序號：編碼：“挑戰杯”大學生課外學術科技作品競賽決賽作品申報書作品名稱：金線蓮與菌根真菌共生萌發的營養及生態調控所在學院：農學院申報者姓名（集體名稱）：蘇嘉欣陳志輝陳曉君林依敏類別：√自然科學類學術論文 □哲學社會科學類社會調查報告和學術論文□科技發明制作A類□科技發明制作B類

說明1.申報者應在認真閱讀此說明各項內容后按要求詳細填寫。2．申報者在填寫申報作品情況時只需根據個人項目或集體項目填寫A1或A2表，根據作品類別（自然科學類學術論文、哲學社會科學類社會調查報告和學術論文、科技發明制作）分別填寫B1、B2或B3表。所有申報者可根據情況填寫C表。3.表內項目填寫時一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報書可復制。4.序號、編碼由競賽組委會填寫。5．學術論文、社會調查報告及所附的有關材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請以4號楷體打印在A4紙上，附于申報書后，字數在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。

A2申報者情況（集體項目）說明：1．必須由申報者本人按要求填寫；2．申報者代表必須是作者中學歷最高者，其余作者按學歷高低排列；3．本表中的學籍管理部門簽章視為申報者情況的確認。申報者代表情況姓名蘇嘉欣性別女出生年月1987.7學院農學院系別、專業、年級06級生態系生態學歷本科在讀學制4入學時間 2006.9作品名稱金線蓮與菌根真菌共生萌發的營養及生態調控畢業論文題目蚯蚓菌根黑麥草聯合修復PCBs污染土壤的效應通訊地址廣州天河五山路486號，華南農業大學躍進南34208郵政編碼510642辦公電住地通訊地址廣州天河五山路486號，華南農業大學躍進南34208郵政編碼510642住宅電話02038694884其他作者情況姓名性別年齡學歷所在單位陳曉君女1986.12本科在讀農學院林依敏女1988.01本科在讀農學院陳志輝男1985.07本科在讀園藝學院資格認定學院學籍管理部門意見以上作者是否為2009□是□否（部門簽章）年月日院系負責人或導師意見本作品是否為課外學術科技或社會實踐活動成果□是□否負責人簽名：年月日

B1．申報作品情況（自然科學類學術論文）說明：1．必須由申報者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對申報者所填內容的確認；3．作品分類請按作品的學術方向或所涉及的主要學科領域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱作品分類（D）A．機械與控制（包括機械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術（包括計算機、電信、通訊、電子等）C．數理（包括數學、物理、地球與空間科學等）D．生命科學（包括生物、農學、藥學、醫學、健康、衛生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學、化工、生態、環保等）作品撰寫的目的和基本思路作品的科學性、先進性及獨特之處利用金線蓮與真菌共生克服組培苗產周期長，成本高，移栽成活率低，植株抗病蟲能力低的缺點。從一個新的角度研究其栽培繁殖方法，為金線蓮規模化人工栽培提供新途徑，對解決野生金線蓮自然資源匱乏問題有重要意義。作品的實際應用價值和現實意義金線蓮（AnoectochilusroxburghiiHayata），藥材名為金線蓮、本山石松、藥虎、藥王、鳥人參等，為蘭科花葉開唇蘭屬植物。金線蓮植株葉背呈紫紅色，葉24枚，呈卵形或卵圓形，全草可入藥，常作為滋補強壯劑，其味甘微苦，性平微寒，具有解毒、止痛、鎮咳等功效。民間多用于治療肺結核、肺熱咳嗽、風濕性關節炎、小兒驚風、跌打損傷、蛇咬傷等多種疾病，均有很好的療效。近年來，金線蓮用于治療高血壓、糖尿病及腫瘤等疑難病癥所取得的成效，日益引起醫藥界的重視。民間稱其為“神藥”，在臺灣稱為“中藥之王”，目前臺灣市場上其鮮草的價格為每50克300400元新臺幣。其藥用功效在《全國中草藥匯編》（1998年版）中有記載記載。日本醫藥科技人員還從金線蓮中分離出有藥效的成分并申請了專利。除藥用之外，金線蓮也是一種觀賞價值極高的室內觀葉珍品，被稱為珠寶蘭。目前臺灣南投縣和福建、廣西等地開始采用組培苗進行人工栽培以滿足市場需求，然而，組培苗成本和價格高居不下，每株苗約需0.5～0.8元人民幣，每畝用苗量約20萬苗，栽培1畝在種苗上的投入就需10多萬元，同時組培苗移栽到大田后成活率低、生長周期長和易發病等方面在技術上無法取得突破，使金線蓮栽培業者面臨著巨大的風險，嚴重制約著金線蓮事業的向前發展。本項目模擬金線蓮在自然界與真菌共生繁殖之方式，通過分離、鑒定與金線蓮共生的菌根真菌，并同時用共生真菌侵染組培苗幼苗，以建立共生關系得到共生苗，并通過人工調控真菌與植物共培養營養配方與環境參數，提高金線蓮組培苗與真菌的侵染率并培育成為菌根共生壯苗，提高種苗移栽后的存活率和抗病力，降低金線蓮栽培的種苗成本和種植風險，為實現金線蓮的規模化種植提供理論基礎。本作品的實施，提高培育所得幼苗的移栽成活率高、生長速度和抗病、抗逆能力，克服金線蓮原材料生產的技術“瓶頸”，促進金線蓮得開發和利用，即可以滿足市場和消費需要，有望為企業創作可觀的經濟效益，對于弘揚我國中醫藥文化具有重要的社會意義，也在很大程度上對我國瀕危的野生金線蓮種植資源起到較大的保護作用。學術論文文摘作品在何時、何地、何種機構舉行的會議上或報刊上發表及所獲獎勵鑒定結果請提供對于理解、審查、評價所申報作品具有參考價值的現有技術及技術文獻的檢索目錄李煥椹，劉國柱，周正仁.臺灣藥用植物之探討.國立中國醫藥研究所.臺北市.1976陳裕，林坤瑞，管其寬，林鏡明。金線蓮生物學特性及生境特點研究。亞熱帶植物通訊，1994,23(1)：1824陳裕，林坤瑞，管其寬，林鏡明。金線蓮的開花特性。亞熱帶植物通訊，1996，25(1)：3537胡珊梅，張啟國，袁文杰，周涵韜，周興旺，陳鷺真。珍稀中草藥金線蓮的RAPD研究。中草藥，2000，31（12）：1316戴國興。珍貴藥用植物金線連之組織培養繁殖。中華農學會報，1986，137：4254肖三元.金線蘭組織培養及快速繁殖研究.廣西熱作科技.1998（1）：1214林蘭英等.金線蓮組織培養中若干因素的研究.亞熱帶植物通訊.1993.22（2）：711肖翌柱等.臺灣金線蓮之組織培養.中華農業研究.1995.44（3）：279286于雪梅,郭順星.內生真菌促進珍稀中草藥金線蓮生長發育的菌根結構研究.中國北京:2000.張集慧,王春蘭,郭順星,etal.蘭科藥用植物的5種內生真菌產生的植物激素.中國醫學科學院學報.1999，21(6):460465于雪梅,郭順星.金線蓮與內生真菌共生培養體系的建立.中國中藥雜志.2000，25(2)：8284.郭順星;于雪梅;高微微;陳曉梅;王春蘭;孟志霞;肖培根.菌根真菌在金線蓮大面積栽培中的應用.國家發明專利，公開號：CN1961651，公開日期：2007.05.16Beyrle,H.F.,Smith,S.E.,Peterson,R.L.andFranco,C.M.M.ColonisationfoOrchismorioprotocormsbyamycorrhizalfungus:effectsofnitrogennutritionandglyphosateinmodifyingtheresponses.CanadianJournalofBotany.1995.73:11281140.Hadley,G.Nonspecificityofsymbioticinfectioninorchidmycorrhiza.NewPhytologist1970(69):10151023TakeshitaT.etal.Hypoglycemicsandlipidmetabolismimprovingagentscontaining3glucosyloxy4hydroxybutyricacidoritsderivastivesfromplant.Jpn.KokaiTokkyoKoho（即：日本公開專利公報）JP1995,7,76522申報材料清單（申報論文一篇，相關資料名稱及數量）科研管理部門簽章年月日

C.當前國內外同類課題研究水平概述說明：1.申報者可根據作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。金線蓮的生產和研究中心在臺灣省，近年來，臺灣當局有關部門對金線蓮的開發研究給予了相當大力的支持，得到臺灣官方立項多個項目的支持。在內地，福建省是開展金線蓮研究最活躍的地方。福建省科委曾于1991年立項支持該省亞熱帶植物研究所陳裕課題組開展了金線蓮家種配套新技術及生物學研究；幾年前，廈門市衛生局立項資助廈門市藥品檢驗所胡珊梅等應用分子生物學實驗方法進行金線蓮品種鑒別的研究。苗生產是金線蓮人工栽培的重要環節，金線蓮組織培養育苗技術已趨于成熟。臺灣在組織培養繁殖金線蓮方面開始得很早，肖三元、林蘭英和臺灣的蕭翌柱等分別對金線蓮的組織培養進行研究，在臺灣南投縣已經形成采用組培苗進行金線蓮規模栽培的精致農業。但金線蓮組培苗致命的缺陷是不抗病，栽培期間容易受到莖腐病為害。據觀察，莖腐病總是發生在栽培基質所掩蓋的地下莖部位，加之金線蓮莖葉具有很強的持水能力，當地下莖部嚴重腐爛時植株上部莖葉也不會出現明顯的萎蔫，因此，在莖腐病發病的初期很難覺察。同時由于金線蓮是藥用植物，因此在管理時不能夠經常噴藥防病，而當出現病癥時，噴灑農藥已經是為時過晚了。金線蓮的大規模人工栽種仍然面臨極大的挑戰，如何培育抗病壯苗乃成功之關鍵。組培苗與真菌共生形成菌根苗，其抗病能力則大大增強，不易受到病菌的危害，成活率大大提高。菌根真菌是目前真菌學和植物生理學之交叉學科的研究熱點之一，在植物種苗的培育和引種移植方面具有重要意義。共生菌根在天麻人工栽培上的應用是目前蘭科植物中最為成功的事例。真菌侵入蘭科植物組織過程中，產生的纖維素酶和果膠酶有助于真菌在原球莖中的定殖；同時真菌的入侵也會誘導植物的防御反應和誘導抗侵入，主要表現在細胞壁的增厚、胼胝質淀積、水解酶和植保素的產生等，從而加強了植株的抗病和抗逆能力。真菌與胚的相互作用就如進攻和防御的戰場一樣，最后有三種不同的結果：(a)菌根相互作用：真菌成功侵入并在在原球莖的薄壁細胞中形成菌絲球，之后被溶解利用，促進植株的生長。(b)寄生物的相互作用：真菌成功侵入后在相互作用的過程中，蘭花細胞由于菌絲的過度生長而導致原球莖的死亡。(c)抗性反應：真菌會被排斥在蘭花組織之外。這種相互作用可能在一群類原球莖中同時發生，值得注意的是，這種植物真菌的關系具有動力學的和相對不穩定的特性。在任何蘭花種類中，發生的比例都受到營養和環境因子的影響，人工控制培養條件，特別是在培養基中調節碳源和氮源的化合物的種類和濃度，能夠改變以上三種不同種類原球莖的比例；因此，共生機制的研究和共生平衡關系的建立一直是蘭花菌根研究的主要課題。與組培苗相比較，共生苗具有抗病、抗逆、適應能力強和生長較快的優點。但目前尚未見有關絲核菌（Rhizoctoniasp.）侵染金線蓮建立共生關系的報道。采用真菌與組培苗建立共生關系是獲得共生金線蓮苗的一條途徑，于雪梅等對金線蓮內生真菌進行了分離，并研究了其生物學活性及所產生的植物激素，還試圖建立金線蓮組培苗與內生真菌共生培養體系，以期通過組培苗與真菌共生獲得共生苗；郭順星等采用石斛小菇(Mycenadendrobii)、紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、蘭小菇(Mycenaorchidicola)、開唇蘭小菇(Mycenaanoectochila)分別培養菌根真菌和金線蓮幼苗，再將菌根真菌與金線蓮幼苗共生栽培的技術，但效果并不理想。可見，目前金線蓮共生苗的培育技術還遠未成熟，且目前尚未見有關金線蓮組培苗共生萌發的報道。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級專業技術職稱，并是與申報作品相同或相關領域的專家學者或專業技術人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認。推薦者情況姓名方祥性別男年齡38職稱副教授工作單位華南農業大學食品學院通訊地址廣州天河五山路486號，華南農業大學食品學院郵政編碼510642單位電話020885280267住宅電薦者所在單位簽章（簽章）年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述申報者已做了大量工作，申報材料真實可信。請對作品的意義、技術水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價菌根真菌是目前真菌學和植物生理學之交叉學科的研究熱點之一，在植物種苗的培育和引種移植方面具有重要意義。金線蓮是一種名貴中草藥，目前自然界已顰臨滅絕，如何保護和合理開發是擺在廣大研究者面前的一項重要課題。雖然組培技術基本成熟，但組培苗天生的缺陷使其難以越夏，如果組培苗與真菌共生形成菌根苗，其抗病能力則大大增強，不易受到病菌的危害，成活率大大提高。本研究技術成熟對于金線蓮的保護和開發均具有重要的理論意義和經濟價值。其它說明金線蓮與菌根真菌共生萌發的營養及生態調控申報材料清單（2008.8.262009.3.3）項目進展：一、金線蓮與菌根真菌共生培養體系的建立1、促進形成共生的培養基篩選1.1第一批預試驗1.2第二批預試驗1.3第三批預試驗1.4正式實驗1.5正式實驗22、不同基質上金線蓮與真菌的共生2.1移栽苗二、菌根真菌組織學觀察三、菌根真菌重分離與鑒定3.1絲核菌的分離3.2絲核菌培養性狀的觀察3.3絲核菌菌絲的觀察及其直徑的測量3.4絲核菌細胞核的染色3.5菌絲融合測定四、菌種的分子鑒定（正開展）現在已完成的四批預實驗中，除第一批未達到預期目的外，其余三批預實驗都能建立共生體系，并且形成共生類原球莖，進而分化成共生苗。四批預實驗初步探討了不同因素對共生體系建立的影響，為正式實驗的進行提供依據。現已開展的正式實驗2從不同因素、水平上探討對金線蓮與菌根真菌共生培養體系的建立的影響因素。同時，將第三批預試驗的共生苗移栽，探討共生苗在外界環境中的生長狀況，為應用于生產提供依據。我們也進行了菌根的組織學觀察，探討了菌根的形成過程。菌根真菌重分離與鑒定階段，我們探討了與金線蓮形成共生的三種真菌的形態特性、菌落特征，初步判斷這三種真菌為同一菌屬。現階段的菌種的分子鑒定，目的是為了鑒定三種真菌是否為同一種，以及尋找真菌誘導金線蓮特異表達的基因。一、金線蓮與菌根真菌共生培養體系的建立1、促進形成共生的培養基篩選1.1第一批預試驗2008.8.26目的：觀察板栗葉對金線蓮與真菌共生是否有促進作用方法：將苗分成尖、莖、頭、全株幾部分，分別接到帶菌的板栗葉子上，板栗葉預先用PDB侵泡過，菌先于苗5天接種。同時設對照，培養條件分黑暗和光照兩種。選板栗葉的原因：金線蓮野外生長最適宜環境是山澗常綠闊葉林樹林的枯枝落葉層中，并且根據文獻可知板栗葉中有某種物質能促進絲核菌的生長。說明：材料來自生科院，分嫩苗、中等苗、老苗。尖指最苗的最上端部分，莖是苗中間部分，頭指最苗下端，都帶12個節。表1.1.1培養條件：25攝氏度黑暗，提前5天接菌JSH1時間10天材料個數存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率共生關系備注嫩苗尖180018100%否一些是腐爛大半，但幾乎是死亡，活不了。嫩苗莖5005100%否嫩苗全株604233.33%否中等尖5005100%否中等莖63300%否氣生根43100%否老苗尖302133.33%否總共476103165.96%時間22天材料個數存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率共生關系嫩苗尖180018100%否嫩苗莖5005100%否嫩苗全株611466.67%否中等尖5005100%否中等莖611466.67%否氣生根411250%否老苗尖3003100.00%否總共47334187.23%表1.1.2培養條件：25攝氏度光照，提前5天接菌JSH1時間10天材料個數存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率共生關系備注嫩苗尖1001990%否嫩苗莖7007100%否嫩苗全株503240%否中等莖1113763.64%否老苗尖502360%否老苗莖12021083.33%否氣生根10100%否總共511123874.51%時間22天材料個數存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率共生關系嫩苗尖100010100.00%否嫩苗莖7007100.00%否嫩苗全株5005100.00%否中等莖110011100.00%否老苗尖5005100.00%否老苗莖120012100.00%否氣生根1001100.00%否總共510051100.00%表1.1.3培養條件：25攝氏度光照，不接菌時間10天材料個數存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率嫩苗尖40400%嫩苗莖503240%嫩苗頭301266.67%中等莖650116.67%老苗尖44000%老苗莖98100%氣生根44000%總共35219514.29%時間22天材料個數存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率嫩苗尖4004100.00%嫩苗莖5005100.00%嫩苗頭3003100.00%中等莖610583.33%老苗尖4004100.00%老苗莖950444.44%氣生根44000.00%總共351002571.43%結果：4天后部分組織出現腐爛，10天后，接有菌的嫩苗幾乎全部死亡，中老苗也出現大量死亡；對照大部分存活。22天后觀察，接菌的幾乎全部死亡；20℃黑暗條件下培養比25℃光照培養的稍好，但不接菌的相對生長良好，依然有幾個存活，總體苗與菌沒有形成共生。結論：板栗葉對金線蓮——真菌共生體系基本沒有多大的促進作用，對絲核菌的生長有促進作用。1.2第二批預試驗目的：比較在不加葡萄糖PDA（20%馬鈴薯+0.8%瓊脂）、1/2PDA（20%+1%葡萄糖+0.8%瓊脂）、PDA（20%+2%葡萄糖+0.8%瓊脂）中帶板栗葉和無板栗葉水的培養基中金線蓮與絲核菌的共生情況。方法：將菌JSH1與苗接到以馬鈴薯葡萄糖瓊脂為基礎的培養基上。培養基分為,全G（全葡萄糖）PDA、1/2G（1/2葡萄糖）PDA、無G（無葡萄糖）PDA，部分還添加10%板栗葉汁，接菌時間分提前5天接菌和同時接菌兩種，苗分為尖、莖、全株三種，培養條件為25攝氏度，光照培養。說明：下列表“+”表示是或有，“”表示否或無表1.2.1不同培養基中接菌金線蓮出現類原球莖的情況培養基瓶編號株樹同時接菌類原球莖最初出現類原球莖天數類原球莖個數(33或38天后)出現類原球莖株數平均類原球莖個數（個/株）備注全G板栗葉汁15+1953無板栗葉汁35+3022無板栗葉汁205++172041/2G,板栗葉汁莖54+1633莖+尖+全65+1954尖73+2311全83+2332莖94+00莖123+不祥不祥0污染不作記錄尖163+00無G板栗葉汁全+莖+尖145++19不祥不詳污染全+莖173+1921全+莖185+1832表1.2.2不同培養基中對照培養基瓶編號原球莖生長狀況備注全GCK板栗葉汁20良好污染CK無板栗葉汁40良好污染1/2G,板栗葉汁CK莖100良好CK尖110良好CK全150良好無G板栗葉汁CK莖+尖190良好結果：4天后，全葡萄糖的、1/2葡萄糖的、無葡萄糖的都有出現發黃腐爛情況，而且幾乎都是莖出現這種情況。13天后，全葡萄糖中有一瓶出現類原球莖。16天后，全葡萄糖、無葡萄糖、1/2葡萄糖各有一瓶出現類原球莖；20天后，總共有8瓶出現類原球莖。有類原球莖的多為莖部，也有在整株的節間生長，長有類原球莖的苗明顯比沒有的粗壯。在菌侵染初期，莖生長情況為表面呈發黃或停止生長狀態。1.3第三批預試驗2008.10.8目的：比較在DE、DE+1%板栗水、DE+5%板栗水培養基中，金線蓮與JSH1、JSH4、JSH5絲核菌的共生情況。方法：將苗（全株）與絲核菌同時接到以DE為基礎的三種培養基上，觀察其共生情況。菌種：JSH1、JSH4、JSH5；培養基：DE、DE+1%板栗葉汁、DE+5%板栗葉汁。同時接全株苗，并在25℃光照培養，并以無接菌的相應處理為對照，每處理3重復。說明：材料來源生物研究所，苗總體比較弱，就其葉色可分兩種，一種偏粉紅、一種偏綠色，稍壯些。接種時隨機，接種前對底部稍切割下，去掉黑色部分，全部無根。“++”表示粗壯非常好；“+”表示生長良好或稍瘦弱；“”表示苗已經變黃，或上半節枯萎下面生長；“”表示完全死亡。下述株高、鮮重、葉片數均為平均值。表1.3.1不同培養基中接菌金線蓮培養基菌種株高(cm）鮮重（g）葉片數接種當天(10.8)兩個月后(12.7)接種當天(10.8)兩個月后(12.7)接種當天(10.8)兩個月后(12.7)DEJSH13.0166674.9583330.126667未統計24.375JSH42.0583335.0985350.1166671.749754.208333JSH52.1916674.7166670.131.750254.541667CK2.4443.6330.1433332.5534.833333DE+1%板栗葉汁JSH11.8555565.5150.14666723.666667JSH41.2333333.780.081.3333.333333JSH51.4111115.780.1211111.8894CK1.5444443.550.1566671.442.888889DE+5%板栗葉汁JSH11.5222223.9430.1355561.5563.166667JSH41.2555563.1330.151.7782.5JSH51.2111113.450.0933331.443.5CK1.1777783.010.1044441.443.055556表1.3培養基菌種株高差葉片差營養根差氣生根只差原球莖差兩個月之差DEJSH11.9431.8330.1671.6670.667JSH43.0422.4320.0911.8180.5JSH52.5282.250.1671.5830.044CK1.1861.5610.8891.5560DE+1%板栗葉汁JSH13.6641.6670.51.3330.833JSH42.5472.00301.2221.556JSH54.3692.1101.6670.778CK2.0061.4490.3330.7780DE+5%板栗葉汁JSH12.4181.583培養基顏色過深看不清11.429JSH41.8740.8450.6670.667JSH52.2392.060.80.6CK1.8321.8931.2220Duncan法培養基平均株高(cm）差異顯著性0.01DE+1%板栗葉汁4.656ADE4.601BDE+5%板栗葉汁3.384C培養基平均葉片數差異顯著性0.01DE4.49ADE+1%板栗葉汁3.472BDE+5%板栗葉汁3.125C菌種平均株高(cm）差異顯著性0.01JSH14.805AJSH54.649BJSH44.003CCK3.398D菌種平均葉片數差異顯著性0.01JSH54.0139AJSH13.7361ABCK3.6852ABJSH43.3472B結論：供試培養基和供試菌種均對金線蓮影響明顯。不同菌種對金線蓮的影響差異明顯。接菌的金線蓮生長快，旺盛，均比對照株高。此外，板栗葉汁可能通過影響菌的生長來影響共生體系的建立。DE+5%板栗葉汁的培養基中，菌生長較旺盛，類原球菌出現時間均比DE、DE+1%板栗葉汁早，但存活率比其它兩者低，這可能與菌侵染強度有關。經觀察發現，真菌的生長和侵染速度適度，就容易與金線蓮建立共生體系；過弱侵染速度緩慢，建立的共生時間長；過強侵染激烈，會增加金線蓮的死亡率。因而還需要進一步的試驗以探明菌的最適合生長速度。1.4正式實驗方法：將苗去掉上端，莖分成上莖與下莖兩部分，接到不同培養基中，每瓶一株苗，即只有一個上莖與一個下莖。觀察幾個單因素對原球莖產生的影響，每個水平4瓶。除了考慮各因素外，其余都是（1/2PDA,25ml,中光,同時接菌，葡萄糖）。說明:"++"表示保持綠色；“+”表示綠中帶黃；“”表示黃中帶綠；“”表示死亡。原球莖只算能辨別清的，那些辨不清是否原球莖的白點不計算。表1.4.1各因素對金線蓮生長及共生的影響觀察時間12.8因素水平編號生長狀況死亡株數原球莖接種時間61/++202/03/++04+/031/702/+03/04/031/+102+/+03/+061++/+002++/+03+/+04+/+0菌種JSH11/++402/+03/04/0JSH21+/102++/++03/++04++/++0JSH41/602+/03/04+/0JSH51/702/03/+04/0接上表培養基量40ml1+/+402/03/+04/050ml1/502/03/04/0培養基DE1+/++002++/++1/03++/++0/14++/++1/0MS1/502+/+03/04+/0碳源蔗糖1/202+/03/+04+/0乳糖1/602/+03/04/0淀粉1/+602/03/04/0甘露醇1/+502/03/+04/0無糖不過濾1/702/+03/0無糖過濾1/502+/03/0接上表光照中1/602/03/04/0強1/502/03+/04/0弱1/802/03/04/0說明：現階段主要是進行單因素實驗，以便探明各因素對金線蓮與真菌共生的影響。此次實驗死亡率太高，可能是由于菌種變異引起的。1.5正式實驗2方法：將苗去掉上端，莖分成上莖與下莖兩部分，接到不同培養基中，每瓶4個莖節，（大部分是兩個上莖兩個下莖）觀察幾個單因素對原球莖產生的影響，每個水平3瓶。除了考慮各因素外，其余條件都是：DE,30ml,中光,同時接菌，葡萄糖。表1.5因素水平平均原球莖數平均出芽率平均出葉芽率平均芽高菌種JSH10.7542.6666666670.733333JSH40.753.66672.3333333330.6JSH50.83333.33332.6666666670.433333培養基量及培養基40ml0.666731.3333333330.66666750ml0.41672.51.50.560ml0.58332.33331.3333333330.5666671/2PDA0.16672.666720.533333接種時間60.52.66670.6666666670.730.58332.333310.866667+30.666743.51.4+60.37532.51.1碳源蔗糖0.75310.566667葡萄糖1.253.66672.6666666670.766667乳糖0.22222.51.50.75甘露醇0.75331.5可溶性淀粉0.5210.833333光強強光1.16673.66672.3333333330.933333弱光0.666720.6666666670.666667苗品種0201（云南）0.08332.666720.4666670401（臺灣）0.752.666721.20701(雜交種）0.833343.3333333330.633333Duncan法比較不同因素對金線蓮生長狀態影響因素平均數差異顯著性0.01菌種2.5833A苗品種1.7194B接種時間1.6161B碳源1.5611B光強1.5125B培養基量及培養基1.2979B結論：不同菌種對金線蓮生長及共生體系的建立的影響具有統計學意義，對比其它5種因素差異顯著。但還需要繼續觀察，以得出更科學合理的結論。附：金線蓮組培苗與真菌的共生圖片左圖為金線蓮形成類原球莖，右圖為對照左圖為類原球莖分化出芽，右圖為類原球莖再增值左圖為類原球莖分化為苗2、不同基質上金線蓮與真菌的共生2.1移栽苗目的：比較在不同基質中金線蓮與JSH1、JSH4、JSH5絲核菌的共生情況。方法：先將已生根的組培苗種植在兩種基質上，10天后拔出，挑選生長良好的苗稱鮮重后重新種回去，每盆兩株，編號。同時把染有絲核菌的板栗葉按照3~8g每盆（板栗葉有些濕潤有些干燥）放在培養基里，接觸到苗的根部，絲核菌已生長5天并產生了菌核，并設兩種對照。說明：對照CK1表示不接菌不放板栗葉子CK2表示不接菌但放同樣重量的板栗葉子。基質1：泥炭：沙子：蛭石=4：1：2；基質2:泥炭：椰松=3:2。“++”表示粗壯非常好；“+”表示生長良好或稍瘦弱；“”表示苗已經變黃，或上半節枯萎下面生長；“”表示完全死亡表2.1還沒接菌組培苗種植在兩種基質上10天后的存活率接菌前10天后基質株數存活半活死亡存活率備注140322680%總的狀態比基質1好240341585%表2.2下表不同基質不同菌種金線蓮生長共生情況基質菌編號接種當天2個月后生長狀況生長狀況總原球莖數總死亡率1JSH1A+/++++/++133.33%B+/+++/C+/+/JSH4A+/+/+4B+/+++/++C+/++/+JSH5A+/+/+3B+/+++/C+/+++/++CK1A+/+/0B+/+++/+C+/++/CK2A+/++/0B++/+/C+/+/++2JSH1A+/+++/++418.75%B+/+++/+C+/+++/++JSH4A+/+++/4B+/++/C+/++++/++JSH5A+/++/+2B+/++++/C+/+++/++CK1A+/+/++0B+/+/+C+/+++/++CK2A+/+++/++0B+/+++/+C+/+++/++結果：基質1的存活率為66.67%，萌芽率為16.71%；基質2的存活率為81.25%；從苗的生長情況看，基質2生長要好許多，從萌芽率來說，基質1要高一些。附：移栽苗圖片左圖為長有類原球莖的共生苗移栽，右圖為對照上圖為組培苗移栽到含有真菌的基質中二、菌根真菌組織學觀察材料：制作徒手切片，采用第二批實驗的共生苗，分1節、2莖間、3原球莖下部、4原球莖上部四個部位，用美蘭、番紅染色。左圖為番紅染色下的菌絲結，右圖為對照左圖為美蘭染色下的菌絲，右圖為對照結果：近節、節和原球莖里均有菌絲或菌絲團，有部分菌絲團溶解，這與文獻共生情況符合，其他部位及對照沒有。結論：絲核菌可能是從節或切口外皮層細胞進入皮層細胞，進而與金線蓮形成共生。菌絲團溶解為植物提供營養，進而促進苗生長成健壯的植株。三、菌根真菌重分離與鑒定3.1絲核菌的分離材料：上述移栽苗金線蓮方法：沖凈泥土，用滅菌刀切取一小段含類原球莖金絲蓮莖節，把莖節在0.1%升汞浸泡30s~60s，95%酒精浸泡3~5s，無菌水沖洗3次后，切取莖節部分約5mm，放置在含100U/mL硫酸鏈霉素的PDA平板上，在28℃培養箱中培養。待菌絲生長后，菌落直徑約3cm時，再從菌絲前沿切取5mm置于新的PDA平板中央培養。3.2絲核菌培養性狀的觀察方法：將待測菌株在上述PDA培養基培養2d后，用打孔器在培養皿菌落邊緣處切取長寬各為4mm的菌絲塊，移入PDA平板中央，28℃下培養，3個重復，每隔24h觀察1次菌落的生長情況，記錄菌落直徑、顏色及產菌核時間，菌核顏色變化情況。表3.菌種時間菌落直徑直徑平均值菌落顏色產菌核時間JSH11天后3.9977785.298乳白色8天后2天后6.598889JSH41天后3.7266675.012乳白色8天后2天后6.297778JSH51天后3.8922225.249乳白色8天后2天后6.606667Duncan法菌種平均數差異顯著性0.05JSH45.298AJSH15.249AJSH55.012A3.3絲核菌菌絲的觀察及其直徑的測量方法：絲核菌在PDA平板上，28℃條件下，培養兩天后鏡檢觀察分枝角度、是否有隔膜，并測量菌絲直徑：用鑷子或解剖針挑一小塊菌絲，放在載玻片上，滴上乳酸石碳酸，在顯微鏡下測量菌絲直徑，每菌株隨機測量3處。表3.菌種時間菌絲直徑直徑平均值隔膜分枝角度JSH11天后2.0444442.144444有直角2天后2.244444JSH41天后2.1777782.505556有直角2天后2.833333JSH51天后2.0555562.105556有直角2天后2.155556Duncan法菌種平均數差異顯著性0.05JSH42.5056AJSH12.1444AJSH52.