第三章細(xì)胞生物學(xué)研究辦法西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馮全義重要內(nèi)容第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)構(gòu)造的觀察辦法第二節(jié)細(xì)胞組分的分析辦法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)構(gòu)造的觀察辦法一光學(xué)顯微鏡技術(shù)1、根據(jù)光源不同，可分為:1）、光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外光）為光源2）、電子顯微鏡：以電子束為光源光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下的細(xì)胞構(gòu)造2、分辨率(resolution)R=0.61λ/nSinαn=介質(zhì)的折射率；空氣為1.油為1.5α=樣品對物鏡角孔徑的半角；sinα的最大值為1λ=照明光源的波長0.61是一種恒定的參數(shù)；表達(dá)成像的點雖被重疊但仍能被區(qū)別的程度分辨率概念：是指能分辨兩個物點間最小距離的能力分辨距離越小，分辨率越高，即分辨細(xì)微構(gòu)造的能力越大提高分辨能力的辦法：變化n：n越大；R越?。环直婺芰米兓耍害嗽叫?；R越?。环直婺芰?、放大率最后成像的大小與原物體大小的比值總放大率=物鏡放大率×目鏡放大率例如：目鏡10X；物鏡40X；則總放大率400X注意分辨率與放大率的分辨電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領(lǐng)光源透鏡真空光學(xué)顯微鏡300nm可見光玻璃透鏡不需真空

200nm(油鏡)可見光玻璃透鏡不需真空100nm

紫外光玻璃透鏡不需真空電子顯微鏡0.1nm電子束電磁透鏡真空3、普通光學(xué)顯微鏡構(gòu)成

①照明系統(tǒng)：光源、聚光器②光學(xué)放大系統(tǒng)：物鏡、目鏡構(gòu)成；為了消除球差和色差③機(jī)械裝置：用于固定材料和觀察方便雙筒顯微鏡：亮度較單筒暗；雙眼觀察立體感較單筒強(qiáng)雙筒顯微鏡

單筒顯微鏡（二）、熒光顯微鏡

(fluorescencemicroscope)

1、工作原理：運(yùn)用紫外線光源(如弧光燈、水銀燈等發(fā)出)通過照明設(shè)備把切片或活染細(xì)胞透視出來1）自發(fā)熒光細(xì)胞中有些物質(zhì)（如葉綠素等）紫外線照射后可發(fā)熒光2）誘發(fā)熒光某些物質(zhì)紫外線照射后不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）

2、熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別1）照明方式：普通為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上2）光源：為紫外光，波長較短，分辨力高3）特殊的濾光鏡系統(tǒng)片激發(fā)濾色鏡（exciterfilter）：光源前的用以濾除不需要的光線UV（紫外）；V（紫）；B（藍(lán)）；G（綠）阻斷濾色鏡（barrierfilter）：目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，保護(hù)眼睛

落射式照明原理

熒光顯微鏡的光通路

尼康E800熒光顯微鏡其它類型的顯微鏡（三）、激光共聚焦掃描顯微境(laserconfocalscanningmicroscope)用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面掃描成像分辨力較高，是普通光鏡的3倍激光共聚焦掃描顯微鏡

LCSM照片藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管

（四）、暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)用特殊的聚光器使照明光線不能進(jìn)入物鏡被放大在黑暗的背景下呈現(xiàn)明亮的像反差增大，分辨率提高觀察未經(jīng)染色的活體或膠體粒子

（五）、相差顯微鏡相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）荷蘭人Zernike1932年發(fā)明，獲1953年諾貝爾物理獎作用：可觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞基本原理：把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，而提高構(gòu)造間的對比度入射光環(huán)共軛區(qū)補(bǔ)償區(qū)(并協(xié)區(qū))（六）、偏光顯微鏡（polarizingmicroscope）檢測有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體等光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光（七）、微分干涉差顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope）1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明DIC顯微鏡又稱Nomarski相差顯微鏡（Nomarkicontrastmicroscope）運(yùn)用的偏振光;標(biāo)本可略厚，折射率差別更大基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作（八）、倒置顯微鏡倒置顯微鏡特點:物鏡與照明系統(tǒng)顛倒觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞含有相差物鏡萊卡倒置顯微鏡

普通光學(xué)顯微鏡的樣品制備與觀察1、樣品的固定(fixation)●目的:1)殺死細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞的化學(xué)成分2)使樣品在背面的解決和切片時不受到破壞●做法:最簡樸是直接浸泡在固定液中普通用有緩沖作用的醛類固定液，(甲醛或戊二醛)●醛類固定液作用機(jī)理：能夠與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價鍵，而將鄰近的蛋白質(zhì)分子交聯(lián)一起2、包埋和切片(embeddingandsectioning)●包埋:慣用包埋劑:液態(tài)的石蠟或樹脂使之滲入整塊組織，后將之硬化成固體的包埋塊●切片：切片機(jī)切割包埋塊，制備成薄切片合用于光學(xué)顯微鏡觀察的切片厚度為l～10μm

切片機(jī)進(jìn)行樣品切片

3、染色(staining)：●目的:給細(xì)胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特性●某些典型的有機(jī)染料●蘇木精(hematoxylin):能顯示出細(xì)胞內(nèi)核酸的分布●伊紅(eosin):可使細(xì)胞質(zhì)染色●蘇丹染料(Sudandyes)的乙醇飽和溶液:能使脂肪著色4、有些過程需進(jìn)行脫水解決二、電子顯微鏡(electronmicroscope)

1、發(fā)明1932年德國人MaxKnolls和ErnstRuska發(fā)明第一臺電子顯微鏡光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下的細(xì)胞構(gòu)造2、電鏡分類透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscopy，SEM)光鏡與透射電鏡的構(gòu)造光學(xué)顯微鏡、TEM、SEM成像原理比較

3、透射電子顯微鏡基本構(gòu)造三大部分構(gòu)成∶1、電子光學(xué)系統(tǒng)(鏡筒)：照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)、觀察窗和統(tǒng)計用的攝影機(jī)等2、真空系統(tǒng)：●作用：避免：陰極與陽極之間會放電，燈絲也會因受到氧化或被陽離子轟擊而縮短壽命3、電子學(xué)系統(tǒng)(供電系統(tǒng))供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓●TEM的分辨力可達(dá)0.2nm●超薄切片：電子束的穿透力很弱標(biāo)本厚度約50nm的超薄切片4、透射電鏡制樣技術(shù)

1）固定樣品：鋨酸（OsO4）和戊二醛2）包埋及超薄切片：以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推動的方式推動樣品切片，切片厚度20~50nm3）負(fù)染色技術(shù)用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色；吸去染料，樣品干燥后●樣品凹陷處：薄層重金屬鹽●樣品凸出處：沒有染料沉積，而出現(xiàn)負(fù)染效果4）冰凍斷裂與冰凍蝕刻技術(shù)1、標(biāo)本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，進(jìn)行冰凍2、后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面構(gòu)造，稱為蝕刻（etching）3、蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強(qiáng)反差和強(qiáng)度4、后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）5、復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的構(gòu)造冰凍蝕刻電鏡照片

5、掃描電子顯微鏡

（scanningelectronmicroscope，SEM，）1）構(gòu)成掃描電子顯微鏡重要由電子光學(xué)系統(tǒng)和顯示單元構(gòu)成2）工作原理：A：用細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子次級電子的多少與樣品的表面構(gòu)造有關(guān)B：次級電子由探測體收集，并被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘朇：再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹?qiáng)度，顯示出與電子束同時的掃描圖像圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面構(gòu)造

3）標(biāo)本制作：為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號現(xiàn)在掃描電鏡的分辨力為6~10nm（三）、掃描隧道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope，STM)1、發(fā)明IBM公司瑞士蘇黎世研究所BinningG.和RohrerH.等在1981年發(fā)明含有原子顯像力的顯微鏡，是根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)原理而制成的1986年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎第二節(jié)細(xì)胞組分的分析辦法第一部分細(xì)胞分離技術(shù)一、離心技術(shù)1、應(yīng)用領(lǐng)域研究如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及多個大分子基本手段高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機(jī)轉(zhuǎn)速超速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速超出25Kr/min，離心力不不大于89Kｇ的離心機(jī)2、離心辦法分類（一）、差速離心（differentialcentrifugation）（二）、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）

（一）、差速離心

（differentialcentrifugation）

在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器在差速離心中細(xì)胞器沉降的次序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體差速離心的原理

（二）、密度梯度離心1、（densitygradientcentrifugation）原理：用一定的介質(zhì)在管內(nèi)形成一持續(xù)或不持續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離2、慣用的介質(zhì)：為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖3、分離活細(xì)胞的介質(zhì)規(guī)定：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高2）PH中性或易調(diào)為中性3）濃度大時滲入壓不大4）對細(xì)胞無毒4、分為：1）速度沉降（梯度沉降）2）等密度沉降1、速度沉降（梯度沉降）（velocitysedimentation）1）重要用于：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器2）規(guī)定采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)不大于被分離生物顆粒的最小密度生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中各自以不同的速度沉降2、等密度沉降（isopycnicsedimentation）1）合用于：分離密度不等的顆粒2）原理細(xì)胞或細(xì)胞器在持續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與本身密度相等的介質(zhì)處，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離3）規(guī)定普通在較高密度的介質(zhì)中進(jìn)行介質(zhì)的最高密度應(yīng)不不大于被分離組分的最大密度介質(zhì)的梯度規(guī)定較高的陡度，不能太平緩常需要高速或超速離心，離心時間也較長二、流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometer）

1、用途：單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選2、基本原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴---形成含單個細(xì)胞的液滴--在激光束照射下，細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光--經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機(jī)解決，輸出統(tǒng)計成果第二部分：生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)

一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)運(yùn)用染色劑可同細(xì)胞的某種成分發(fā)生反映而著色的原理，對某種成分進(jìn)行定性或定位研究的技術(shù)。顯示細(xì)胞的成分：無機(jī)物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等（一）、固定：1．物理固定：如空氣快速干燥、冷凍干燥或直接冷凍切片。2．化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等（二）、顯示辦法1.金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，產(chǎn)物最后身成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性2.偶氮偶聯(lián)法：酚類化合物與偶氮染料結(jié)合后能夠形成耐曬染料3.

Schiff反映：細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。慣用于顯示脫氧核糖核酸（Feulgen反映）4.

聯(lián)苯胺反映：過氧化物酶分解H202，產(chǎn)生新生氧，氧再將無色的聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物5.普魯士藍(lán)反映：Fe3＋與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍(lán)

6.脂溶染色法：蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色7.

茚三酮反映：顯示蛋白質(zhì)二、免疫細(xì)胞化學(xué)

1、原理：運(yùn)用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)。2、慣用的標(biāo)記物：熒光素和酶A慣用的螢光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等B慣用的酶：辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反映后形成不透明的沉積物，而顯示出抗原存在的部位3、慣用辦法據(jù)抗體與抗原的結(jié)合辦法分為：1：直接法：是將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反映，顯示出抗原存在的部位2、間接法：是在抗體抗原初級反映的基礎(chǔ)上，再用帶標(biāo)記的次級抗體同初級抗體反映，從而使初級反映得到放大，顯示增強(qiáng)三、顯微光譜分析技術(shù)

1、原理細(xì)胞中有某些成分含有特定的吸取光譜，其都有自己特性性的吸取曲線，運(yùn)用顯微分光光度計對某些成分進(jìn)行定位、定性，甚至定量測定例如：核酸的吸取波長為260nm蛋白質(zhì)的吸取波長為280nm。四、放射自顯影術(shù)

1、用途研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等2、原理:將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)---經(jīng)一段時間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠---經(jīng)放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光----然后通過顯影、定影解決顯示還原的黑色銀顆粒----即可得知標(biāo)本中標(biāo)記物的精確位置和數(shù)量實驗室普通常選用14C和3H標(biāo)記五、分子雜交技術(shù)

1、原理:含有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適宜條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子來測定單鏈分子核苷酸序列間與否有互補(bǔ)關(guān)系（一）、原位雜交（insituhybridization）用來檢測染色體上的特殊DNA序列使用帶放射性的DNA探針(或熒光物質(zhì))，通過放射自顯影來顯示位置人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交

(二）、基因克隆(genecloning)可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、選兩個最基本的特點:分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的體現(xiàn)

DNA的分子操作

六、PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒从常╬olymerasechainreaction，PCR）1、作用:在體外將微量的目的DNA大量擴(kuò)增2、反映體系：①樣品DNA②引物（primer），是人工合成的一對寡核苷酸鏈（約15-20個核苷酸）③4種dNTP；④TagDNA聚合酶，此酶最適作用溫度為75~80℃，但短時間在95℃下不失活⑤適宜的緩沖體系和適量的Mg2+3、反映過程：①變性：將反映液置于PCR儀中，提高溫度（約90-95℃）使DNA雙鏈解離②復(fù)性：降溫（約60℃左右）退火，使引物與模板結(jié)合；③延伸：升溫度至70-75℃，在引物的引導(dǎo)下合成模板單鏈的互補(bǔ)鏈，從而形成DNA雙鏈片段；④重復(fù)上述“變性——復(fù)性——延伸”的過程。經(jīng)大概20—30次循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物中重要是目的DNA第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture）是選用最佳體外生存條件對活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)2、體外細(xì)胞培養(yǎng)的條件：●物質(zhì)營養(yǎng)●生存環(huán)境●廢物的排除3、細(xì)胞培養(yǎng)方式：1）群體培養(yǎng)（massculture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層2）克隆培養(yǎng)（clonalculture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，通過生長增殖每一種細(xì)胞形成一種細(xì)胞集落●3、貼壁培養(yǎng)（單層細(xì)胞培養(yǎng)）分散的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快(就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁，貼壁后的細(xì)胞形態(tài)形成多態(tài)性，呈單層生長單層培養(yǎng)的正常細(xì)胞保持接觸克制(contactinhibition)的特性●4、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不貼壁，始終懸浮在培養(yǎng)液中生長，如T細(xì)胞5、細(xì)胞壽命正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能無限生長6、原代培養(yǎng)（primaryculture）：從動物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長比較緩慢，并且繁殖一定的代數(shù)后（普通10代以內(nèi)）停止生長，需要從更換培養(yǎng)基。7．細(xì)胞株（cellstrain）：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的含有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特性始終保持。8、細(xì)胞系：原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)初次傳代成功后即成細(xì)胞系（有的稱10代之內(nèi)的細(xì)胞為原代細(xì)胞）A:細(xì)胞系的生存期有限，稱為有限細(xì)胞系B:已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱持續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系惡性的無限細(xì)胞系(癌化細(xì)胞)普通稱為惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系永生性而無惡性的細(xì)胞系，稱無限細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系三種培養(yǎng)（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)

1、組織培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，如果條件適宜，可培養(yǎng)出再生植株根據(jù)植物細(xì)胞的全能性發(fā)展起來的運(yùn)用植物植株的不同組織培養(yǎng)成完整植株辦法葉片、莖段、根等都能夠通過誘導(dǎo)形成愈傷組織2、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：在愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術(shù)。適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物細(xì)胞工程

1、