GB/T14926—××××實驗動物漢坦病毒檢測方法本文件規定了漢坦病毒（HV）的抗體和核酸檢測方法、試劑等。本文件適用于小鼠、大鼠等實驗動物HV的檢測。或實驗接種物、實驗動物環境樣本和動物源性生物制品中漢坦病毒的檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本適用于本文件。GB/T14926.50實驗動物酶聯免疫吸附試驗GB/T14926.52實驗動物免疫熒光試驗GB19489GB19489GB/T19495.2轉基因產品檢測實驗室技術要求3原理3.1抗體檢測原理根據免疫學原理，采用HV抗原檢測小鼠、大鼠血清中的HV抗體。3.2核酸檢測原理針對漢坦病毒M片段基因設計特異的引物序列，通過RT-PCR對模板RNA進行擴增，根據RT-PCR檢測結果判定該樣品中是否含有漢坦病毒，套式PCR引物中的內引物可用于病毒分型。實時熒光定量PCR方法是在常規PCR的基礎上，加入了一條特異性的熒光探針，探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，淬滅作用消失，熒光信號產生并被檢測儀器接受，隨著PCR反應的循環進行，PCR產物與熒光信號的增長呈對應關系。因此，可以通過檢測熒光信號對核酸模板進行檢測。4主要試劑和器材4.1試劑：4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特異性抗原在生物安全柜內，用Hantaan型或Seoul型毒株感染的E6細胞，當特異性熒光達到+++時，即可收獲培養物。經β丙內酯滅活并凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細胞碎片，上清液再經超速離心濃縮后制成ELISA抗原。1.14.1.1.2正常抗原E6細胞凍融破碎后，經低速離心去除細胞碎片而獲得的上清液。4.1.2抗原片在生物安全柜內，用Hantaan型或Seoul型毒株感染的E6細胞，每2~3天更換維持液，培養7~10d，用IFA法測定細胞內特異性熒光，當熒光達到+++時，將細胞用胰酶分散，用PBS洗滌，涂片，室溫干燥的同時，在紫外線下20cm處照射30min，冷丙酮固定10min，-20°C保存。4.1.3陽性血清免疫SPF小鼠或大鼠所獲得的抗血清。4.1.4陰性血清SPFSPF小鼠或大鼠血清。4.1.5酶結合物辣根過氧化物酶標記羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗體。用于檢測相應動物血清抗體；辣根過氧化物酶標記葡萄球菌蛋白A（SPA）,用于檢測小鼠血清抗體。4.1.6熒光標記物異硫氰酸熒光素標記羊或兔抗小鼠、大鼠異硫氰酸熒光素標記羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗體用于檢測相應動物血清抗體。4.1.7核酸檢測試劑4.1.7.1經DEPC處理的無核酸酶水。4.1.7.2市售病毒RNA提取試劑盒。4.1.7.3市售商品化實時熒光定量RT-PCR基礎反應液。4.1.7.4陽性對照：為滅活的含有漢坦病毒的組織樣本或細胞培養物。4.1.7.5陰性對照：為不含漢坦病毒的細胞培養物的組織樣本。4.1.7.6根據表1和表2的序列合成引物和探針，并配制成10μmol/L儲備液，-20℃保存。產物大小/bp②探針也可選用具有與FAM、HEX和BHQ2相同檢測效果的其他合適的熒光報告基團和熒光淬滅基團組合。4.2器材4.2.1酶標儀。4.2.14.2.2熒光顯微鏡。4.2.24.2.3普通顯微鏡。4.2.34.2.437℃培養箱或水浴箱。4.2.5實時熒光PCR儀。4.2.54.2.6PCR儀。4.2.7電泳儀4.2.8凝膠成像分析系統5檢測方法5.1采用ELISA方法（見GB/T14926.50）進行血清學檢測。5.2采用IFA方法（見GB/T14926.52）進行血清學檢測。5.3采用普通RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR方法（見附錄A）進行漢坦病毒核酸檢測。6結果判定對陽性檢測結果，選用同一種方法或另一種方法復檢。如仍為陽性則判為陽性。7結果報告根據判定結果，出具報告。（規范性附錄）實驗動物漢坦病毒核酸檢測方法A.1主要設備和材料A.1.1實時熒光PCR儀A.1.2PCR儀。A.1.4凝膠成像分析系統。A.1.5Nanodrop紫外分光光度計。A.1.6高速冷凍離心機A.1.7臺式離心機。A.1.8恒溫孵育器。A.1.9漩渦振蕩器。A.1.10組織勻漿器或手持式均質器。A.1.11生物安全柜。A.1.12PCR工作臺。A.1.13-80℃冰箱，-20℃冰箱，2~8℃冰箱。A.1.14微量移液器（10μL，100μL，1000μLA.1.15無RNase和DNase的離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL無RNase和DNase的吸頭（10μL，200μL，1mL無RNase和DNase的PCR擴增反應管。A.2試劑除特別說明外，以下實驗用試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。A.2.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H20）27.6g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.2B液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制取A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，加800mL去離子水溶解稀釋，用HCl調pH至7.2，最后定容至1000mL，經121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.2無DNase/RNase去離子水實驗用去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.3RNA抽提試劑TRIzol或其他等效產品。A.2.4無水乙醇。A.2.575%乙醇（無DNase/RNase去離子水配制）。A.2.6三氯甲烷（氯仿）。A.2.7異丙醇。A.2.8逆轉錄試劑A.2.9PCR試劑：rTaq酶、10×PCRBuffer、dNTP。A.2.10DNA分子質量標準。A.2.11TAE電泳緩沖液A.2.11.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2·H2O）滅菌去離子水5mol/L氫氧化鈉溶液滅菌去離子加至100mL，121℃,15min滅菌備用。A.2.11.250×TAE電泳緩沖液配制羥基甲基氨基甲烷(Tris)冰乙酸0.5mol/LEDTA溶液，pH8.0滅菌去離子加至1000mL，121℃,15min滅菌備用。用時用滅菌去離子水稀釋至l×使用。A.2.12溴化乙錠：10mg/mL溴化乙錠滅菌去離子水A.2.131.5%瓊脂糖凝膠瓊脂糖18.61g80mL調pH至8.0242gl00mL200mg20mL1×TAE電泳緩沖液加至l00mL混合后加熱至完全融化,待冷至50℃~55℃時，加溴化乙錠(EB)或其他等效核酸染料，輕輕晃動搖勻后將瓊脂糖溶液倒入電泳板制成凝膠。A.2.14一步法反轉錄-熒光定量PCR試劑盒或等效試劑盒。A.2.15引物和探針：根據表1和表2的序列合成引物和探針，引物和探針加無RNase去離子水分別配制成20μmol/L儲備液，-20℃保存。A.3采樣及樣本的處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過程中須戴一次性手套A.3.1臟器組織剖檢，無菌采集動物肺臟和脾臟，剪取待檢樣本2.0g于無菌5mL離心管，加入4mL滅菌PBS，使用電動勻漿器充分勻漿1~2min，然后將組織懸液在4℃、3000r/min離心10min，取上清液轉入另一無菌5mL離心管中，編號備用。A.3.2細胞培養物方法一：直接刮取樣本接種后出現CPE或可疑的細胞培養物于15mL離心管中，3000r/min離心10min，去上清，加1mL滅菌PBS重懸細胞，然后將細胞懸液轉移到無菌1.5mL離心管中，編號備用。方法二：將樣本接種后出現CPE或可疑的細胞培養物反復凍融3次，細胞混懸液轉移于15mL離心管中，12000r/min離心10min，去細胞碎片，上清液轉移到無菌15mL離心管中，編號備用。A.3.3實驗動物環境A.3.3.1實驗動物飼料、墊料和飲水取適量實驗動物飼料和墊料置于聚乙烯薄膜袋中，加入適量滅菌PBS(飼料和墊料需全部浸泡于液體中)。密封后浸泡5~10min，充分混勻，將混懸液轉移至15mL離心管中，4℃、12000r/min離心10min，取上清液轉入另一無菌5mL離心管中，編號備用。取適量實驗動物飲水直接轉移到無菌5mL離心管中，編號備用。A.3.3.2實驗動物設施設備用滅菌棉拭子拭取實驗動物設施設備出風口初效濾膜表面沉積物，將拭子置入滅菌15mL離心管，加入適量滅菌PBS，浸泡5~10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃、12000r/min離心10min，取上清液轉入另一無菌5mL離心管中，編號備用。A.3.4樣本的存放采集或處理的樣本在2~8℃條件下保存應不超過24h，若需長期保存，須放置-80℃冰箱，但應避免反復凍融(凍融不超過3次)。A.4病毒核酸提取選擇市售商品化RNA提取試劑盒。按照試劑盒操作說明書提取樣品中的RNA。在提取RNA時應設立陽性和陰性對照樣品，按同樣方法提取RNA。RNA的提取操作應在生物安全柜中進行，避免RNA氣溶膠的污染。制備好的RNA應盡快進行下一步PCR反應，若暫時不能進行PCR反應，應于-80℃冰箱保存備用。A.5普通RT-PCRA.5A.5.1第一輪RT-PCRA.5.1.1RT-PCR反應體系第一輪RT-PCR反應體系見表3。反應液的配制在冰浴上操作，每次反應同時設計陽性對照、陰性對照和空白對照，其中陽性對照以含有HV的組織或培養物提取的DNA作為陽性對照模板，其中陰性對照以不含有HVDNA樣本（可以是正常動物組織或正常培養物）作為陰性對照模板，空白對照即為不加模板對照（NoTemplateControl，NTC即在反應中用水來代替模板。2229A.5.1.2RT-PCR反應參數RT-PCR反應參數見表4。111注：可使用其他等效的一步法或兩步法RT-PCR檢測試劑盒進行，反應體系和反應參數可進行相應調整。A.5.2第二輪RT-PCR取第一輪RT-PCR的擴增產物10μL作為模板，分別采用漢灘型和漢城型兩對型特異性引物，參照7.4.1第一輪RT-PCR的反應體系和反應參數(省去逆轉錄步驟)進行第二輪PCR擴增。A.5.3PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測和拍照將適量50×TAE稀釋成1×TAE溶液，配制含核酸染料溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠。PCR反應結束后，取10μLPCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，以DNA分子質量作為參照。電壓大小根據電泳槽長度來確定，一般控制在3~5V/cm，當上樣染料移動到凝膠邊緣時關閉電源。電泳完成后在凝膠成像系統拍照記錄電泳結果。A.5.4RT-PCR結果判定A.5.4.1質控標準A.5.4.1.1第一輪RT-PCR反應(外引物)中，陰性對照和空白對照未出現條帶，陽性對照出現預期大小(464bp)的擴增條帶則表明反應體系運行正常。A.5.4.2第一輪RT-PCR反應(外引物)中，陰性對照和空白對照未出現條帶，陽性對照也未出現預期大小(464bp)的擴增條帶。但是第二輪PCR反應(基因型鑒別引物)中一對引物的陽性對照出現預期大小(383bp或418bp)的擴增條帶則表明反應體系運行正常，且陰性對照和空白對照未出現目的條帶。A.5.4.3符合上述兩種情況之一，即可進行結果判定；否則此次試驗無效，需重新進行普通PCR擴增。A.5.4.4結果判定A.5.4.4.1樣本經瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察到383bp擴增條帶，判為漢灘型漢坦病毒核酸陽性。A.5.4.4.2樣本經瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察到418bp擴增條帶，判為漢城型漢坦病毒核酸陽性。A.5.4.4.3樣本經瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上均未觀察到383bp和418bp擴增條帶，判為漢坦病毒核酸陰性。A.6實時熒光定量RT-PCRA.6.1實時熒光定量RT-PCR反應體系實時熒光定量RT-PCR反應體系見表5。反應液的配制在冰上操作，每次反應同時設計陽性對照、陰性對照和空白對照，其中陽性對照以含有HV的組織或細胞培養物提取的DNA作為陽性對照模板，其中陰性對照以不含有HVDNA樣本(可以是正常動物組織或正常細胞培養物)作為陰性對照模板，空白對照即為不加模板對照(NoTemplateControl，NTC)，即在反應中用水來代替模板。1111111116注：試劑Rox只在具有Rox熒光校正通道的實時熒光PCR儀上進行擴增時添加，否則用水補齊。PCR反應體系也可以根據不同市售商品化實時熒光定量售商品化實時熒光定量RT-PCR基礎反應液的說明書進行配置。A.6.2實時熒光PCR反應參數實時熒光PCR反應參數見表6。否11是注：注：PCR反應參數也