本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌的檢測(cè)方法。本文件適用于犬、豬、牛、羊等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌的檢測(cè)。或?qū)嶒?yàn)接種物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境樣本和動(dòng)物源性生物制品中布魯桿菌的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列標(biāo)準(zhǔn)所包含的條文，通過在標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時(shí)，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。GB/T14926.42實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)標(biāo)本采集GB/T18646動(dòng)物布魯桿菌病診斷技術(shù)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS269布魯桿菌病診斷NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范SN/T1088布魯桿菌病檢疫技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4臨床癥狀與病理變化按照SN/T1088執(zhí)行。5生物安全措施實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB19489的規(guī)定，應(yīng)由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行布魯桿菌病原鑒定和血清學(xué)檢驗(yàn)，所有培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后處置。病原分離培養(yǎng)工作應(yīng)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。6檢測(cè)方法6.1通用要求先進(jìn)行初篩試驗(yàn)，可任選一項(xiàng)或多項(xiàng)進(jìn)行初篩試驗(yàn)，初篩試驗(yàn)陽(yáng)性動(dòng)物需進(jìn)行確診試驗(yàn)；可任選一項(xiàng)或多項(xiàng)進(jìn)行確診試驗(yàn)。6.2樣本采集、保存與運(yùn)輸日常檢測(cè)樣本采集、保存與運(yùn)輸按照NY/T541執(zhí)行。對(duì)于出現(xiàn)布魯桿菌病癥狀或死亡的動(dòng)物，樣品采集按照GB/T18646執(zhí)行。6.3初篩試驗(yàn)-虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）6.3.1樣本血清。6.3.2試劑商品化粗糙型和平滑型布魯桿菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、粗糙型和平滑型布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。6.3.3主要設(shè)備離心機(jī)、渦旋振蕩儀。6.3.4材料移液器、無菌移液器吸頭、計(jì)時(shí)器、牙簽或混勻棒、潔凈玻璃板。6.3.5操作方法6.3.5.1將待檢血清、粗糙型和平滑型布魯桿菌陰、陽(yáng)性血清和抗原從冰箱中取出，平衡至室6.3.5.2震蕩混勻血清和抗原，分別吸取25μL血清和抗原，加到玻璃板上，豬、牛、羊僅需用平滑型布魯桿菌虎紅凝集抗原進(jìn)行檢測(cè)，犬需要同時(shí)用粗糙型和平滑型布魯桿菌虎紅凝集抗原進(jìn)行檢測(cè)。6.3.5.3用牙簽或者混勻棒快速混勻血清和抗原，不斷搖動(dòng)玻璃板，4min內(nèi)觀察結(jié)果。6.3.5.4試驗(yàn)需設(shè)陰、陽(yáng)血清對(duì)照，分別為布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽(yáng)性血清。6.3.6結(jié)果判定6.3.6.1標(biāo)準(zhǔn)陰性血清不出現(xiàn)凝集、陽(yáng)性血清出現(xiàn)凝集時(shí)，試驗(yàn)成立，方可對(duì)受檢血清進(jìn)行判定。6.3.6.2出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判定為陽(yáng)性（+無凝集現(xiàn)象且血清虎紅混合液呈均勻粉紅色者判為陰性（-）。6.4初篩試驗(yàn)-膠體金免疫層析試驗(yàn)（GICA）6.4.1樣本血清或血漿。6.4.2試劑商品化粗糙型和平滑型布魯桿菌病抗體檢測(cè)卡（膠體金法）、粗糙型和平滑型布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。6.4.3材料移液器、無菌移液器吸頭、計(jì)時(shí)器。6.4.4操作方法6.4.4.1取出檢測(cè)卡，平放于桌面上。6.4.4.2用試劑盒自帶的吸管吸取樣本，滴入1滴于預(yù)裝有稀釋液的樣品管中，顛倒混勻。6.4.4.3吸取稀釋后樣本，垂直加入3滴于加樣孔中。6.4.4.4等待15分鐘判讀結(jié)果，20分鐘后的結(jié)果視為無效。6.4.4.5需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)血清對(duì)照，牛、羊、豬僅用平滑型布魯桿菌陽(yáng)性血清作為對(duì)照即可，犬需同時(shí)設(shè)置平滑型和粗糙型布魯桿菌對(duì)照。6.4.5結(jié)果判定陽(yáng)性：檢測(cè)線（T線）和對(duì)照線（C線）都出現(xiàn)線條。陰性：檢測(cè)線（T線）上沒有線條，只在對(duì)照線（C線）上出現(xiàn)線條。無效：在觀察窗內(nèi)，對(duì)照線區(qū)（C）和檢測(cè)區(qū)（T）都不出現(xiàn)線條，或僅檢測(cè)區(qū)（T）出現(xiàn)線條。6.5初篩試驗(yàn)-間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）6.5.1樣本血清或血漿。6.5.2試劑商品化布魯桿菌病ELISA檢測(cè)試劑盒、粗糙型和平滑型布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。6.5.3設(shè)備材料恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、移液器、移液器吸頭。6.5.4操作方法6.5.4.1將待檢血清、陰性對(duì)照血清和陽(yáng)性對(duì)照血清用樣品稀釋液作1:50稀釋。6.5.4.2將稀釋好的待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清分別加入ELISA板相應(yīng)孔中，每孔100μL，每份待檢血清加樣1孔，陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清各加2孔。加樣結(jié)束后，37℃作用30分鐘。取出反應(yīng)板，棄去反應(yīng)液，每孔加入1×洗滌液300μL，洗滌3次，最后1次甩干或拍干。6.5.4.3將HRP標(biāo)記IgG用稀釋液作1:200稀釋后每孔加入100μL，37℃作用30分鐘。洗滌3次，最后1次甩干或拍干。6.5.4.4將底物溶液A和B按1:1混合后,立即加入ELISA反應(yīng)板中,每孔100μL,室溫避光顯6.5.4.5每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)。6.5.4.6反應(yīng)終止后，15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。6.5.5結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)血清對(duì)照成立時(shí)，按照試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判定。6.6確診試驗(yàn)-試管凝集試驗(yàn)（SAT）6.6.1樣本血清。6.6.2試劑商品化粗糙型和平滑型布魯桿菌試管凝集抗原、布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、稀釋液為含0.5%石碳酸的生理鹽水（或）含0.5%石碳酸的10%氯化鈉溶液（用于檢驗(yàn)羊血清時(shí)稀釋血清和抗原）6.6.3設(shè)備材料恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、移液器、移液器吸頭。6.6.4操作方法6.6.4.1血清稀釋a)每份血清用4支凝集管；b)標(biāo)記樣本編號(hào)后，第1管加入920μL稀釋液；c)第2管～4管加入500μL稀釋液；d)然后取待檢血清80μL，加入第1管中，混合均勻；e)取第1管中的500μL混合液加入第2管并混合均勻，如此倍比稀釋至第4管，從第4管中吸取500μL混合液，棄掉。f)稀釋完畢，從第1～第4管的血清稀釋度分別為1:12.5、1:25、1:50和1:100。6.6.4.2按說明書要求稀釋抗原液，上述第1管～第4管中分別加入500μL稀釋后抗原液，并混合均勻，此時(shí)各管血清稀釋倍數(shù)為1﹕25、1﹕50、1﹕100、1﹕200。。6.6.4.3大規(guī)模檢疫時(shí)也可只用2個(gè)血清稀釋度（加抗原后的終稀釋度即豬、羊和犬用1:256.6.4.4每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)陽(yáng)性血清、陰性血清和抗原對(duì)照，即：a)陰性血清對(duì)照：陰性血清按說明書稀釋到規(guī)定容量后，對(duì)照試驗(yàn)中稀釋和加抗原的方法與待檢血清相同；b)陽(yáng)性血清對(duì)照：陽(yáng)性血清按說明書稀釋到規(guī)定容量后，對(duì)照試驗(yàn)中稀釋和加抗原的方法與待檢血清相同；c)抗原對(duì)照：按說明書要求稀釋抗原液500μL，再加500μL稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。6.6.4.5將加樣后的試管置于37℃±1℃培養(yǎng)箱中孵育18h～24h，取出觀察并記錄結(jié)果。6.6.5比濁管制作每次試驗(yàn)需配制比濁管作為判定清亮程度（凝集反應(yīng)程度）的依據(jù)，先將已經(jīng)稀釋好的工作抗原用等量稀釋液做對(duì)倍稀釋，然后按表1配制比濁管。管號(hào)對(duì)倍稀釋后的抗原液稀釋液清亮度記錄標(biāo)記1++++2250μL750μL75%+++3500μL500μL50%++4750μL250μL25%+50%-6.6.6結(jié)果判定6.6.6.1判定標(biāo)準(zhǔn)a)++++：液體完全透明，管底出現(xiàn)大片的傘狀沉淀。b)+++：液體幾乎透明，管底出現(xiàn)明顯的傘狀沉淀。c)++：液體不甚透明，管底出現(xiàn)片狀沉淀，振蕩時(shí)易碎成小絮片狀。d)+：液體不透明，管底有松散沉淀。e)－：液體不透明，管底無傘狀沉淀，菌體下沉呈圓點(diǎn)狀。6.6.6.2試驗(yàn)成立條件當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照血清出現(xiàn)完全凝集陰性對(duì)照血清無凝集抗原對(duì)照無自凝（－）現(xiàn)象時(shí)，試驗(yàn)成立，可對(duì)結(jié)果進(jìn)行如下判定：a)血清稀釋度1:50，出現(xiàn)“”及以上凝集現(xiàn)象時(shí)，判定為陽(yáng)性；c)可疑動(dòng)物，間隔3~4周須重新采血，再次檢驗(yàn)，如凝集價(jià)不斷上升，可判為陽(yáng)性，若重檢仍為可疑反應(yīng)，同時(shí)該群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中既無本病流行情況，又無臨床病例時(shí)，則可判為陰性。6.7確診試驗(yàn)-競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)6.7.1樣本血清或血漿。6.7.2試劑布魯桿菌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒、粗糙型和平滑型布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。6.7.3設(shè)備材料恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、移液器、移液器吸頭。6.7.4操作方法6.7.4.1將待檢血清、陰性對(duì)照血清和陽(yáng)性對(duì)照血清用樣品稀釋液作1:10稀釋。6.7.4.2將稀釋好的待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清分別加入ELISA板相應(yīng)孔中，每孔50μL，再按50μL/孔加入單抗工作液和酶標(biāo)記物的混合物，加完后震蕩混勻。6.7.4.3蓋上封板膜，甩掉板孔中的溶液，每孔加入300μL工作濃度洗滌液，洗滌5次，最后1次甩干或拍干。6.7.4.4每孔加顯色液100μL，輕微震蕩混勻，蓋上封板膜室溫25℃±5℃避光顯色15分鐘。6.7.4.5每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)。6.7.4.6反應(yīng)終止后，10分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。6.7.5結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)血清對(duì)照成立時(shí)，按照試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判定。6.8確診試驗(yàn)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（BCSP31-PCR）6.8.1樣本可采集EDTA抗凝血、生殖道分泌物、流產(chǎn)胎兒、胎盤、精液和體液的一種或多種，用商品化基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。6.8.2試劑耗材多重PCR試劑、無RNA酶水、瓊脂糖、Maker、PCR管等。6.8.3主要設(shè)備離心機(jī)、PCR儀、水浴箱/金屬浴、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。6.8.4操作方法6.8.4.1引物序列參照WS269-2019布魯桿菌病診斷附錄D2.5.1，引物序列見表2。表2PCR引物序列引物名稱引物序列B4TGGCTCGGTTGCCAATATCAAB5CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG6.8.4.2反應(yīng)體系反應(yīng)體系見表3。表3反應(yīng)體系反應(yīng)組分用量/μLdNTPsMixture（各2.5mM）10×PCRBuffer（Mg2+plus）2TaqHS酶（5U/μL）0.5B4引物(l0μmol/L)1B5引物(10μmol/L)1DNA模板2Nuclease-FreeWater總體積206.8.4.3PCR對(duì)照同時(shí)設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為無RNA酶水，陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。6.8.4.4擴(kuò)增程序?qū)⑸鲜黾尤隓NA模板的PCR管，置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：94℃4min預(yù)變性；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（94℃1min，58℃退火1min，72℃延伸1min最后72℃延伸5min。配置1.5%瓊脂糖凝膠，同時(shí)加入核酸染料，取PCR產(chǎn)物10μL與適量6×LoddiongBuffer混合，上樣，每孔10μL，同時(shí)設(shè)Maker-100bpDNAladder，110V電泳40min，凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增條帶。6.8.6結(jié)果判定當(dāng)陰性對(duì)照不出現(xiàn)條帶、陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)224bp擴(kuò)增條帶，試驗(yàn)成立，樣本擴(kuò)增出224bp條帶，判為布魯桿菌陽(yáng)性。6.9確診試驗(yàn)-實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)參照SN/T1088布魯桿菌病檢疫技術(shù)規(guī)范。6.9.1樣本可采集EDTA抗凝血、生殖道分泌物、流產(chǎn)胎兒、胎盤、精液和體液的一種或多種，用商品化基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。6.9.2試劑耗材熒光定量PCR試劑、無RNA酶水、PCR管等。6.9.3主要設(shè)備離心機(jī)、熒光定量PCR儀、水浴箱/金屬浴。6.9.4操作方法6.9.4.1引物探針序列見表4。表4引物探針序列引物探針名稱引物序列6.9.4.2反應(yīng)體系反應(yīng)體系見表5。表5反應(yīng)體系反應(yīng)組分20μL體系2xMix正向引物(l0μmol/L)0.4反向引物(10μmol/L)0.4探針(10μmol/L)0.2cDNA模板2Nuclease-FreeWater76.9.4.3反應(yīng)條件將上述加入DNA模板的PCR管，置于熒光定量PCR儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：95℃10min預(yù)變性；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（95℃15s，60℃退火1min）。上述反應(yīng)條件是以Promega熒光定量PCR試劑為例，實(shí)際反應(yīng)條件需根據(jù)試劑說明書進(jìn)行調(diào)整。6.9.5結(jié)果判定6.9.5.1結(jié)果分析條件設(shè)定綜合分析儀器給出的各項(xiàng)結(jié)果，基線以儀器給出的默認(rèn)值作為參考。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，具體根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。選擇FAM通道進(jìn)行分析。6.9.5.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照樣品有對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，而且Ct值＜30。陰性對(duì)照