ICS07.100.30B20DB22備案號：吉林省地方標準DB22/T2052—2014飼料中沙門氏菌測定實時熒光PCR方法DeterminationofsalmonellainfeedstuffsReal-timePCRmethod吉林省質量技術監督局發布DB22/T2052—2014前言本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規則起草。本標準由吉林省質量技術監督局提出并歸口。本標準主要起草單位：吉林省產品質量監督檢驗院、國家農業深加工產品質量監督檢驗中心、中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局。本標準主要起草人：史艷宇、劉金華、王偉、劉曉暉、趙立群、侯宇、柴竹林、張濤。IDB22/T2052—2014飼料中沙門氏菌測定實時熒光PCR方法1范圍本標準規定了飼料中沙門氏菌的實時熒光PCR檢驗方法。本標準適用于飼料中沙門氏菌的快速篩選檢測。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T13091飼料中沙門氏菌的檢驗方法GB/T27403實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。實時熒光PCRreal-timefluorescentPCR實時熒光聚合酶鏈式反應。Ct值cyclethresholdvalue對樣品的增菌培養物進行DNA提取，通過實時熒光PCR擴增，觀察實時熒光PCR的增幅曲線，從而對飼料中的沙門氏菌進行快速檢測。除特別說明以外，所有試劑均為分析純，水為按照GB/T6682規定的一級水。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。a)上游引物：5’-GTGAAATAATCGCCACGTCGGGCAA-3’b)下游引物：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’1DB22/T2052—2014c)探針：5’-FAM-TTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTG–TAMRA-3’5.2TaqDNA聚合酶。5.3dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脫氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidinetriphosphate，脫氧鳥苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脫氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脫氧胸苷三磷酸）。5.4細菌基因組DNA提取純化試劑盒。5.510×PCR緩沖液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化鉀（KCl），15mmol/L氯化鎂（MgCl2）。5.6緩沖蛋白胨水（BPW）：按GB/T13091中附錄規定。5.7沙門氏菌質控菌株：來源于正規菌種保藏機構的標準菌株。如CGMCC1.1859、CGMCC1.1194等。6設備和材料6.1實時熒光PCR儀。6.2生物安全柜：AII型。6.3恒溫培養箱。6.4離心機：轉速≥12000r/min。6.5核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.6高壓滅菌器。6.8天平：感量0.1g。7檢測步驟取BPW增菌液1mL于1.5mL無菌離心管中，12000r/min離心5min，盡量吸棄上清液，使用細菌基因組DNA提取試劑盒并按其說明提取制備模板DNA。提取的DNA溶液可于-20℃保存。DNA提取和純化過程應用無菌水作為核酸提取空白對照。取10μLDNA溶液加蒸餾水稀釋至1mL，使用核酸蛋白儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值。DNA的濃度按照式（1）計算，當A260/A280比值在1.5~2.1之間時，適宜于PCR擴增。擴增前將所有樣品DNA調至10ng/μL~50ng/μL。2DB22/T2052—2014c=A′N′501000.............................................................................................(1)式中：c——DNA濃度，單位為納克每微升（ng/μL）；A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數。7.4實時熒光PCR檢驗7.4.1實時熒光PCR反應體系10×PCR緩沖液2.5μL、引物對（10μmol/L）各1μL、探針（10μmol/L）1μL、dNTP（10mmol/L）1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、模板DNA2μL、用滅菌去離子水補足體積至25μL。7.4.2實時熒光PCR反應條件94℃預變性2min，94℃變性20s，64℃退火延伸1min，同時收集FAM熒光，共進行40個循環。反應產物可在4℃保存。不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據要求將反應條件做適當調整。檢驗過程中分別設空白對照、陰性對照、陽性對照。空白對照設為以無菌水代替DNA模板；陰性對照采用非沙門氏菌的DNA作為實時熒光PCR反應的模板；陽性對照采用沙門氏菌DNA作為實時熒光PCR反應的模板。——空白對照：無擴增曲線，Ct值≥40.0；——陰性對照：無擴增曲線，Ct值≥40.0；——陽性對照：出現典型的擴增曲線，Ct值應≤35.0；否則，視為無效。——Ct值≤35.0，可判定該樣品實時熒光PCR結果為陽性，按GB/T13091進行確證。——35.0＜Ct值＜40.0，此時應適當增加DNA模板量重做實時熒光PCR檢測。重做結果Ct值≥40.0者為陰性，否則實時熒光PCR結果為陽性，按GB/T13091進行確證。3DB22/T2052—2014為了保護實驗室人員的安全，應由具備資格的工作人員檢測沙門氏菌，所有培養物和廢棄物應小心處置，并按GB/T27403中的有關