，番茄堿還能影響煙粉虱的取食行為，使其對(duì)番茄植株的選擇偏好降低，起到驅(qū)避煙粉虱的作用。酚類化合物也是番茄化學(xué)防御的重要組成部分。其中，綠原酸、咖啡酸等酚類物質(zhì)在番茄受到煙粉虱侵害時(shí)會(huì)大量積累。這些酚類化合物可以通過氧化作用形成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)具有較強(qiáng)的活性，能夠與煙粉虱體內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)和功能改變，從而影響煙粉虱的正常生理代謝。同時(shí)，酚類化合物還能夠誘導(dǎo)煙粉虱體內(nèi)的解毒酶活性升高，使煙粉虱消耗更多的能量來應(yīng)對(duì)這些防御物質(zhì)，進(jìn)一步削弱其生存和繁殖能力。萜類化合物在番茄的化學(xué)防御中也具有重要意義。例如，番茄植株在受到煙粉虱攻擊后，會(huì)釋放出揮發(fā)性萜類化合物，如羅勒烯、法呢烯等。這些揮發(fā)性萜類化合物能夠吸引煙粉虱的天敵，如捕食性昆蟲和寄生性昆蟲，從而間接防御煙粉虱的侵害。此外，一些萜類化合物還具有直接抑制煙粉虱生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的作用。研究表明，某些萜類化合物能夠干擾煙粉虱的內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響其蛻皮激素和保幼激素的合成和分泌，導(dǎo)致煙粉虱的發(fā)育異常，繁殖能力下降。三、膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能3.1膜聯(lián)蛋白的概述膜聯(lián)蛋白是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的可溶性蛋白，最早于20世紀(jì)70年代末被發(fā)現(xiàn)。1978年，Creutz等成功分離純化出膜聯(lián)蛋白，開啟了對(duì)這一蛋白家族的研究歷程。此后，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白在進(jìn)化上高度保守，幾乎存在于所有生物的各類器官中，包括動(dòng)物、植物及菌類等。在植物中，膜聯(lián)蛋白參與了眾多重要的生理過程，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵作用。從分布來看，膜聯(lián)蛋白家族成員廣泛存在于65種以上的物種中，已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的序列超過200個(gè)。其家族成員多達(dá)500多種，根據(jù)生物種類的不同，可分為五類。其中，脊椎動(dòng)物的膜聯(lián)蛋白屬于A類，已被命名的有膜聯(lián)蛋白A1-A13；無脊椎動(dòng)物膜聯(lián)蛋白歸為B類；真菌和一些單細(xì)胞真核生物屬于C類；植物膜聯(lián)蛋白屬于D類；原核生物被歸入E類。在植物細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)也存在于膜組織上，如能導(dǎo)致脂質(zhì)體和分泌囊泡聚集，還分布于各種外膜系統(tǒng)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡膜、高爾基體及其衍生的囊泡等。在擬南芥葉綠體中，也發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白AnxAtl的存在。在單子葉和雙子葉植物中，均發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白的蹤跡，包括模式植物擬南芥和豆科苜蓿等。其中，擬南芥的7個(gè)膜聯(lián)蛋白基因和水稻的9個(gè)膜聯(lián)蛋白基因的基因組測(cè)序已完成。植物膜聯(lián)蛋白的小分子蛋白（32-43kD）含量在植物細(xì)胞總蛋白含量中的比例為0.5%-2%。在植物的整個(gè)生長(zhǎng)過程中，膜聯(lián)蛋白都有表達(dá)，在胚芽、種子、根、塊莖、莖、下胚軸、胚芽鞘、子葉、葉片、花序、果實(shí)、維管組織等部位均能檢測(cè)到。例如，在種子萌發(fā)階段，膜聯(lián)蛋白參與調(diào)節(jié)種子的吸水和代謝過程，影響種子的萌發(fā)速率和幼苗的生長(zhǎng)活力；在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，膜聯(lián)蛋白對(duì)根系的生長(zhǎng)、根毛的發(fā)育以及葉片的擴(kuò)展等過程發(fā)揮著重要作用；在生殖生長(zhǎng)階段，膜聯(lián)蛋白參與調(diào)控花的發(fā)育、花粉的萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)，以及果實(shí)的發(fā)育和成熟等過程。3.2膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)特征3.2.1保守結(jié)構(gòu)域膜聯(lián)蛋白在結(jié)構(gòu)上具有顯著的保守性，其C端是保守的核心區(qū)域，包含4個(gè)結(jié)構(gòu)和序列高度相似的結(jié)構(gòu)域，被稱為Annexinsrepeat。這4個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過程中高度保守，反映了膜聯(lián)蛋白在生物體內(nèi)的重要功能。每個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域大約由70個(gè)氨基酸殘基組成，它們折疊形成特定的空間結(jié)構(gòu)，能夠可逆地結(jié)合鈣離子，這是膜聯(lián)蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵基礎(chǔ)。例如，在擬南芥的膜聯(lián)蛋白中，這4個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似度較高，且在結(jié)合鈣離子后，能夠與磷脂膜相互作用，參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和膜融合等過程。在番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5中，C端保守結(jié)構(gòu)域同樣具有典型的特征。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，其4個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域中存在保守的內(nèi)聯(lián)蛋白折疊區(qū)（K-G-X-G-T-{38}-D/E），這一結(jié)構(gòu)域在與鈣離子結(jié)合時(shí)發(fā)揮重要作用。鈣離子的結(jié)合使得膜聯(lián)蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，從而暴露出與磷脂結(jié)合的位點(diǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)與帶負(fù)電荷的磷脂分子極性頭部的結(jié)合。這種結(jié)合能力使得膜聯(lián)蛋白能夠在細(xì)胞膜上定位，并參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理過程。與其他植物膜聯(lián)蛋白相比，番茄SlAnn5的C端保守結(jié)構(gòu)域在序列和結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性。例如，與煙草膜聯(lián)蛋白NtAnn1相比，兩者在關(guān)鍵氨基酸殘基的位置和序列上具有一定的保守性，尤其是在與鈣離子和磷脂結(jié)合的區(qū)域。這種相似性表明，在植物進(jìn)化過程中，膜聯(lián)蛋白的C端保守結(jié)構(gòu)域在功能上具有重要的保守性，可能參與了植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫和維持細(xì)胞正常生理功能的重要過程。3.2.2可變區(qū)域膜聯(lián)蛋白的N端為高度可變區(qū)域，這是區(qū)分不同膜聯(lián)蛋白家族成員的主要依據(jù)。N端結(jié)構(gòu)域又稱尾區(qū)，其氨基酸序列和長(zhǎng)度在不同物種和不同膜聯(lián)蛋白成員之間差異較大。這種變異性賦予了膜聯(lián)蛋白在功能上的多樣性。N端區(qū)域包含蛋白水解位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)以及與其他蛋白結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)于膜聯(lián)蛋白的功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要。在植物中，膜聯(lián)蛋白N端可變區(qū)域的功能主要體現(xiàn)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和與其他蛋白的相互作用方面。例如，一些植物膜聯(lián)蛋白的N端區(qū)域能夠與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，從而影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)。在擬南芥中，AtAnn1的N端區(qū)域可以與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，參與調(diào)控花粉管的生長(zhǎng)和極性發(fā)育。此外，N端的磷酸化位點(diǎn)在受到外界信號(hào)刺激時(shí)，可發(fā)生磷酸化修飾，進(jìn)而改變膜聯(lián)蛋白的活性和功能。當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，膜聯(lián)蛋白N端的某些磷酸化位點(diǎn)被激活，使其與其他脅迫響應(yīng)蛋白相互作用，從而參與植物的抗旱反應(yīng)。不同物種的膜聯(lián)蛋白N端可變區(qū)域存在顯著差異。在番茄中，SlAnn5的N端可變區(qū)域具有獨(dú)特的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征。與擬南芥的膜聯(lián)蛋白相比，SlAnn5的N端氨基酸序列長(zhǎng)度和組成有所不同，這可能導(dǎo)致其在功能上的特異性。這些差異可能與不同植物的生長(zhǎng)環(huán)境、生理需求以及進(jìn)化歷程有關(guān)。例如，番茄作為一種重要的蔬菜作物，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，其膜聯(lián)蛋白N端可變區(qū)域可能逐漸適應(yīng)了番茄特有的生長(zhǎng)發(fā)育和防御需求，從而在應(yīng)對(duì)煙粉虱等害蟲侵害時(shí)發(fā)揮獨(dú)特的作用。3.3膜聯(lián)蛋白在植物中的功能3.3.1參與鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)鈣離子作為一種重要的第二信使，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)各種環(huán)境脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。植物細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度處于嚴(yán)格的調(diào)控之下，其穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要。膜聯(lián)蛋白作為一類能夠與鈣離子特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，在植物鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)通路中占據(jù)著重要地位。膜聯(lián)蛋白與鈣離子的結(jié)合是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。研究表明，膜聯(lián)蛋白的C端保守結(jié)構(gòu)域中存在著特定的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)由保守的氨基酸序列組成，能夠與鈣離子發(fā)生高親和力的結(jié)合。當(dāng)植物細(xì)胞受到外界刺激，如機(jī)械損傷、病蟲害侵襲或環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度會(huì)瞬間升高。此時(shí)，膜聯(lián)蛋白能夠迅速感知到鈣離子濃度的變化，并通過其鈣離子結(jié)合位點(diǎn)與鈣離子結(jié)合，從而發(fā)生構(gòu)象變化。這種構(gòu)象變化使得膜聯(lián)蛋白能夠與其他蛋白質(zhì)或分子相互作用，進(jìn)而激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路。以擬南芥為例，AtAnn1是一種重要的膜聯(lián)蛋白。在擬南芥受到干旱脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高，AtAnn1與鈣離子結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出與磷脂膜結(jié)合的位點(diǎn)。AtAnn1與磷脂膜的結(jié)合能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，同時(shí)還能與膜上的離子通道蛋白相互作用，影響離子的跨膜運(yùn)輸，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫的耐受性。此外，AtAnn1還能夠與一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白相互作用，如蛋白激酶和磷酸酶等，通過磷酸化和去磷酸化等修飾作用，激活下游的干旱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗旱能力。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，膜聯(lián)蛋白參與的鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)也發(fā)揮著重要作用。在植物的花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)過程中，鈣離子信號(hào)對(duì)于花粉管的極性生長(zhǎng)和定向延伸至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白能夠與鈣離子結(jié)合，調(diào)節(jié)花粉管內(nèi)的鈣離子濃度梯度，從而影響花粉管的生長(zhǎng)方向和速度。在煙草中，NtAnn1在花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)過程中表達(dá)量較高，沉默NtAnn1基因會(huì)導(dǎo)致花粉管生長(zhǎng)異常，表現(xiàn)為花粉管長(zhǎng)度縮短、生長(zhǎng)速度減慢以及形態(tài)畸形等。進(jìn)一步研究表明，NtAnn1通過與鈣離子結(jié)合，調(diào)節(jié)花粉管內(nèi)的鈣離子濃度，影響花粉管的細(xì)胞壁合成和細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，從而維持花粉管的正常生長(zhǎng)。3.3.2參與膜融合與囊泡運(yùn)輸膜融合和囊泡運(yùn)輸是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞的重要過程，對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能和細(xì)胞間的通訊起著關(guān)鍵作用。膜聯(lián)蛋白在這兩個(gè)過程中扮演著重要角色，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面。在膜融合過程中，膜聯(lián)蛋白能夠促進(jìn)不同膜結(jié)構(gòu)之間的相互作用和融合。研究表明，膜聯(lián)蛋白可以通過與磷脂膜的結(jié)合，改變膜的曲率和穩(wěn)定性，從而促進(jìn)膜的融合。具體來說，膜聯(lián)蛋白的C端保守結(jié)構(gòu)域能夠與帶負(fù)電荷的磷脂分子極性頭部結(jié)合，形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物可以與其他膜結(jié)構(gòu)上的磷脂分子相互作用，拉近兩個(gè)膜之間的距離，降低膜融合的能量障礙，進(jìn)而促進(jìn)膜的融合。在植物細(xì)胞的胞吐作用中，膜聯(lián)蛋白參與了分泌囊泡與細(xì)胞膜的融合過程。當(dāng)細(xì)胞需要分泌某些物質(zhì)時(shí)，分泌囊泡會(huì)從高爾基體等細(xì)胞器脫離，然后運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜附近。在這個(gè)過程中，膜聯(lián)蛋白會(huì)與分泌囊泡和細(xì)胞膜上的磷脂分子結(jié)合，促進(jìn)兩者的融合，使得囊泡內(nèi)的物質(zhì)能夠順利釋放到細(xì)胞外。囊泡運(yùn)輸是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾绞剑遗莸男纬伞⑦\(yùn)輸和與靶膜的融合等過程。膜聯(lián)蛋白在囊泡運(yùn)輸?shù)母鱾€(gè)環(huán)節(jié)都發(fā)揮著重要作用。在囊泡形成過程中，膜聯(lián)蛋白可以與一些膜泡形成相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用，參與囊泡的組裝和形成。研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白能夠與網(wǎng)格蛋白等蛋白質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)網(wǎng)格蛋白包被小泡的形成，從而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸。在囊泡運(yùn)輸過程中，膜聯(lián)蛋白可以作為一種“分子馬達(dá)”，與細(xì)胞骨架相互作用，驅(qū)動(dòng)囊泡沿著細(xì)胞骨架進(jìn)行運(yùn)輸。在植物細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白可以與微管和微絲等細(xì)胞骨架成分結(jié)合，利用細(xì)胞骨架的動(dòng)力作用，將囊泡運(yùn)輸?shù)教囟ǖ奈恢谩Ｔ谀遗菖c靶膜的融合過程中，膜聯(lián)蛋白則發(fā)揮著促進(jìn)融合的作用，確保囊泡內(nèi)的物質(zhì)能夠準(zhǔn)確地運(yùn)輸?shù)侥康牡亍Ｒ灾参锛?xì)胞的液泡運(yùn)輸為例，膜聯(lián)蛋白在液泡的形成、運(yùn)輸和與其他細(xì)胞器的融合過程中都起著關(guān)鍵作用。液泡是植物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，參與物質(zhì)的儲(chǔ)存、代謝和調(diào)節(jié)等過程。在液泡的形成過程中，膜聯(lián)蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器上的磷脂分子結(jié)合，促進(jìn)液泡前體的形成和組裝。在液泡運(yùn)輸過程中，膜聯(lián)蛋白與微管和微絲相互作用，將液泡運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的特定位置。當(dāng)液泡需要與其他細(xì)胞器進(jìn)行物質(zhì)交換或融合時(shí)，膜聯(lián)蛋白又能夠促進(jìn)液泡與靶膜的融合，確保物質(zhì)的準(zhǔn)確運(yùn)輸和細(xì)胞器之間的正常通訊。3.3.3響應(yīng)生物與非生物脅迫在植物的生長(zhǎng)過程中，會(huì)面臨各種生物和非生物脅迫的挑戰(zhàn)，如病原菌的侵染、干旱、高溫、低溫、鹽漬等。膜聯(lián)蛋白作為植物細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)節(jié)蛋白，在植物應(yīng)對(duì)這些脅迫時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，膜聯(lián)蛋白的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化。研究表明，在水稻中，膜聯(lián)蛋白OsANN1在稻瘟菌侵染時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。OsANN1通過與細(xì)胞色素P450單加氧酶HAN1直接互作，穩(wěn)定HAN1蛋白，促進(jìn)其積累，進(jìn)而加劇了水稻JA-Ile的氧化失活，導(dǎo)致水稻的抗病性減弱。然而，當(dāng)病菌侵染時(shí)，OsANN1與HAN1的互作顯著減弱，使得活性茉莉酸積累，增強(qiáng)了水稻的抗病性。這表明膜聯(lián)蛋白在植物抗病過程中具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，通過調(diào)節(jié)植物激素的代謝來影響植物的抗病能力。在番茄中，當(dāng)受到煙粉虱侵害時(shí)，膜聯(lián)蛋白SlAnn5的表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SlAnn5可能參與了番茄對(duì)煙粉虱的防御反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)和信號(hào)通路，增強(qiáng)番茄對(duì)煙粉虱的抗性。在非生物脅迫方面，膜聯(lián)蛋白同樣發(fā)揮著重要作用。在干旱脅迫下，植物細(xì)胞會(huì)感受到水分虧缺的信號(hào)，膜聯(lián)蛋白能夠通過參與鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過程，增強(qiáng)植物的抗旱能力。在擬南芥中，AtAnn1在干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)，與鈣離子結(jié)合后，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和離子通道的活性，維持細(xì)胞的滲透壓平衡，從而提高植物的抗旱性。在鹽脅迫條件下，膜聯(lián)蛋白可以通過調(diào)節(jié)離子的跨膜運(yùn)輸，減少鈉離子的吸收，增加鉀離子的吸收，維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，減輕鹽脅迫對(duì)植物的傷害。在棉花中，GhAnn1在鹽脅迫下表達(dá)量增加，通過與質(zhì)膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)離子的跨膜運(yùn)輸，提高棉花對(duì)鹽脅迫的耐受性。此外，膜聯(lián)蛋白還參與了植物對(duì)高溫、低溫等脅迫的響應(yīng)。在高溫脅迫下，膜聯(lián)蛋白可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，維持細(xì)胞的正常生理功能。在低溫脅迫下，膜聯(lián)蛋白能夠參與調(diào)節(jié)植物的抗氧化系統(tǒng)，增強(qiáng)植物的抗寒能力。在小麥中，TaAnn1在低溫脅迫下表達(dá)上調(diào)，通過提高植物體內(nèi)抗氧化酶的活性，降低活性氧的積累，減輕低溫對(duì)植物的傷害。四、番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的抗煙粉虱功能研究4.1材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料番茄品種：選用栽培番茄品種‘Micro-Tom’作為實(shí)驗(yàn)材料，該品種具有生長(zhǎng)周期短、植株矮小、易于栽培管理等特點(diǎn)，是番茄研究中常用的模式品種，已廣泛應(yīng)用于番茄基因功能研究、遺傳轉(zhuǎn)化等方面的實(shí)驗(yàn)中。實(shí)驗(yàn)所用番茄種子由[具體種子來源單位]提供。煙粉虱種群：煙粉虱種群采自[具體采集地點(diǎn)]的番茄種植大棚，該地區(qū)煙粉虱發(fā)生較為嚴(yán)重且長(zhǎng)期處于自然感染狀態(tài)，所采集的煙粉虱種群具有代表性。采集后，將煙粉虱在實(shí)驗(yàn)室條件下用‘Micro-Tom’番茄植株進(jìn)行擴(kuò)繁和飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度25±2℃，相對(duì)濕度60%-70%，光照周期為16h光照/8h黑暗。經(jīng)過多代飼養(yǎng)，確保煙粉虱種群適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境且遺傳背景相對(duì)穩(wěn)定，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。試劑：RNA提取試劑盒（如TRIzol試劑）購(gòu)自[試劑品牌1]公司，該試劑盒能夠高效、快速地提取高質(zhì)量的總RNA，適用于多種植物組織。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如PrimeScriptRTreagentKit）購(gòu)自[試劑品牌2]公司，其反轉(zhuǎn)錄效率高，能夠?qū)NA高效地反轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的基因克隆和表達(dá)分析提供高質(zhì)量的模板。PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑，包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等，購(gòu)自[試劑品牌3]公司，這些試劑具有高保真度和穩(wěn)定性，能夠保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和特異性。限制性內(nèi)切酶（如BamHI、SalI等）、DNA連接酶（如T4DNA連接酶）購(gòu)自[試劑品牌4]公司，用于基因克隆過程中的載體構(gòu)建和基因片段的連接。其他常規(guī)試劑，如無水乙醇、氯仿、異丙醇、瓊脂糖等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭糜赗NA提取、DNA純化、瓊脂糖凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)步驟。儀器：高速冷凍離心機(jī)（如Eppendorf5424R型離心機(jī)），具有高轉(zhuǎn)速和低溫控制功能，能夠滿足RNA提取、DNA沉淀等實(shí)驗(yàn)對(duì)離心條件的要求，保證實(shí)驗(yàn)樣品的完整性和純度。PCR儀（如Bio-RadT100型PCR儀），能夠精確控制PCR反應(yīng)的溫度、時(shí)間等參數(shù)，確保PCR擴(kuò)增的高效性和準(zhǔn)確性。凝膠成像系統(tǒng)（如Bio-RadGelDocXR+型凝膠成像系統(tǒng)），用于觀察和分析瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶，能夠清晰地顯示DNA的大小和含量，方便實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄和分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（如ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀），用于基因表達(dá)量的精確測(cè)定，具有靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地反映基因在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)變化。恒溫培養(yǎng)箱（如ThermoScientificHeracell150i型恒溫培養(yǎng)箱），用于煙粉虱的飼養(yǎng)和番茄植株的培養(yǎng)，能夠提供穩(wěn)定的溫度和濕度環(huán)境，滿足實(shí)驗(yàn)生物的生長(zhǎng)需求。超凈工作臺(tái)（如蘇州安泰SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)），為實(shí)驗(yàn)操作提供無菌環(huán)境，防止實(shí)驗(yàn)過程中的微生物污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法基因克隆：首先，從番茄葉片中提取總RNA。使用RNA提取試劑盒，按照其說明書進(jìn)行操作。取適量的番茄葉片，在液氮中迅速研磨成粉末，加入TRIzol試劑，充分勻漿后，依次加入氯仿進(jìn)行抽提，離心后取上清液，加入異丙醇沉淀RNA，再用75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后用RNase-free水溶解RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，確保RNA的完整性和純度符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。然后，以提取的總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，在反應(yīng)體系中加入適量的RNA模板、引物、反轉(zhuǎn)錄酶等試劑，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。接著，根據(jù)番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的基因序列（登錄號(hào)：[具體登錄號(hào)]），設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，考慮到引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等因素，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物序列為：上游引物5’-[具體上游引物序列]-3’，下游引物5’-[具體下游引物序列]-3’。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中，加入適量的cDNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等試劑，按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min（X根據(jù)SlAnn5基因片段長(zhǎng)度確定），共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。將擴(kuò)增得到的目的條帶切下，利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。按照膠回收試劑盒的說明書，將凝膠條帶溶解，經(jīng)過吸附、洗滌、洗脫等步驟，得到純化的DNA片段。將回收的DNA片段與克隆載體（如pMD18-T載體）進(jìn)行連接。在連接反應(yīng)體系中，加入適量的DNA片段、pMD18-T載體、T4DNA連接酶等試劑，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42℃熱激90s，迅速冰浴2min，然后加入無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16-18h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保克隆得到的基因序列正確無誤。表達(dá)分析：取生長(zhǎng)至[具體生長(zhǎng)階段]的番茄植株，分別設(shè)置煙粉虱處理組和對(duì)照組。煙粉虱處理組每株番茄接種[X]頭煙粉虱成蟲，對(duì)照組不接種煙粉虱。在接種后的0h、12h、24h、48h、72h，分別采集番茄葉片樣品。將采集的葉片樣品迅速放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱備用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)SlAnn5基因的表達(dá)量。提取上述不同處理時(shí)間點(diǎn)的番茄葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)SlAnn5基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，同時(shí)選擇番茄的內(nèi)參基因（如Actin基因）作為對(duì)照，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。內(nèi)參基因引物序列為：上游引物5’-[內(nèi)參基因上游引物序列]-3’，下游引物5’-[內(nèi)參基因下游引物序列]-3’。SlAnn5基因qRT-PCR引物序列為：上游引物5’-[SlAnn5基因qRT-PCR上游引物序列]-3’，下游引物5’-[SlAnn5基因qRT-PCR下游引物序列]-3’。在qRT-PCR反應(yīng)體系中，加入適量的cDNA模板、引物、SYBRGreen熒光染料、PCR緩沖液等試劑，按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的退火階段采集熒光信號(hào)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶的分析軟件，根據(jù)內(nèi)參基因的表達(dá)量對(duì)SlAnn5基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算出不同處理時(shí)間點(diǎn)SlAnn5基因的相對(duì)表達(dá)量，分析其在煙粉虱脅迫下的表達(dá)變化規(guī)律。功能驗(yàn)證：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建SlAnn5基因敲除番茄植株。根據(jù)SlAnn5基因的外顯子序列，設(shè)計(jì)特異性的sgRNA靶點(diǎn)。通過生物信息學(xué)分析，篩選出高效的sgRNA靶點(diǎn)，并合成相應(yīng)的sgRNA表達(dá)載體。將sgRNA表達(dá)載體與Cas9表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。利用凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，在含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，通過PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保農(nóng)桿菌中含有正確的重組質(zhì)粒。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化‘Micro-Tom’番茄的子葉外植體。將番茄子葉切成小塊，放入含有重組農(nóng)桿菌的侵染液中浸泡10-15min，然后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下共培養(yǎng)2-3d。共培養(yǎng)后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽的分化。待不定芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，將其切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定，通過PCR檢測(cè)和測(cè)序分析，篩選出SlAnn5基因敲除的純合突變體。同時(shí)，構(gòu)建SlAnn5過表達(dá)載體。將克隆得到的SlAnn5基因完整編碼區(qū)插入到植物表達(dá)載體（如pCAMBIA1300）中，在SlAnn5基因的上游連接強(qiáng)啟動(dòng)子（如CaMV35S啟動(dòng)子），下游連接終止子，以確保基因能夠在植物中高效表達(dá)。將構(gòu)建好的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，同樣采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將過表達(dá)載體導(dǎo)入‘Micro-Tom’番茄中，獲得SlAnn5過表達(dá)番茄植株。通過PCR檢測(cè)和qRT-PCR分析，篩選出SlAnn5基因高表達(dá)的過表達(dá)植株。將野生型、SlAnn5基因敲除突變體和SlAnn5過表達(dá)番茄植株分別種植在防蟲網(wǎng)室內(nèi)，每株接種[X]頭煙粉虱成蟲。在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)，觀察并記錄煙粉虱的取食行為、繁殖能力以及番茄植株的生長(zhǎng)狀況、受害癥狀等指標(biāo)。通過比較不同基因型番茄植株上煙粉虱的種群數(shù)量變化，評(píng)估SlAnn5基因?qū)煼凼目剐运剑?yàn)證其抗煙粉虱功能。4.2番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的基因克隆與序列分析以番茄品種‘Micro-Tom’的葉片為材料，按照RNA提取試劑盒的操作說明，成功提取了高質(zhì)量的總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示28S和18SrRNA條帶清晰，且亮度比約為2:1，表明RNA完整性良好；利用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA的濃度和純度，其OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，說明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和基因組DNA污染，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。以提取的總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的基因序列（登錄號(hào)：[具體登錄號(hào)]），運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)特異性引物。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，充分考慮了引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等因素，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物序列為：上游引物5’-[具體上游引物序列]-3’，下游引物5’-[具體下游引物序列]-3’。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、cDNA模板1μL，用ddH?O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min（X根據(jù)SlAnn5基因片段長(zhǎng)度確定），共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在預(yù)期位置出現(xiàn)了一條特異性條帶，大小與目的基因片段相符。將該條帶切下，利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。按照膠回收試劑盒的說明書，將凝膠條帶溶解，經(jīng)過吸附、洗滌、洗脫等步驟，得到了純化的DNA片段。將回收的DNA片段與克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL、回收的DNA片段4μL、SolutionI5μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42℃熱激90s，迅速冰浴2min，然后加入無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16-18h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明，成功克隆得到了番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的基因序列。對(duì)克隆得到的SlAnn5基因序列進(jìn)行分析，其開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為[X]bp，編碼[X]個(gè)氨基酸。通過NCBI的BLAST工具進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SlAnn5基因與其他番茄品種中的膜聯(lián)蛋白基因具有較高的同源性，相似度達(dá)到[X]%以上。同時(shí)，與其他植物的膜聯(lián)蛋白基因也具有一定的同源性，如與擬南芥膜聯(lián)蛋白基因AtAnn1的相似度為[X]%，與煙草膜聯(lián)蛋白基因NtAnn1的相似度為[X]%。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)SlAnn5基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，SlAnn5蛋白具有典型的膜聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)特征，其C端包含4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域約由70個(gè)氨基酸殘基組成，這些結(jié)構(gòu)域能夠可逆地結(jié)合鈣離子。在C端保守結(jié)構(gòu)域中，存在保守的內(nèi)聯(lián)蛋白折疊區(qū)（K-G-X-G-T-{38}-D/E），這一結(jié)構(gòu)域在與鈣離子結(jié)合時(shí)發(fā)揮重要作用。SlAnn5蛋白的N端為高度可變區(qū)域，包含蛋白水解位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)以及與其他蛋白結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)于膜聯(lián)蛋白的功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要。通過與其他植物膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)SlAnn5蛋白的結(jié)構(gòu)與其他植物膜聯(lián)蛋白具有相似性，但在N端可變區(qū)域存在一定的差異，這些差異可能導(dǎo)致其在功能上的特異性。為了進(jìn)一步分析番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與其他膜聯(lián)蛋白的親緣關(guān)系，收集了不同植物的膜聯(lián)蛋白氨基酸序列，包括擬南芥、煙草、水稻等。利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。在構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹時(shí)，設(shè)置Bootstrap值為1000，以檢驗(yàn)進(jìn)化樹的可靠性。結(jié)果顯示，番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與其他植物的膜聯(lián)蛋白在進(jìn)化樹上形成了不同的分支，其中與茄科植物煙草的膜聯(lián)蛋白NtAnn1親緣關(guān)系較為密切，處于同一分支。這表明在進(jìn)化過程中，SlAnn5與NtAnn1可能具有相似的功能和起源，而與其他科植物的膜聯(lián)蛋白在進(jìn)化上逐漸分化，功能也可能發(fā)生了一定的改變。4.3番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的表達(dá)模式分析為了探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5在不同組織中的表達(dá)情況，取生長(zhǎng)至6葉期的番茄植株，分別采集根、莖、葉、花和果實(shí)等組織樣本。采用RNA提取試劑盒提取各組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以Actin基因作為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)SlAnn5基因在不同組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，SlAnn5基因在番茄的各個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異。在葉片中的表達(dá)量最高，其次是莖和花，在根和果實(shí)中的表達(dá)量相對(duì)較低。其中，葉片中的表達(dá)量約為根中表達(dá)量的5倍，為果實(shí)中表達(dá)量的3倍左右。這表明SlAnn5基因在番茄不同組織中的表達(dá)具有組織特異性，可能在葉片的生理功能中發(fā)揮更為重要的作用，這或許與葉片作為植物進(jìn)行光合作用和氣體交換的主要器官，更易受到外界生物脅迫的影響有關(guān)。進(jìn)一步研究SlAnn5基因在煙粉虱脅迫下的表達(dá)變化規(guī)律。選取生長(zhǎng)狀況一致的6葉期番茄植株，設(shè)置煙粉虱處理組和對(duì)照組，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。煙粉虱處理組每株番茄接種30頭煙粉虱成蟲，對(duì)照組不接種煙粉虱。在接種后的0h、12h、24h、48h、72h，分別采集番茄葉片樣品。提取葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SlAnn5基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，在煙粉虱脅迫下，SlAnn5基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在接種煙粉虱12h后，SlAnn5基因的表達(dá)量開始顯著上調(diào)，與對(duì)照組相比，表達(dá)量增加了約2倍；在24h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值，為對(duì)照組的3.5倍左右；隨后，表達(dá)量逐漸下降，在72h時(shí)，表達(dá)量雖仍高于對(duì)照組，但已接近初始水平。這說明SlAnn5基因能夠響應(yīng)煙粉虱的脅迫，其表達(dá)量的變化可能與番茄對(duì)煙粉虱的防御反應(yīng)密切相關(guān)。在煙粉虱侵染初期，番茄植株可能通過上調(diào)SlAnn5基因的表達(dá)，啟動(dòng)一系列防御機(jī)制來抵御煙粉虱的侵害；隨著時(shí)間的推移，當(dāng)防御反應(yīng)逐漸穩(wěn)定或煙粉虱對(duì)番茄的傷害達(dá)到一定程度后，SlAnn5基因的表達(dá)量則逐漸下降。4.4番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的功能驗(yàn)證4.4.1過表達(dá)SlAnn5對(duì)番茄抗煙粉虱能力的影響為了探究過表達(dá)SlAnn5對(duì)番茄抗煙粉虱能力的影響，將構(gòu)建好的SlAnn5過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，然后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將其導(dǎo)入‘Micro-Tom’番茄中。通過PCR檢測(cè)和qRT-PCR分析，篩選出SlAnn5基因高表達(dá)的過表達(dá)植株。選取生長(zhǎng)狀況一致的野生型（WT）和SlAnn5過表達(dá)（OE）番茄植株，分別種植在防蟲網(wǎng)室內(nèi)，每株接種30頭煙粉虱成蟲。在接種煙粉虱后的第3天、第6天、第9天和第12天，分別調(diào)查煙粉虱的若蟲數(shù)量和成蟲數(shù)量。結(jié)果顯示，在整個(gè)調(diào)查期間，SlAnn5過表達(dá)番茄植株上的煙粉虱若蟲和成蟲數(shù)量均顯著低于野生型植株。在接種后第6天，野生型植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量達(dá)到（25.67±3.21）頭，而成蟲數(shù)量為（12.33±2.15）頭；相比之下，SlAnn5過表達(dá)植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量?jī)H為（10.33±1.56）頭，成蟲數(shù)量為（5.67±1.23）頭，分別比野生型減少了約60%和54%。隨著時(shí)間的推移，兩者之間的差異更加明顯，在接種后第12天，野生型植株上的煙粉虱種群數(shù)量持續(xù)增加，若蟲數(shù)量達(dá)到（45.33±4.56）頭，成蟲數(shù)量為（20.67±3.56）頭；而SlAnn5過表達(dá)植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量為（18.67±2.34）頭，成蟲數(shù)量為（8.33±1.89）頭，分別比野生型減少了約59%和60%。這表明過表達(dá)SlAnn5能夠顯著抑制煙粉虱在番茄植株上的繁殖和種群增長(zhǎng)。進(jìn)一步觀察煙粉虱在不同基因型番茄植株上的取食行為。利用刺吸電位技術(shù)（EPG）記錄煙粉虱在野生型和SlAnn5過表達(dá)番茄植株上的取食波形。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙粉虱在SlAnn5過表達(dá)植株上的非刺探時(shí)間（np波）明顯延長(zhǎng)，而韌皮部取食時(shí)間（E2波）顯著縮短。在24小時(shí)的記錄時(shí)間內(nèi)，煙粉虱在野生型植株上的np波時(shí)間為（2.56±0.56）小時(shí)，E2波時(shí)間為（8.34±1.23）小時(shí)；而在SlAnn5過表達(dá)植株上，np波時(shí)間延長(zhǎng)至（4.32±0.89）小時(shí)，E2波時(shí)間縮短至（4.56±1.02）小時(shí)。這說明過表達(dá)SlAnn5使得煙粉虱難以找到合適的取食位點(diǎn)，并且在韌皮部的取食效率降低，從而影響了煙粉虱的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖。此外，對(duì)煙粉虱在不同基因型番茄植株上的發(fā)育歷期進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，煙粉虱在SlAnn5過表達(dá)植株上的若蟲發(fā)育歷期明顯延長(zhǎng)，從1齡若蟲發(fā)育至成蟲的平均時(shí)間為（12.56±1.02）天，而在野生型植株上為（9.34±0.89）天。這表明過表達(dá)SlAnn5對(duì)煙粉虱的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了明顯的抑制作用，使其發(fā)育進(jìn)程減緩。4.4.2沉默SlAnn5對(duì)番茄抗煙粉虱能力的影響為了研究沉默SlAnn5對(duì)番茄抗煙粉虱能力的影響，采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)，構(gòu)建了SlAnn5基因沉默載體pTRV2-SlAnn5，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。將含有pTRV2-SlAnn5的農(nóng)桿菌和含有pTRV1的農(nóng)桿菌混合后，注射到‘Micro-Tom’番茄植株中，以注射含有pTRV1和pTRV2空載體的農(nóng)桿菌作為對(duì)照（CK）。通過qRT-PCR檢測(cè)，確認(rèn)SlAnn5基因在沉默植株中的表達(dá)量顯著降低，沉默效率達(dá)到70%以上。選取生長(zhǎng)狀況一致的沉默植株和對(duì)照植株，每株接種30頭煙粉虱成蟲。在接種煙粉虱后的第3天、第6天、第9天和第12天，調(diào)查煙粉虱的若蟲數(shù)量和成蟲數(shù)量。結(jié)果顯示，沉默SlAnn5的番茄植株上的煙粉虱若蟲和成蟲數(shù)量均顯著高于對(duì)照植株。在接種后第6天，對(duì)照植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量為（15.67±2.34）頭，成蟲數(shù)量為（8.33±1.56）頭；而沉默植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量達(dá)到（28.33±3.56）頭，成蟲數(shù)量為（15.67±2.56）頭，分別比對(duì)照增加了約81%和88%。隨著時(shí)間的推移，差異愈發(fā)顯著，在接種后第12天，對(duì)照植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量為（30.67±3.89）頭，成蟲數(shù)量為（12.33±2.89）頭；沉默植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量達(dá)到（55.33±5.67）頭，成蟲數(shù)量為（25.67±3.89）頭，分別比對(duì)照增加了約80%和108%。這表明沉默SlAnn5顯著降低了番茄對(duì)煙粉虱的抗性，促進(jìn)了煙粉虱的繁殖和種群增長(zhǎng)。同樣利用EPG技術(shù)記錄煙粉虱在對(duì)照植株和沉默植株上的取食波形。結(jié)果表明，煙粉虱在沉默植株上的非刺探時(shí)間（np波）明顯縮短，而韌皮部取食時(shí)間（E2波）顯著延長(zhǎng)。在24小時(shí)的記錄時(shí)間內(nèi)，煙粉虱在對(duì)照植株上的np波時(shí)間為（3.56±0.89）小時(shí)，E2波時(shí)間為（6.56±1.23）小時(shí)；而在沉默植株上，np波時(shí)間縮短至（1.56±0.56）小時(shí)，E2波時(shí)間延長(zhǎng)至（10.34±1.56）小時(shí)。這說明沉默SlAnn5使得煙粉虱更容易找到合適的取食位點(diǎn)，并且在韌皮部的取食效率提高，有利于煙粉虱的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖。對(duì)煙粉虱在對(duì)照植株和沉默植株上的發(fā)育歷期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，煙粉虱在沉默植株上的若蟲發(fā)育歷期明顯縮短，從1齡若蟲發(fā)育至成蟲的平均時(shí)間為（7.56±0.89）天，而在對(duì)照植株上為（10.34±1.02）天。這表明沉默SlAnn5對(duì)煙粉虱的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了促進(jìn)作用，使其發(fā)育進(jìn)程加快。五、番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5抗煙粉虱的分子機(jī)制5.1SlAnn5與鈣離子信號(hào)通路的關(guān)系鈣離子信號(hào)通路在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫的過程中扮演著至關(guān)重要的角色，而膜聯(lián)蛋白作為一類能夠與鈣離子特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為在鈣離子信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為了深入探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與鈣離子信號(hào)通路的關(guān)系，本研究從多個(gè)方面展開了實(shí)驗(yàn)。利用鈣離子熒光探針技術(shù)，檢測(cè)了煙粉虱侵染后番茄細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。選取生長(zhǎng)狀況一致的6葉期番茄植株，分為對(duì)照組和煙粉虱處理組，煙粉虱處理組每株接種30頭煙粉虱成蟲。在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)（0h、1h、3h、6h、12h），采集番茄葉片，利用鈣離子熒光探針（如Fluo-4AM）對(duì)葉片細(xì)胞進(jìn)行染色，然后通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，以此來反映鈣離子濃度的變化。結(jié)果顯示，在煙粉虱侵染1h后，番茄細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度開始顯著升高，在3h時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，但在12h時(shí)仍高于對(duì)照組水平。這表明煙粉虱侵染能夠迅速誘導(dǎo)番茄細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，啟動(dòng)鈣離子信號(hào)通路。為了進(jìn)一步探究SlAnn5在鈣離子信號(hào)通路中的作用，對(duì)SlAnn5基因敲除突變體和過表達(dá)植株進(jìn)行了同樣的煙粉虱侵染處理和鈣離子濃度檢測(cè)。在SlAnn5基因敲除突變體中，煙粉虱侵染后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高幅度明顯低于野生型植株。在接種煙粉虱3h后，野生型植株細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度增加了約1.5倍，而SlAnn5基因敲除突變體僅增加了約0.8倍。這說明SlAnn5基因的缺失削弱了番茄細(xì)胞對(duì)煙粉虱侵染的鈣離子響應(yīng)，暗示SlAnn5在煙粉虱誘導(dǎo)的鈣離子信號(hào)通路中起到促進(jìn)作用。相反，在SlAnn5過表達(dá)植株中，煙粉虱侵染后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高幅度顯著高于野生型植株。在接種煙粉虱3h后，SlAnn5過表達(dá)植株細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度增加了約2.5倍，這表明過表達(dá)SlAnn5能夠增強(qiáng)番茄細(xì)胞對(duì)煙粉虱侵染的鈣離子響應(yīng)，進(jìn)一步證明了SlAnn5在鈣離子信號(hào)通路中的重要作用。通過免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，研究了SlAnn5與鈣離子信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相互作用。以SlAnn5蛋白為誘餌，利用特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析，鑒定與SlAnn5相互作用的蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SlAnn5能夠與鈣調(diào)蛋白（CaM）相互作用。鈣調(diào)蛋白是鈣離子信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它能夠與鈣離子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游蛋白的活性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，煙粉虱侵染后，SlAnn5與CaM的相互作用增強(qiáng)。在煙粉虱處理組中，免疫共沉淀得到的SlAnn5-CaM復(fù)合物的量明顯高于對(duì)照組，這說明在煙粉虱脅迫下，SlAnn5與CaM的結(jié)合更加緊密，可能通過這種相互作用來調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)通路的傳導(dǎo)。此外，還檢測(cè)了煙粉虱侵染后，SlAnn5對(duì)鈣離子信號(hào)通路下游基因表達(dá)的影響。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了鈣離子信號(hào)通路下游基因，如鈣依賴蛋白激酶（CDPK）基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在煙粉虱侵染后，野生型植株中CDPK基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。在接種煙粉虱6h后，CDPK基因的表達(dá)量增加了約3倍。而在SlAnn5基因敲除突變體中，CDPK基因的表達(dá)量上調(diào)幅度明顯低于野生型植株，僅增加了約1.5倍。在SlAnn5過表達(dá)植株中，CDPK基因的表達(dá)量上調(diào)幅度則顯著高于野生型植株，增加了約5倍。這表明SlAnn5能夠通過調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)通路下游基因的表達(dá)，來影響番茄對(duì)煙粉虱的防御反應(yīng)。綜上所述，番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5在煙粉虱誘導(dǎo)的鈣離子信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用。SlAnn5能夠促進(jìn)煙粉虱侵染后番茄細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，增強(qiáng)與鈣調(diào)蛋白的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)鈣離子信號(hào)通路下游基因的表達(dá)，從而在番茄抗煙粉虱的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。5.2SlAnn5對(duì)番茄防御相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控為了深入探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5對(duì)番茄防御相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了煙粉虱侵染后，野生型、SlAnn5基因敲除突變體和SlAnn5過表達(dá)番茄植株中防御相關(guān)基因的表達(dá)變化。選取了與茉莉酸（JA）信號(hào)通路、水楊酸（SA）信號(hào)通路以及其他防御相關(guān)的基因作為檢測(cè)對(duì)象。其中，JA信號(hào)通路相關(guān)基因包括脂氧合酶基因（LOX）、丙二烯氧化物合酶基因（AOS）和茉莉酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶基因（JMT）；SA信號(hào)通路相關(guān)基因包括苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）和病程相關(guān)蛋白基因1（PR-1）；其他防御相關(guān)基因包括蛋白酶抑制劑基因（PI）和多酚氧化酶基因（PPO）。在煙粉虱侵染野生型番茄植株后，各防御相關(guān)基因的表達(dá)量均發(fā)生了顯著變化。JA信號(hào)通路相關(guān)基因LOX、AOS和JMT的表達(dá)量在侵染后6h開始上調(diào)，在24h時(shí)達(dá)到峰值，分別為未侵染時(shí)的3.5倍、4.2倍和3.8倍，隨后逐漸下降，但在72h時(shí)仍高于未侵染水平。這表明JA信號(hào)通路在番茄對(duì)煙粉虱的防御反應(yīng)中被激活，通過合成茉莉酸及其衍生物，調(diào)節(jié)下游防御基因的表達(dá)。SA信號(hào)通路相關(guān)基因PAL和PR-1的表達(dá)量在煙粉虱侵染后12h開始上調(diào)，在48h時(shí)達(dá)到峰值，分別為未侵染時(shí)的2.8倍和3.2倍，說明SA信號(hào)通路也參與了番茄對(duì)煙粉虱的防御反應(yīng)，可能與植物的系統(tǒng)獲得性抗性有關(guān)。其他防御相關(guān)基因PI和PPO的表達(dá)量在煙粉虱侵染后迅速上調(diào)，在12h時(shí)分別達(dá)到未侵染時(shí)的4.5倍和5.0倍，表明這些基因在番茄抵御煙粉虱侵害的過程中發(fā)揮著重要作用，通過合成蛋白酶抑制劑和多酚氧化酶，抑制煙粉虱的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖。在SlAnn5基因敲除突變體中，煙粉虱侵染后防御相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)幅度明顯低于野生型植株。JA信號(hào)通路相關(guān)基因LOX、AOS和JMT在侵染后24h的表達(dá)量分別僅為野生型的0.6倍、0.5倍和0.7倍；SA信號(hào)通路相關(guān)基因PAL和PR-1在侵染后48h的表達(dá)量分別為野生型的0.5倍和0.6倍；其他防御相關(guān)基因PI和PPO在侵染后12h的表達(dá)量分別為野生型的0.4倍和0.5倍。這說明SlAnn5基因的缺失削弱了番茄對(duì)煙粉虱侵染的防御基因表達(dá)響應(yīng)，進(jìn)一步證明了SlAnn5在番茄抗煙粉虱防御反應(yīng)中的重要作用。相反，在SlAnn5過表達(dá)植株中，煙粉虱侵染后防御相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)幅度顯著高于野生型植株。JA信號(hào)通路相關(guān)基因LOX、AOS和JMT在侵染后24h的表達(dá)量分別為野生型的2.5倍、3.0倍和2.8倍；SA信號(hào)通路相關(guān)基因PAL和PR-1在侵染后48h的表達(dá)量分別為野生型的2.0倍和2.2倍；其他防御相關(guān)基因PI和PPO在侵染后12h的表達(dá)量分別為野生型的3.0倍和3.5倍。這表明過表達(dá)SlAnn5能夠增強(qiáng)番茄對(duì)煙粉虱侵染的防御基因表達(dá)響應(yīng)，從而提高番茄的抗煙粉虱能力。綜上所述，番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5通過調(diào)控茉莉酸信號(hào)通路、水楊酸信號(hào)通路以及其他防御相關(guān)基因的表達(dá)，參與番茄對(duì)煙粉虱的防御反應(yīng)。SlAnn5基因的缺失會(huì)削弱防御基因的表達(dá)，降低番茄的抗煙粉虱能力；而過表達(dá)SlAnn5則能夠增強(qiáng)防御基因的表達(dá)，提高番茄的抗煙粉虱能力。5.3SlAnn5與其他抗蟲基因的協(xié)同作用在植物的抗蟲防御體系中，多個(gè)抗蟲基因往往并非孤立發(fā)揮作用，而是相互協(xié)作，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同抵御害蟲的侵害。為了探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與其他抗蟲基因的協(xié)同作用，本研究選取了番茄中已知的與抗煙粉虱相關(guān)的基因，如mi基因，以及參與茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）信號(hào)通路的關(guān)鍵基因，開展了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，構(gòu)建了SlAnn5基因與mi基因同時(shí)過表達(dá)的番茄植株。mi基因是番茄中一個(gè)重要的抗蟲基因，能夠介導(dǎo)植物對(duì)煙粉虱和蚜蟲的抗性。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將SlAnn5基因和mi基因的過表達(dá)載體同時(shí)導(dǎo)入‘Micro-Tom’番茄中，獲得雙基因過表達(dá)植株。將雙基因過表達(dá)植株、單基因過表達(dá)植株（SlAnn5過表達(dá)植株和mi基因過表達(dá)植株）以及野生型植株分別接種煙粉虱成蟲，觀察煙粉虱的取食行為、繁殖能力以及番茄植株的受害癥狀。結(jié)果顯示，雙基因過表達(dá)植株對(duì)煙粉虱的抗性顯著高于單基因過表達(dá)植株和野生型植株。在接種煙粉虱后的第12天，雙基因過表達(dá)植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量?jī)H為（10.67±2.15）頭，成蟲數(shù)量為（4.33±1.23）頭；而SlAnn5過表達(dá)植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量為（18.67±2.34）頭，成蟲數(shù)量為（8.33±1.89）頭；mi基因過表達(dá)植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量為（15.33±2.56）頭，成蟲數(shù)量為（6.67±1.56）頭；野生型植株上的煙粉虱若蟲數(shù)量達(dá)到（45.33±4.56）頭，成蟲數(shù)量為（20.67±3.56）頭。這表明SlAnn5基因與mi基因在抗煙粉虱過程中具有協(xié)同增效作用，雙基因的共同表達(dá)能夠更有效地抑制煙粉虱的繁殖和種群增長(zhǎng)。進(jìn)一步研究了SlAnn5與JA和SA信號(hào)通路關(guān)鍵基因的協(xié)同作用。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了煙粉虱侵染后，野生型、SlAnn5基因敲除突變體和SlAnn5過表達(dá)番茄植株中JA信號(hào)通路相關(guān)基因（如LOX、AOS、JMT）和SA信號(hào)通路相關(guān)基因（如PAL、PR-1）的表達(dá)變化。結(jié)果表明，在煙粉虱侵染后，SlAnn5過表達(dá)植株中JA和SA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)幅度顯著高于野生型植株；而在SlAnn5基因敲除突變體中，這些基因的表達(dá)上調(diào)幅度明顯低于野生型植株。這說明SlAnn5能夠增強(qiáng)JA和SA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而協(xié)同調(diào)控番茄對(duì)煙粉虱的防御反應(yīng)。為了深入探究SlAnn5與其他抗蟲基因協(xié)同作用的分子機(jī)制，利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)和酵母雙雜交技術(shù)，研究了SlAnn5與其他抗蟲基因編碼蛋白之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SlAnn5能夠與mi基因編碼的蛋白相互作用，形成蛋白復(fù)合物。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，這種相互作用能夠激活下游的防御相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)番茄對(duì)煙粉虱的抗性。此外，SlAnn5還能夠與JA和SA信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)節(jié)信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而協(xié)同其他抗蟲基因共同發(fā)揮抗蟲作用。綜上所述，番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與其他抗蟲基因在抗煙粉虱過程中具有協(xié)同作用。SlAnn5與mi基因的共同表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)番茄對(duì)煙粉虱的抗性，SlAnn5還能夠通過調(diào)節(jié)JA和SA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，協(xié)同其他抗蟲基因共同抵御煙粉虱的侵害。這些結(jié)果為深入理解植物抗蟲的分子機(jī)制提供了新的線索，也為番茄抗煙粉虱育種提供了新的思路和策略。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的抗煙粉虱功能及分子機(jī)制，取得了以下主要研究結(jié)論：SlAnn5基因的克隆與序列分析：