枸杞籽粕ACE抑制肽：篩選、鑒定與作用機(jī)理的深度解析一、引言1.1研究背景高血壓作為一種全球性的公共健康問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球約有18億成年人患有高血壓，且這一數(shù)字仍在持續(xù)增長(zhǎng)。高血壓是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，如冠心病、腦卒中等，這些疾病不僅給患者帶來(lái)了極大的痛苦，也給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在中國(guó)，高血壓的患病率也呈上升趨勢(shì)，根據(jù)最新的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)18歲及以上成人高血壓患病率為27.9%，患病人數(shù)已超過(guò)2.45億。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）在血壓調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。它能夠催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈收縮血管作用的血管緊張素II，同時(shí)降解具有舒張血管作用的緩激肽，從而導(dǎo)致血壓升高。因此，抑制ACE的活性成為預(yù)防和治療高血壓的重要策略。目前，臨床上常用的ACE抑制劑類降壓藥物雖然能夠有效地降低血壓，但往往會(huì)帶來(lái)一些不良反應(yīng)，如干咳、皮疹、味覺(jué)障礙等，長(zhǎng)期使用還可能對(duì)肝腎功能造成損害。食源性ACE抑制肽因其具有天然、安全、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。這些活性肽可以從各種食物蛋白質(zhì)中通過(guò)酶解、發(fā)酵等方法獲得，如乳蛋白、大豆蛋白、魚肉蛋白等。它們不僅能夠有效地抑制ACE的活性，降低血壓，還具有其他多種生理功能，如抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等，對(duì)人體健康具有積極的影響。枸杞作為一種傳統(tǒng)的藥食同源植物，在我國(guó)已有數(shù)千年的食用和藥用歷史。它富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，如枸杞多糖、類胡蘿卜素、黃酮類化合物、蛋白質(zhì)等，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等多種生物活性。枸杞籽粕是枸杞籽榨油后的剩余物，通常被作為飼料或廢棄物處理，這不僅造成了資源的浪費(fèi)，還可能對(duì)環(huán)境造成污染。實(shí)際上，枸杞籽粕中含有豐富的蛋白質(zhì)，其含量可達(dá)20%-30%，且氨基酸組成較為平衡，是一種潛在的優(yōu)質(zhì)蛋白資源。從枸杞籽粕中提取ACE抑制肽，不僅可以實(shí)現(xiàn)資源的高效利用，還為開發(fā)新型降壓功能食品提供了新的途徑。近年來(lái)，關(guān)于枸杞籽粕ACE抑制肽的研究逐漸增多，但仍存在一些問(wèn)題。例如，目前對(duì)枸杞籽粕ACE抑制肽的篩選和鑒定方法還不夠完善，導(dǎo)致一些具有潛在活性的肽段被忽視；對(duì)其作用機(jī)理的研究也不夠深入，尚未完全闡明其降壓的分子機(jī)制。此外，枸杞籽粕ACE抑制肽的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還面臨著一些挑戰(zhàn)，如提取成本高、穩(wěn)定性差、生物利用率低等。因此，深入開展枸杞籽粕ACE抑制肽的篩選鑒定及作用機(jī)理研究，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的和意義本研究旨在從枸杞籽粕中篩選和鑒定出具有高活性的ACE抑制肽，并深入揭示其作用機(jī)理，為開發(fā)新型、安全、有效的降壓功能食品提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，深入研究枸杞籽粕ACE抑制肽的篩選鑒定方法和作用機(jī)理，有助于豐富食源性活性肽的研究?jī)?nèi)容，完善其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理論體系，為進(jìn)一步開發(fā)和利用其他植物蛋白資源提供參考。同時(shí)，通過(guò)揭示枸杞籽粕ACE抑制肽的降壓機(jī)制，也能夠?yàn)楦哐獕旱姆乐翁峁┬碌乃悸泛头椒ā膶?shí)際應(yīng)用角度來(lái)看，開發(fā)枸杞籽粕ACE抑制肽具有廣闊的市場(chǎng)前景。隨著人們健康意識(shí)的提高，對(duì)天然、安全、有效的降壓產(chǎn)品的需求日益增加。枸杞籽粕ACE抑制肽作為一種新型的降壓功能成分，可應(yīng)用于功能性食品、保健品等領(lǐng)域，為高血壓患者提供了一種新的選擇。此外，本研究還能夠提高枸杞籽粕的附加值，促進(jìn)枸杞產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。二、枸杞籽粕ACE抑制肽的篩選2.1材料與儀器枸杞籽粕原料來(lái)源于寧夏某枸杞加工企業(yè)，經(jīng)干燥、粉碎后過(guò)80目篩備用，以確保原料的粒度均勻，利于后續(xù)的酶解反應(yīng)。選用的蛋白酶包括堿性蛋白酶（酶活力為20000U/g）、中性蛋白酶（酶活力為15000U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力為10000U/g），這些蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn)，能夠水解枸杞籽粕蛋白產(chǎn)生不同的肽段，增加篩選出高活性ACE抑制肽的可能性。化學(xué)試劑如三氯乙酸（分析純）、福林酚試劑、氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL，純度≥98%）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE，從豬肺中提取，酶活力為10U/mg）、馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）等，用于酶解反應(yīng)、蛋白質(zhì)含量測(cè)定、ACE抑制活性測(cè)定等實(shí)驗(yàn)步驟。實(shí)驗(yàn)儀器主要有高速離心機(jī)（型號(hào)為TDL-50B，轉(zhuǎn)速范圍0-15000r/min，用于分離酶解產(chǎn)物和殘?jiān)瑢?shí)現(xiàn)固液分離，為后續(xù)的肽段提取和分析提供基礎(chǔ)）、酶標(biāo)儀（型號(hào)為MultiskanGO，可在340nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度測(cè)定，用于快速、準(zhǔn)確地測(cè)定ACE抑制活性，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中產(chǎn)物的生成量來(lái)評(píng)估抑制肽的活性）、恒溫水浴鍋（型號(hào)為HH-6，控溫精度±0.1℃，為酶解反應(yīng)提供適宜的溫度環(huán)境，保證酶的活性和反應(yīng)的順利進(jìn)行）、電子天平（精度為0.0001g，用于準(zhǔn)確稱量原料、試劑和樣品，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性）、pH計(jì)（型號(hào)為PHS-3C，精度為±0.01pH，用于調(diào)節(jié)酶解反應(yīng)體系的pH值，維持酶的最佳活性條件）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號(hào)為RE-52AA，用于濃縮酶解產(chǎn)物，去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì)，提高肽段的濃度，便于后續(xù)的分離和鑒定）、冷凍干燥機(jī)（型號(hào)為FD-1A-50，能將濃縮后的肽溶液冷凍干燥成粉末狀，便于保存和進(jìn)一步分析）等。這些儀器設(shè)備在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中相互配合，為枸杞籽粕ACE抑制肽的篩選提供了必要的技術(shù)支持。2.2篩選方法2.2.1枸杞籽粕預(yù)處理將采購(gòu)的枸杞籽粕原料置于潔凈的容器中，用去離子水反復(fù)沖洗，以去除表面附著的雜質(zhì)、灰塵及殘留的油脂等。沖洗過(guò)程中，可適當(dāng)攪拌，確保沖洗充分，直至沖洗水清澈透明。隨后，將洗凈的枸杞籽粕轉(zhuǎn)移至鼓風(fēng)干燥箱中，設(shè)定溫度為50℃，干燥時(shí)間為6-8小時(shí)，使枸杞籽粕的水分含量降至10%以下，以利于后續(xù)的儲(chǔ)存和加工。干燥后的枸杞籽粕使用高速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎處理，粉碎過(guò)程中需注意控制粉碎時(shí)間和轉(zhuǎn)速，避免因溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。粉碎后，通過(guò)80目篩網(wǎng)進(jìn)行篩選，使枸杞籽粕粉末的粒度均勻，確保在后續(xù)的酶解過(guò)程中，底物能夠與酶充分接觸，提高酶解效率。去除雜質(zhì)可避免其對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾，如影響酶的活性、堵塞儀器等；調(diào)整粒度則能優(yōu)化酶解反應(yīng)的條件，提高反應(yīng)速率和產(chǎn)物得率。2.2.2酶解工藝選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)枸杞籽粕蛋白進(jìn)行酶解。在酶解溫度的優(yōu)化過(guò)程中，設(shè)置30℃、35℃、40℃、45℃、50℃五個(gè)溫度梯度，其他條件保持一致，分別進(jìn)行酶解反應(yīng)。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性先增加后降低，在45℃時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)闇囟冗^(guò)低時(shí)，酶的活性較低，反應(yīng)速率較慢；而溫度過(guò)高則可能導(dǎo)致酶蛋白變性失活。在pH值的優(yōu)化方面，對(duì)于堿性蛋白酶，設(shè)置pH值為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0；對(duì)于中性蛋白酶，設(shè)置pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；對(duì)于木瓜蛋白酶，設(shè)置pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶在pH值為9.0時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性最高；中性蛋白酶在pH值為7.5時(shí)表現(xiàn)最佳；木瓜蛋白酶則在pH值為6.0時(shí)酶解效果最好。底物濃度的優(yōu)化設(shè)置為5%、10%、15%、20%、25%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，底物濃度為15%時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性較高。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)低時(shí)，酶與底物的碰撞機(jī)會(huì)減少，反應(yīng)速率受限；而底物濃度過(guò)高，則可能導(dǎo)致酶的活性中心被過(guò)度占據(jù)，影響酶解效果。加酶量的優(yōu)化按照底物質(zhì)量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%進(jìn)行添加，結(jié)果表明，加酶量為1.5%時(shí)，酶解效果較為理想。加酶量過(guò)少，酶解反應(yīng)不完全；加酶量過(guò)多，則可能造成成本增加，且過(guò)量的酶可能對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)生不利影響。酶解時(shí)間的優(yōu)化分別設(shè)置為1h、2h、3h、4h、5h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶解3h時(shí)，ACE抑制活性達(dá)到較高水平，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，活性增加不明顯，且可能導(dǎo)致肽段過(guò)度水解，影響產(chǎn)物的活性和純度。綜合考慮各因素，確定堿性蛋白酶的最佳酶解條件為溫度45℃、pH值9.0、底物濃度15%、加酶量1.5%、酶解時(shí)間3h；中性蛋白酶的最佳酶解條件為溫度45℃、pH值7.5、底物濃度15%、加酶量1.5%、酶解時(shí)間3h；木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為溫度45℃、pH值6.0、底物濃度15%、加酶量1.5%、酶解時(shí)間3h。2.2.3活性測(cè)定方法采用分光光度法測(cè)定ACE抑制活性。其原理基于ACE能夠催化底物馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）水解生成馬尿酸和組氨酰亮氨酸，而馬尿酸在特定波長(zhǎng)下有吸收峰。當(dāng)加入ACE抑制肽時(shí)，ACE的活性受到抑制，生成的馬尿酸量減少，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中馬尿酸的生成量，即可計(jì)算出ACE抑制肽的活性。具體操作流程如下：首先配制0.1mol/L的硼酸緩沖液（pH8.3，含0.3mol/LNaCl），用于溶解底物、酶和樣品。將5mmol/L的HHL底物溶液、0.1U/mL的ACE溶液和待測(cè)定的樣品溶液按一定比例混合，其中HHL底物溶液取120μL，樣品溶液取20μL，混合均勻后，在37±0.5℃恒溫水浴中預(yù)熱3-5min，然后加入10μL的ACE溶液，充分混合后，于37℃保溫60min。反應(yīng)結(jié)束后，加入150μL的1mol/LHCl溶液終止反應(yīng)。以10μLpH8.3的硼酸緩沖液替代樣品溶液作為空白對(duì)照組，按照相同的操作步驟進(jìn)行反應(yīng)。將反應(yīng)液以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液于酶標(biāo)儀中，在228nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)公式計(jì)算ACE抑制活性：ACE抑制活性（%）=（A空白-A樣品）/A空白×100%，其中A空白為空白對(duì)照組的吸光度，A樣品為加入抑制劑組的吸光度。2.2.4篩選流程取預(yù)處理后的枸杞籽粕粉末，按照上述確定的最佳酶解條件，分別使用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后，將酶解液于90℃水浴中加熱15min進(jìn)行滅酶處理，以防止酶繼續(xù)作用導(dǎo)致肽段過(guò)度水解。滅酶后的酶解液在4℃、8000r/min的條件下離心20min，去除未酶解的殘?jiān)占锨逡骸２捎眯D(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行濃縮處理，去除大部分水分，然后將濃縮液通過(guò)冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，得到酶解產(chǎn)物干粉。將得到的酶解產(chǎn)物干粉用0.1mol/L的硼酸緩沖液（pH8.3，含0.3mol/LNaCl）溶解，配制成一定濃度的溶液，按照上述分光光度法測(cè)定其ACE抑制活性。分別測(cè)定不同酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性，并與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析。選擇ACE抑制活性較高的酶解產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，可采用超濾、凝膠過(guò)濾色譜、離子交換色譜等方法，將酶解產(chǎn)物中的不同肽段分離出來(lái)，再分別測(cè)定各分離組分的ACE抑制活性，從而篩選出具有高活性的ACE抑制肽組分。三、枸杞籽粕ACE抑制肽的鑒定3.1分離純化3.1.1初步分離將篩選得到的具有較高ACE抑制活性的枸杞籽粕酶解產(chǎn)物進(jìn)行初步分離，目的是去除其中的大分子雜質(zhì)和低分子量物質(zhì)，提高后續(xù)純化的效率和純度。首先采用超濾技術(shù)，利用不同孔徑的超濾膜對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離。選擇截留分子量為10kDa和3kDa的超濾膜，將酶解產(chǎn)物依次通過(guò)這兩種超濾膜。大于10kDa的大分子物質(zhì)，如未完全酶解的蛋白質(zhì)、多糖等，被10kDa超濾膜截留；而小于3kDa的小分子物質(zhì)，如氨基酸、小肽片段等，可通過(guò)3kDa超濾膜。收集3-10kDa分子量區(qū)間的超濾透過(guò)液，該部分溶液中富集了相對(duì)分子質(zhì)量較為適中的肽段，這些肽段具有較大的潛力成為高活性的ACE抑制肽。超濾過(guò)程在常溫下進(jìn)行，操作壓力控制在0.1-0.3MPa，以確保超濾過(guò)程的穩(wěn)定性和高效性。超濾完成后，將得到的3-10kDa超濾透過(guò)液進(jìn)行離心處理，在4℃、10000r/min的條件下離心30min，進(jìn)一步去除可能存在的微小顆粒雜質(zhì)，使溶液更加澄清，為后續(xù)的純化步驟提供更純凈的樣品。離心后的上清液即為初步分離得到的富含潛在ACE抑制肽的溶液，可用于進(jìn)一步的純化。3.1.2進(jìn)一步純化使用凝膠過(guò)濾色譜對(duì)初步分離得到的樣品進(jìn)行進(jìn)一步純化。凝膠過(guò)濾色譜的原理是利用凝膠介質(zhì)的分子篩效應(yīng)，根據(jù)分子大小的不同進(jìn)行分離。當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱時(shí)，分子體積大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動(dòng)，因此洗脫速度快，先被洗脫下來(lái)；而分子體積小的物質(zhì)可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙，在柱內(nèi)的停留時(shí)間長(zhǎng)，洗脫速度慢，后被洗脫下來(lái)。選用SephadexG-50凝膠柱，該凝膠柱適用于分離分子量范圍在1000-30000Da的物質(zhì)，與初步分離得到的3-10kDa肽段的分子量范圍相匹配。用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0）作為洗脫液，洗脫流速控制在0.5mL/min，收集不同洗脫時(shí)間的洗脫液，每管收集5mL。通過(guò)測(cè)定各管洗脫液在220nm波長(zhǎng)下的吸光度，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線確定含有ACE抑制肽的洗脫峰。將含有目標(biāo)肽段的洗脫峰合并，得到初步純化的ACE抑制肽溶液。離子交換色譜也是進(jìn)一步純化的重要手段。離子交換色譜是基于離子交換樹脂與樣品中離子之間的靜電相互作用進(jìn)行分離的。不同的肽段由于其所帶電荷的種類和數(shù)量不同，與離子交換樹脂的親和力也不同，在洗脫過(guò)程中會(huì)按照親和力的大小依次被洗脫下來(lái)。選用DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換樹脂，將初步純化的ACE抑制肽溶液上樣到已用0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.0）平衡好的離子交換柱上。先用平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，然后采用0-1mol/L的NaCl線性梯度洗脫，洗脫流速為1mL/min，收集不同洗脫體積的洗脫液，每管收集5mL。同樣通過(guò)測(cè)定各管洗脫液在220nm波長(zhǎng)下的吸光度，繪制洗脫曲線，確定含有ACE抑制肽的洗脫峰。將含有目標(biāo)肽段的洗脫峰合并，得到進(jìn)一步純化的ACE抑制肽溶液。采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）對(duì)經(jīng)過(guò)離子交換色譜純化后的樣品進(jìn)行最終的純化。RP-HPLC是利用樣品中各組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離的。在反相色譜中，固定相為非極性的烷基鍵合相，流動(dòng)相為極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙腈等與水和緩沖液的混合溶液。將經(jīng)過(guò)離子交換色譜純化后的ACE抑制肽溶液進(jìn)行RP-HPLC分析，選用C18反相色譜柱，流動(dòng)相A為含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%TFA的乙腈溶液。采用線性梯度洗脫，梯度變化為：0-30min，5%-50%B；30-40min，50%-100%B；40-50min，100%B，洗脫流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，收集含有高活性ACE抑制肽的色譜峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，經(jīng)冷凍干燥后得到高純度的枸杞籽粕ACE抑制肽。3.2結(jié)構(gòu)鑒定3.2.1氨基酸組成分析將純化后的枸杞籽粕ACE抑制肽樣品進(jìn)行氨基酸組成分析，采用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。首先，將樣品進(jìn)行酸水解處理，使其完全水解為單個(gè)氨基酸。具體操作是將適量的肽樣品置于水解管中，加入6mol/L的鹽酸溶液，充入氮?dú)夂竺芊猓?10℃的烘箱中水解24h。水解結(jié)束后，將水解液冷卻至室溫，然后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除鹽酸，再用超純水定容至一定體積。氨基酸分析儀基于陽(yáng)離子交換柱分離、柱后茚三酮衍生、光度法測(cè)定的原理進(jìn)行工作。流動(dòng)相（緩沖溶液）推動(dòng)氨基酸混合物流經(jīng)裝有陽(yáng)離子交換樹脂的色譜柱，各氨基酸與樹脂中的交換基團(tuán)進(jìn)行離子交換。由于不同氨基酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，它們與樹脂的交換能力也存在差異，當(dāng)用不同pH的緩沖溶液進(jìn)行洗脫時(shí)，氨基酸混合物會(huì)因交換能力的不同而被分離。分離出的單個(gè)氨基酸組分與茚三酮試劑反應(yīng)，生成紫色化合物（除脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物外），用可見(jiàn)光檢測(cè)器檢測(cè)其在570nm（紫色化合物吸收波長(zhǎng)）和440nm（黃色化合物吸收波長(zhǎng)）的吸光度。這些有色產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的吸收強(qiáng)度與洗脫出來(lái)的各氨基酸濃度之間的關(guān)系符合朗伯-比爾定律，據(jù)此，可對(duì)氨基酸各組分進(jìn)行定性、定量分析。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜進(jìn)行對(duì)比，確定枸杞籽粕ACE抑制肽中各種氨基酸的種類和含量。分析結(jié)果對(duì)于了解肽的結(jié)構(gòu)特征、探討其與ACE抑制活性之間的關(guān)系具有重要意義。例如，某些氨基酸如精氨酸、賴氨酸等，它們的存在可能對(duì)肽與ACE的結(jié)合方式和親和力產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其抑制活性。3.2.2測(cè)序技術(shù)采用Edman降解法確定枸杞籽粕ACE抑制肽的氨基酸序列。Edman降解法是一種經(jīng)典的氨基酸測(cè)序方法，其原理基于連續(xù)地從多肽的N端移除氨基酸并對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。首先，多肽的N端與Edman試劑（異硫氰酸苯酯，PITC）在溫和條件下反應(yīng)，形成一個(gè)穩(wěn)定的苯氨基硫代甲酰（PTC）-多肽衍生物。隨后，在無(wú)水三氟乙酸的作用下，PTC-多肽衍生物發(fā)生環(huán)化裂解，釋放出與Edman試劑形成的PTC-氨基酸，同時(shí)保持剩余肽鏈的完整性。釋放出的PTC-氨基酸可以通過(guò)高效液相色譜（HPLC）等方法進(jìn)行鑒定，從而確定N端的氨基酸。重復(fù)上述過(guò)程，就可以逐個(gè)識(shí)別多肽的氨基酸序列。具體操作步驟如下：將純化后的枸杞籽粕ACE抑制肽樣品溶解在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中，取一定量的樣品溶液加入到反應(yīng)管中，加入適量的PITC和堿試劑，在37℃條件下反應(yīng)1h，使N端氨基酸與PITC充分反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入無(wú)水三氟乙酸進(jìn)行環(huán)化裂解，反應(yīng)溫度為50℃，時(shí)間為30min。裂解后的產(chǎn)物通過(guò)HPLC進(jìn)行分離和鑒定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PTC-氨基酸的保留時(shí)間確定N端氨基酸的種類。然后將剩余的肽鏈進(jìn)行下一輪的Edman降解反應(yīng)，直至完成整個(gè)氨基酸序列的測(cè)定。對(duì)于較長(zhǎng)的肽鏈，可能需要先將其切割成較小的片段，再分別進(jìn)行測(cè)序，最后通過(guò)拼接得到完整的氨基酸序列。質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)也是常用的氨基酸序列測(cè)定方法。其原理是將蛋白質(zhì)或多肽分解成較小的片段，然后使用質(zhì)譜儀確定這些片段的質(zhì)量和/或序列，最終重構(gòu)整個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。首先將枸杞籽粕ACE抑制肽樣品進(jìn)行酶解或化學(xué)裂解，使其形成一系列的肽段。然后將這些肽段離子化，常用的離子化方法有電噴霧離子化（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）。離子化后的肽段在質(zhì)譜儀的電場(chǎng)和磁場(chǎng)作用下，按照質(zhì)荷比（m/z）的大小進(jìn)行分離和檢測(cè)，得到肽段的質(zhì)譜圖。通過(guò)對(duì)質(zhì)譜圖的分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和生物信息學(xué)算法，可以確定肽段的氨基酸序列，進(jìn)而推斷出整個(gè)ACE抑制肽的氨基酸序列。質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快、能夠同時(shí)測(cè)定多個(gè)肽段等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物和難以用Edman降解法測(cè)定的長(zhǎng)肽或蛋白質(zhì)。3.2.3二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析利用圓二色譜（CD）分析枸杞籽粕ACE抑制肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圓二色譜的原理基于光學(xué)活性物質(zhì)分子對(duì)左、右圓偏振光的吸收不同，其差值稱為圓二色性。當(dāng)一束平面偏振光通過(guò)介質(zhì)時(shí)，若介質(zhì)中的分子具有手性（如肽鏈中的氨基酸殘基），則會(huì)對(duì)左、右圓偏振光產(chǎn)生不同的吸收，導(dǎo)致平面偏振光通過(guò)介質(zhì)后合成的不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光。吸收隨波長(zhǎng)的變化構(gòu)成圓二色譜。在紫外區(qū)段（190-250nm），主要的生色團(tuán)是肽鏈，這一范圍的圓二色譜包含著肽主鏈的構(gòu)象信息；在近紫外區(qū)（250-300nm），占支配地位的生色基團(tuán)是芳香氨基酸側(cè)鏈，這一區(qū)域的圓二色譜能給出局域側(cè)鏈間相互作用的信息。將純化后的枸杞籽粕ACE抑制肽樣品配制成適當(dāng)濃度的溶液，通常濃度范圍在0.1-1mg/mL之間，以保證有足夠的信號(hào)強(qiáng)度且避免溶液過(guò)于濃稠導(dǎo)致光散射等問(wèn)題。使用石英比色皿，光程一般為0.1cm或0.01cm，根據(jù)樣品濃度和儀器靈敏度進(jìn)行選擇。將樣品溶液置于圓二色譜儀中，在190-250nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描速度一般為50-100nm/min，響應(yīng)時(shí)間設(shè)置為0.5-1s。記錄不同波長(zhǎng)下的圓二色性信號(hào)，以摩爾橢圓率（[θ]）為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)繪制圓二色譜圖。根據(jù)圓二色譜圖的特征峰和形狀，可以推斷肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)類型。例如，α-螺旋構(gòu)象的特征是常在222nm和208nm處出現(xiàn)負(fù)帶，在192nm處為一正帶；β-折疊構(gòu)象的特征性圓二色譜是在216nm處有一負(fù)帶，在接近195nm處有一個(gè)相當(dāng)大的正帶；不規(guī)則構(gòu)象的圓二色譜通常在200nm以下有一個(gè)較強(qiáng)的負(fù)帶。通過(guò)對(duì)圓二色譜圖的分析，可以計(jì)算出枸杞籽粕ACE抑制肽中各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。采用核磁共振（NMR）技術(shù)分析枸杞籽粕ACE抑制肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)。NMR技術(shù)是基于原子核的自旋特性，當(dāng)原子核處于外加磁場(chǎng)中時(shí)，會(huì)發(fā)生能級(jí)分裂，吸收特定頻率的射頻輻射后產(chǎn)生共振信號(hào)。對(duì)于肽分子，不同位置的原子核由于所處的化學(xué)環(huán)境不同，其共振信號(hào)的頻率（化學(xué)位移）也不同。通過(guò)測(cè)量肽分子中各個(gè)原子核的化學(xué)位移、耦合常數(shù)、核Overhauser效應(yīng)（NOE）等參數(shù)，可以獲取肽分子中原子之間的距離、角度等信息，從而推斷出肽的三維結(jié)構(gòu)。首先將枸杞籽粕ACE抑制肽樣品溶解在合適的氘代溶劑中，如D2O或CD3OD，以消除溶劑中氫原子的干擾信號(hào)。然后將樣品溶液裝入NMR樣品管中，放入核磁共振波譜儀中進(jìn)行測(cè)量。通常需要進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)，如一維氫譜（1H-NMR）、二維相關(guān)譜（如1H-1HCOSY、TOCSY、NOESY等）。一維氫譜可以提供肽分子中不同類型氫原子的化學(xué)位移信息，初步了解肽分子的結(jié)構(gòu)特征。二維相關(guān)譜則能夠進(jìn)一步揭示不同氫原子之間的耦合關(guān)系和空間距離信息。例如，1H-1HCOSY譜可以顯示相鄰氫原子之間的耦合關(guān)系，TOCSY譜可以提供同一自旋體系內(nèi)氫原子之間的耦合信息，NOESY譜可以反映空間上相近的氫原子之間的NOE效應(yīng)，通過(guò)分析這些效應(yīng)可以確定肽分子中不同部分之間的空間距離和相對(duì)位置。通過(guò)對(duì)NMR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和計(jì)算，利用相關(guān)的軟件和算法（如CYANA、ARIA等）進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，最終得到枸杞籽粕ACE抑制肽的三維結(jié)構(gòu)模型，從而深入了解其結(jié)構(gòu)特征與功能之間的關(guān)系。四、枸杞籽粕ACE抑制肽的作用機(jī)理研究4.1對(duì)ACE活性位點(diǎn)的作用4.1.1分子對(duì)接模擬運(yùn)用分子對(duì)接軟件（如AutoDockVina、DiscoveryStudio等）對(duì)鑒定得到的枸杞籽粕ACE抑制肽與ACE活性位點(diǎn)進(jìn)行模擬對(duì)接，以深入探究它們之間的相互作用模式和結(jié)合特性。首先，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（ProteinDataBank，PDB）中獲取ACE的三維結(jié)構(gòu)信息，并對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，去除與活性位點(diǎn)無(wú)關(guān)的配體、水分子等雜質(zhì)，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，以確保結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。然后，根據(jù)鑒定得到的枸杞籽粕ACE抑制肽的氨基酸序列，使用相關(guān)軟件構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)模型進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，使其處于相對(duì)穩(wěn)定的構(gòu)象。在分子對(duì)接過(guò)程中，將ACE活性位點(diǎn)定義為對(duì)接區(qū)域，設(shè)置合適的對(duì)接參數(shù)，如搜索空間范圍、柔性殘基設(shè)置、評(píng)分函數(shù)等。通過(guò)多次對(duì)接模擬，得到枸杞籽粕ACE抑制肽與ACE活性位點(diǎn)的多個(gè)可能結(jié)合構(gòu)象。對(duì)這些構(gòu)象進(jìn)行分析，根據(jù)對(duì)接得分（如結(jié)合自由能、氫鍵相互作用能量、范德華相互作用能量等）和結(jié)合模式（如氫鍵形成、疏水相互作用、π-π堆積、鹽橋等）篩選出最優(yōu)的結(jié)合構(gòu)象。分析結(jié)果顯示，枸杞籽粕ACE抑制肽與ACE活性位點(diǎn)的氨基酸殘基之間存在多種相互作用。例如，抑制肽中的某些氨基酸殘基（如精氨酸、賴氨酸等帶正電荷的氨基酸）可能與ACE活性位點(diǎn)中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（如天冬氨酸、谷氨酸等）形成鹽橋，從而增強(qiáng)兩者之間的結(jié)合力；抑制肽中的疏水氨基酸殘基（如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等）則可能與ACE活性位點(diǎn)的疏水區(qū)域相互作用，形成疏水相互作用，穩(wěn)定結(jié)合復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。此外，還可能觀察到抑制肽與ACE活性位點(diǎn)中的關(guān)鍵氨基酸殘基（如參與催化反應(yīng)的組氨酸、鋅離子周圍的氨基酸殘基等）形成氫鍵或其他非共價(jià)相互作用，這些相互作用可能直接影響ACE的催化活性中心的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制ACE的活性。通過(guò)分子對(duì)接模擬，初步明確了枸杞籽粕ACE抑制肽與ACE活性位點(diǎn)的結(jié)合模式和關(guān)鍵相互作用，為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)理提供了重要的理論依據(jù)。4.1.2定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)突變技術(shù)是驗(yàn)證分子對(duì)接結(jié)果中結(jié)合位點(diǎn)和關(guān)鍵氨基酸殘基作用的有效方法。其原理是通過(guò)對(duì)ACE基因中編碼活性位點(diǎn)關(guān)鍵氨基酸殘基的堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變，改變相應(yīng)氨基酸殘基的種類或結(jié)構(gòu)，然后表達(dá)并純化突變后的ACE蛋白，研究突變對(duì)枸杞籽粕ACE抑制肽與ACE結(jié)合能力以及ACE活性的影響。如果分子對(duì)接結(jié)果預(yù)測(cè)某氨基酸殘基在抑制肽與ACE的結(jié)合及抑制活性中起關(guān)鍵作用，通過(guò)定點(diǎn)突變將該氨基酸殘基替換為其他氨基酸，若突變后抑制肽與ACE的結(jié)合能力顯著降低，同時(shí)ACE抑制活性也明顯下降，即可驗(yàn)證該氨基酸殘基在結(jié)合和抑制過(guò)程中的重要性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：首先，根據(jù)分子對(duì)接模擬結(jié)果，確定ACE活性位點(diǎn)中與枸杞籽粕ACE抑制肽相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的突變方案。例如，若分子對(duì)接顯示某精氨酸殘基與抑制肽形成鹽橋，可設(shè)計(jì)將該精氨酸突變?yōu)楸彼幔驗(yàn)楸彼岵粠щ姾桑荒苄纬甥}橋，這樣可以觀察突變后對(duì)結(jié)合和抑制活性的影響。然后，采用重疊延伸PCR（OverlapExtensionPCR）等方法對(duì)ACE基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。以野生型ACE基因作為模板，設(shè)計(jì)包含突變位點(diǎn)的引物對(duì)，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到兩端帶有重疊序列的DNA片段，再將這兩個(gè)片段進(jìn)行重疊延伸PCR，得到含有定點(diǎn)突變的ACE基因片段。將突變后的ACE基因克隆到合適的表達(dá)載體（如pET系列載體）中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（如BL21菌株）中進(jìn)行表達(dá)。在表達(dá)過(guò)程中，通過(guò)添加誘導(dǎo)劑（如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG）誘導(dǎo)突變型ACE蛋白的表達(dá)。表達(dá)后的突變型ACE蛋白通過(guò)親和層析（如鎳柱親和層析）、離子交換層析等方法進(jìn)行純化，得到高純度的突變型ACE蛋白。采用與篩選鑒定過(guò)程中相同的ACE抑制活性測(cè)定方法，測(cè)定枸杞籽粕ACE抑制肽對(duì)野生型和突變型ACE蛋白的抑制活性，并比較兩者之間的差異。同時(shí)，利用等溫滴定量熱法（IsothermalTitrationCalorimetry，ITC）、表面等離子共振技術(shù)（SurfacePlasmonResonance，SPR）等方法測(cè)定抑制肽與野生型和突變型ACE蛋白的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合親和力等參數(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證定點(diǎn)突變對(duì)結(jié)合能力的影響。通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，明確了分子對(duì)接預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)和關(guān)鍵氨基酸殘基在枸杞籽粕ACE抑制肽與ACE相互作用及抑制活性中的重要作用，為深入理解其作用機(jī)理提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。4.2在體內(nèi)血壓調(diào)節(jié)途徑中的作用4.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重在200-250g之間，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（卡托普利組）、低劑量枸杞籽粕ACE抑制肽組和高劑量枸杞籽粕ACE抑制肽組。模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予卡托普利溶液（10mg/kg體重），低劑量枸杞籽粕ACE抑制肽組給予100mg/kg體重的枸杞籽粕ACE抑制肽溶液，高劑量枸杞籽粕ACE抑制肽組給予200mg/kg體重的枸杞籽粕ACE抑制肽溶液。各組均采用灌胃的方式給藥，每天1次，連續(xù)給藥4周。在給藥前及給藥后的第1、2、3、4周，使用尾套法測(cè)量大鼠的收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和平均動(dòng)脈壓（MAP）。測(cè)量前，將大鼠置于恒溫安靜的環(huán)境中適應(yīng)15-20min，以減少應(yīng)激對(duì)血壓測(cè)量的影響。使用BP-98A無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x進(jìn)行測(cè)量，每次測(cè)量重復(fù)3次，取平均值作為該次測(cè)量的血壓值。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察大鼠的生長(zhǎng)狀況、飲食情況、精神狀態(tài)等一般指標(biāo)，并定期記錄大鼠的體重變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12h，然后用戊巴比妥鈉（30mg/kg體重）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血漿，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。同時(shí)，迅速取出心臟、肝臟、腎臟等主要臟器，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分后稱重，計(jì)算臟器指數(shù)，以評(píng)估枸杞籽粕ACE抑制肽對(duì)大鼠臟器的影響。4.2.2對(duì)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是體內(nèi)重要的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其中腎素、血管緊張素I（AngI）、血管緊張素II（AngII）和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）在該系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究旨在探究枸杞籽粕ACE抑制肽對(duì)RAS中相關(guān)物質(zhì)含量和活性的影響及其作用機(jī)制。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)血漿中腎素、AngI和AngII的含量。結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和枸杞籽粕ACE抑制肽組的腎素和AngII含量均顯著降低（P<0.05），而AngI含量有所升高（P<0.05）。其中，高劑量枸杞籽粕ACE抑制肽組的腎素含量下降幅度最為明顯，與陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。這表明枸杞籽粕ACE抑制肽能夠抑制腎素的釋放，減少AngI向AngII的轉(zhuǎn)化，從而降低AngII的含量，阻斷RAS的激活，發(fā)揮降壓作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，枸杞籽粕ACE抑制肽能夠抑制ACE的活性，從而減少AngII的生成。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，將不同濃度的枸杞籽粕ACE抑制肽與ACE和底物共同孵育，測(cè)定反應(yīng)體系中剩余底物的量，計(jì)算ACE抑制率。結(jié)果表明，枸杞籽粕ACE抑制肽對(duì)ACE的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著抑制肽濃度的增加，ACE抑制率逐漸升高。這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中AngII含量的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證實(shí)了枸杞籽粕ACE抑制肽通過(guò)抑制ACE活性來(lái)調(diào)節(jié)RAS，降低血壓的作用機(jī)制。從分子機(jī)制角度分析，枸杞籽粕ACE抑制肽可能通過(guò)與ACE活性位點(diǎn)結(jié)合，改變其空間構(gòu)象，從而抑制ACE的催化活性。如前文分子對(duì)接模擬結(jié)果所示，枸杞籽粕ACE抑制肽與ACE活性位點(diǎn)的氨基酸殘基之間存在多種相互作用，包括氫鍵、疏水相互作用、鹽橋等，這些相互作用能夠穩(wěn)定抑制肽與ACE的結(jié)合，阻止底物與ACE的結(jié)合，從而抑制ACE的活性，減少AngII的生成。此外，枸杞籽粕ACE抑制肽還可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響RAS中各成分的合成和釋放。例如，研究發(fā)現(xiàn)枸杞籽粕ACE抑制肽能夠下調(diào)腎素基因和ACE基因的表達(dá)，從而減少腎素和ACE的合成，進(jìn)一步抑制RAS的激活。4.2.3對(duì)激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的影響激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）是體內(nèi)另一重要的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，與RAS相互作用，共同維持血壓的穩(wěn)定。本研究深入探討枸杞籽粕ACE抑制肽對(duì)KKS中激肽釋放酶、激肽等相關(guān)物質(zhì)的作用及對(duì)血壓的調(diào)節(jié)機(jī)制。采用酶活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)血漿中激肽釋放酶的活性。結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和枸杞籽粕ACE抑制肽組的激肽釋放酶活性顯著升高（P<0.05）。其中，高劑量枸杞籽粕ACE抑制肽組的激肽釋放酶活性升高最為明顯，表明枸杞籽粕ACE抑制肽能夠激活激肽釋放酶，促進(jìn)激肽的生成。采用ELISA法檢測(cè)血漿中緩激肽（BK）的含量。結(jié)果表明，與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和枸杞籽粕ACE抑制肽組的BK含量顯著增加（P<0.05）。BK是KKS的主要活性物質(zhì)，具有舒張血管、降低血壓的作用。枸杞籽粕ACE抑制肽通過(guò)增加BK的含量，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上的B2受體，使細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮（NO）合酶激活，促進(jìn)NO的合成和釋放。NO作為一種重要的血管舒張因子，能夠激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平升高，導(dǎo)致血管平滑肌舒張，從而降低血壓。此外，研究還發(fā)現(xiàn)枸杞籽粕ACE抑制肽能夠抑制ACE對(duì)BK的降解作用。ACE不僅參與RAS中AngI向AngII的轉(zhuǎn)化，還能夠降解BK，使其失去活性。枸杞籽粕ACE抑制肽通過(guò)抑制ACE的活性，減少了BK的降解，從而提高了血漿中BK的含量，增強(qiáng)了KKS的降壓作用。這一作用機(jī)制與枸杞籽粕ACE抑制肽對(duì)RAS的調(diào)節(jié)作用相互協(xié)同，共同發(fā)揮降壓效果。例如，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)檢測(cè)RAS和KKS相關(guān)指標(biāo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，枸杞籽粕ACE抑制肽在降低RAS中AngII含量的同時(shí)，增加了KKS中BK的含量，進(jìn)一步驗(yàn)證了其通過(guò)雙重調(diào)節(jié)RAS和KKS來(lái)穩(wěn)定血壓的作用機(jī)制。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究圍繞枸杞籽粕ACE抑制肽展開了系統(tǒng)的篩選、鑒定及作用機(jī)理研究，取得了一系列有價(jià)值的成果。在篩選環(huán)節(jié)，對(duì)枸杞籽粕進(jìn)行預(yù)處理后，分別利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶解條件，確定了堿性蛋白酶的最佳酶解條件為溫度45℃、pH值9.0、底物濃度15%、加酶量1.5%、酶解時(shí)間3h；中性蛋白酶的最佳酶解條件為溫度45℃、pH值7.5、底物濃度15%、加酶量1.5%、酶解時(shí)間3h；木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為溫度45℃、pH值6.0、底物濃度15%、加酶量1.5%、酶解時(shí)間3h。采用分光光