項目三

無菌操作技術任務三外植體的選擇與處理任務二無菌操作技術任務一虛擬無菌操作無菌操作任務三外植體的選擇與處理知識目標學會處理各種外植體的方法和操作流程；學會外植體的培養方法；掌握外植體的培養過程。123掌握外植體的選擇方法；熟練掌握外植體的滅菌方法和無菌操作技術；學會外植體的培養過程

123技能目標第一節外植體的選擇和處理第二節培養和馴化任務講解第一節外植體的選擇和處理一、外植體選擇時應注意：（1）選擇優良的種質及母株（2）選擇適當的時期（3）選取適宜的大小（4）外植體來源要豐富（5）外植體要易于消毒二、外植體取材的部位：（1）莖尖莖尖不僅生長速度快，繁殖率高，不容易發生變異，而且莖尖培養是獲得脫毒苗木的有效途徑。因此莖尖是植物組織培養中最常用的外植體。（2）節間部大部分果樹和花卉等植物，新梢的節間部是組織培養的較好材料。新梢節間部位不僅消毒容易，而且脫分化和再分化能力較強，因此是常用組織培養材料。（3）葉和葉柄葉片和葉柄取材容易，新出的葉片雜菌較少，實驗操作方便，是植物組織培養中常用的材料。尤其是近年在植物的遺傳轉化中，以葉片為試驗材料的報道很多。（4）鱗片水仙、百合、蔥、蒜、風信子等鱗莖類植物常以鱗片為材料。（5）其他種子、根、塊莖、塊根、花粉等也可以作為植物組織培養的材料。三、外植體處理：

首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內完成，準備好消毒的燒杯、70％酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70％酒精浸10-30s。第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據情況選取1-2種使用。第四步是用無菌水涮洗，涮洗要每次1-3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-10次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。第五步接種。接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經切割或剪裁成小段或小塊，放人培養基的過程。第二節培養和馴化

指把培養材料放在培養室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程。

1．培養方法(1)固體培養法即用瓊脂固化培養基來培養植物材料的方法。是現在最常用的方法。雖然該方法設備簡單，易行，但養分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現象發生。1培養方法(2)液體培養法即用不加固化劑的液體培養基培養植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動或振動培養液的方法以確保氧氣的供給，采用往復式搖床或旋轉式搖床進行培養，其速度一般為50-100r／min，這種定期浸沒的方法，既能使培養基均一，又能保證氧氣的供給。1.初代培養◆2.繼代培養◆3.生根培養◆培養步驟2．培養步驟2．培養步驟叢生芽的發育Ⅰ頂芽腋芽微型扦插叢生芽的發育Ⅱ頂芽CTK刺激帶芽的莖切段側芽接種培養形成的莖梢節長，直立向上呈小灌木叢狀獲得較多嫩莖梢莖段培養繼代擴繁試管苗生根培養無愈傷組織產生初代繼代叢生芽的發育2不定芽的發育脫分化分化愈傷組織芽、芽叢切割芽叢繼代培養大量芽叢試管苗生根培養外植體初代繼代不定芽的發育石龍芮下胚軸培養產生胚狀體過程體細胞胚狀體的發育Ⅰ體細胞胚狀體的發育1體細胞胚狀體的發育Ⅱ

外植體特點：數量多，速度快，結構完整，成苗率高愈傷組織小孢子游離單細胞器官

胚狀體

試管苗體細胞胚狀體的發育2原球莖的發育

縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細胞組成的、類似嫩莖的器官。原球莖的發育視頻視頻3-5初代培養繼代培養擴繁方法：以幾何級數增加，可切割莖段、分離芽叢、胚狀體、原球莖。培養基：基本培養基或分化培養基實質：增殖培養物，為生產成品試管苗做準備。繼代培養目的：擴繁無根苗，最后達到邊繁殖邊生根視頻3-6繼代培養生根培養培養材料生根繼代培養初代培養生根培養基：1／2或1／4MS培養基生根方法與途徑新梢基部浸入50或100ppmIBA液4－8h在含IAA培養基中培養4－6d移入含IAA的生根培養基培養其它方法(濾紙橋等）生根培養生根培養生根培養生根培養生根培養生根培養視頻視頻3-7生根培養任務小結外植體的取材部位較多，應合理選擇；應選擇合適的消毒劑對外植體進行處理；外植體