第三章細胞生物學研究辦法西南大學生命科學學院馮全義重要內容第一節細胞形態構造的觀察辦法第二節細胞組分的分析辦法第三節細胞培養細胞工程與顯微操作技術第一節細胞形態構造的觀察辦法一光學顯微鏡技術1、根據光源不同，可分為:1）、光學顯微鏡：以可見光（或紫外光）為光源2）、電子顯微鏡：以電子束為光源光學顯微鏡和電子顯微鏡下的細胞構造2、分辨率(resolution)R=0.61λ/nSinαn=介質的折射率；空氣為1.油為1.5α=樣品對物鏡角孔徑的半角；sinα的最大值為1λ=照明光源的波長0.61是一種恒定的參數；表達成像的點雖被重疊但仍能被區別的程度分辨率概念：是指能分辨兩個物點間最小距離的能力分辨距離越小，分辨率越高，即分辨細微構造的能力越大提高分辨能力的辦法：變化n：n越大；R越小；分辨能力好變化λ：λ越小；R越小；分辨能力好2、放大率最后成像的大小與原物體大小的比值總放大率=物鏡放大率×目鏡放大率例如：目鏡10X；物鏡40X；則總放大率400X注意分辨率與放大率的分辨電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區別

分辨本領光源透鏡真空光學顯微鏡300nm可見光玻璃透鏡不需真空

200nm(油鏡)可見光玻璃透鏡不需真空100nm

紫外光玻璃透鏡不需真空電子顯微鏡0.1nm電子束電磁透鏡真空3、普通光學顯微鏡構成

①照明系統：光源、聚光器②光學放大系統：物鏡、目鏡構成；為了消除球差和色差③機械裝置：用于固定材料和觀察方便雙筒顯微鏡：亮度較單筒暗；雙眼觀察立體感較單筒強雙筒顯微鏡

單筒顯微鏡（二）、熒光顯微鏡

(fluorescencemicroscope)

1、工作原理：運用紫外線光源(如弧光燈、水銀燈等發出)通過照明設備把切片或活染細胞透視出來1）自發熒光細胞中有些物質（如葉綠素等）紫外線照射后可發熒光2）誘發熒光某些物質紫外線照射后不能發熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發熒光熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色）

2、熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區別1）照明方式：普通為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上2）光源：為紫外光，波長較短，分辨力高3）特殊的濾光鏡系統片激發濾色鏡（exciterfilter）：光源前的用以濾除不需要的光線UV（紫外）；V（紫）；B（藍）；G（綠）阻斷濾色鏡（barrierfilter）：目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，保護眼睛

落射式照明原理

熒光顯微鏡的光通路

尼康E800熒光顯微鏡其它類型的顯微鏡（三）、激光共聚焦掃描顯微境(laserconfocalscanningmicroscope)用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面掃描成像分辨力較高，是普通光鏡的3倍激光共聚焦掃描顯微鏡

LCSM照片藍色為細胞核，綠色為微管

（四）、暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)用特殊的聚光器使照明光線不能進入物鏡被放大在黑暗的背景下呈現明亮的像反差增大，分辨率提高觀察未經染色的活體或膠體粒子

（五）、相差顯微鏡相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）荷蘭人Zernike1932年發明，獲1953年諾貝爾物理獎作用：可觀察未經染色的標本和活細胞基本原理：把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，而提高構造間的對比度入射光環共軛區補償區(并協區)（六）、偏光顯微鏡（polarizingmicroscope）檢測有雙折射性的物質，如纖維絲、紡錘體等光源前有偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光（七）、微分干涉差顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope）1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎上發明DIC顯微鏡又稱Nomarski相差顯微鏡（Nomarkicontrastmicroscope）運用的偏振光;標本可略厚，折射率差別更大基因注入、核移植、轉基因等的顯微操作（八）、倒置顯微鏡倒置顯微鏡特點:物鏡與照明系統顛倒觀察培養的活細胞含有相差物鏡萊卡倒置顯微鏡

普通光學顯微鏡的樣品制備與觀察1、樣品的固定(fixation)●目的:1)殺死細胞，穩定細胞的化學成分2)使樣品在背面的解決和切片時不受到破壞●做法:最簡樸是直接浸泡在固定液中普通用有緩沖作用的醛類固定液，(甲醛或戊二醛)●醛類固定液作用機理：能夠與蛋白質的游離氨基形成共價鍵，而將鄰近的蛋白質分子交聯一起2、包埋和切片(embeddingandsectioning)●包埋:慣用包埋劑:液態的石蠟或樹脂使之滲入整塊組織，后將之硬化成固體的包埋塊●切片：切片機切割包埋塊，制備成薄切片合用于光學顯微鏡觀察的切片厚度為l～10μm

切片機進行樣品切片

3、染色(staining)：●目的:給細胞的不同組分帶上可區別的顏色特性●某些典型的有機染料●蘇木精(hematoxylin):能顯示出細胞內核酸的分布●伊紅(eosin):可使細胞質染色●蘇丹染料(Sudandyes)的乙醇飽和溶液:能使脂肪著色4、有些過程需進行脫水解決二、電子顯微鏡(electronmicroscope)

1、發明1932年德國人MaxKnolls和ErnstRuska發明第一臺電子顯微鏡光學顯微鏡和電子顯微鏡下的細胞構造2、電鏡分類透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM)掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscopy，SEM)光鏡與透射電鏡的構造光學顯微鏡、TEM、SEM成像原理比較

3、透射電子顯微鏡基本構造三大部分構成∶1、電子光學系統(鏡筒)：照明系統、樣品室、成像系統、觀察窗和統計用的攝影機等2、真空系統：●作用：避免：陰極與陽極之間會放電，燈絲也會因受到氧化或被陽離子轟擊而縮短壽命3、電子學系統(供電系統)供電系統，需要高壓穩壓●TEM的分辨力可達0.2nm●超薄切片：電子束的穿透力很弱標本厚度約50nm的超薄切片4、透射電鏡制樣技術

1）固定樣品：鋨酸（OsO4）和戊二醛2）包埋及超薄切片：以環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推動的方式推動樣品切片，切片厚度20~50nm3）負染色技術用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后●樣品凹陷處：薄層重金屬鹽●樣品凸出處：沒有染料沉積，而出現負染效果4）冰凍斷裂與冰凍蝕刻技術1、標本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，進行冰凍2、后用冷刀驟然將標本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面構造，稱為蝕刻（etching）3、蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強反差和強度4、后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）5、復膜顯示出了標本蝕刻面的形態，在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的構造冰凍蝕刻電鏡照片

5、掃描電子顯微鏡

（scanningelectronmicroscope，SEM，）1）構成掃描電子顯微鏡重要由電子光學系統和顯示單元構成2）工作原理：A：用細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子次級電子的多少與樣品的表面構造有關B：次級電子由探測體收集，并被閃爍器轉變為光信號C：再經光電倍增管和放大器轉變為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同時的掃描圖像圖像為立體形象，反映了標本的表面構造

3）標本制作：為了使標本表面發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號現在掃描電鏡的分辨力為6~10nm（三）、掃描隧道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope，STM)1、發明IBM公司瑞士蘇黎世研究所BinningG.和RohrerH.等在1981年發明含有原子顯像力的顯微鏡，是根據量子力學中的隧道效應原理而制成的1986年獲得了諾貝爾物理學獎第二節細胞組分的分析辦法第一部分細胞分離技術一、離心技術1、應用領域研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及多個大分子基本手段高速離心機：轉速為10~25Kr/min的離心機轉速超速離心機：轉速超出25Kr/min，離心力不不大于89Kｇ的離心機2、離心辦法分類（一）、差速離心（differentialcentrifugation）（二）、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）

（一）、差速離心

（differentialcentrifugation）

在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心用于分離不同大小的細胞和細胞器在差速離心中細胞器沉降的次序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內質網與高基體、最后為核蛋白體差速離心的原理

（二）、密度梯度離心1、（densitygradientcentrifugation）原理：用一定的介質在管內形成一持續或不持續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離2、慣用的介質：為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖3、分離活細胞的介質規定：1）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高2）PH中性或易調為中性3）濃度大時滲入壓不大4）對細胞無毒4、分為：1）速度沉降（梯度沉降）2）等密度沉降1、速度沉降（梯度沉降）（velocitysedimentation）1）重要用于：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器2）規定采用的介質密度較低，介質的最大密度應不大于被分離生物顆粒的最小密度生物顆粒（細胞或細器）在十分平緩的密度梯度介質中各自以不同的速度沉降2、等密度沉降（isopycnicsedimentation）1）合用于：分離密度不等的顆粒2）原理細胞或細胞器在持續梯度的介質中經足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與本身密度相等的介質處，從而將不同密度的細胞或細胞器分離3）規定普通在較高密度的介質中進行介質的最高密度應不不大于被分離組分的最大密度介質的梯度規定較高的陡度，不能太平緩常需要高速或超速離心，離心時間也較長二、流式細胞術（flowcytometer）

1、用途：單個細胞進行快速定量分析與分選2、基本原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴---形成含單個細胞的液滴--在激光束照射下，細胞發出散射光和熒光--經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機解決，輸出統計成果第二部分：生物化學與分子生物學技術

一、細胞化學技術運用染色劑可同細胞的某種成分發生反映而著色的原理，對某種成分進行定性或定位研究的技術。顯示細胞的成分：無機物、醛、蛋白質、糖類、脂類、核酸、酶等（一）、固定：1．物理固定：如空氣快速干燥、冷凍干燥或直接冷凍切片。2．化學固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等（二）、顯示辦法1.金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，產物最后身成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性2.偶氮偶聯法：酚類化合物與偶氮染料結合后能夠形成耐曬染料3.

Schiff反映：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變為紅色。慣用于顯示脫氧核糖核酸（Feulgen反映）4.

聯苯胺反映：過氧化物酶分解H202，產生新生氧，氧再將無色的聯苯胺氧化成聯苯胺藍，進而變成棕色化合物5.普魯士藍反映：Fe3＋與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍

6.脂溶染色法：蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色7.

茚三酮反映：顯示蛋白質二、免疫細胞化學

1、原理：運用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術。2、慣用的標記物：熒光素和酶A慣用的螢光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等B慣用的酶：辣根過氧化物酶，酶與底物發生反映后形成不透明的沉積物，而顯示出抗原存在的部位3、慣用辦法據抗體與抗原的結合辦法分為：1：直接法：是將帶有標記的抗體與抗原反映，顯示出抗原存在的部位2、間接法：是在抗體抗原初級反映的基礎上，再用帶標記的次級抗體同初級抗體反映，從而使初級反映得到放大，顯示增強三、顯微光譜分析技術

1、原理細胞中有某些成分含有特定的吸取光譜，其都有自己特性性的吸取曲線，運用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性，甚至定量測定例如：核酸的吸取波長為260nm蛋白質的吸取波長為280nm。四、放射自顯影術

1、用途研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等2、原理:將放射性同位素（如14C和3H）標記的化合物導入生物體內---經一段時間后，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠---經放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光----然后通過顯影、定影解決顯示還原的黑色銀顆粒----即可得知標本中標記物的精確位置和數量實驗室普通常選用14C和3H標記五、分子雜交技術

1、原理:含有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適宜條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子來測定單鏈分子核苷酸序列間與否有互補關系（一）、原位雜交（insituhybridization）用來檢測染色體上的特殊DNA序列使用帶放射性的DNA探針(或熒光物質)，通過放射自顯影來顯示位置人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交

(二）、基因克隆(genecloning)可概括為∶分、切、連、轉、選兩個最基本的特點:分子水平上的操作和細胞水平上的體現

DNA的分子操作

六、PCR技術

聚合酶鏈式反映（polymerasechainreaction，PCR）1、作用:在體外將微量的目的DNA大量擴增2、反映體系：①樣品DNA②引物（primer），是人工合成的一對寡核苷酸鏈（約15-20個核苷酸）③4種dNTP；④TagDNA聚合酶，此酶最適作用溫度為75~80℃，但短時間在95℃下不失活⑤適宜的緩沖體系和適量的Mg2+3、反映過程：①變性：將反映液置于PCR儀中，提高溫度（約90-95℃）使DNA雙鏈解離②復性：降溫（約60℃左右）退火，使引物與模板結合；③延伸：升溫度至70-75℃，在引物的引導下合成模板單鏈的互補鏈，從而形成DNA雙鏈片段；④重復上述“變性——復性——延伸”的過程。經大概20—30次循環后，擴增產物中重要是目的DNA第三節細胞培養與細胞工程與顯微操作技術

1、細胞培養技術（cellculture）是選用最佳體外生存條件對活細胞進行培養和研究的技術2、體外細胞培養的條件：●物質營養●生存環境●廢物的排除3、細胞培養方式：1）群體培養（massculture），將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細胞層2）克隆培養（clonalculture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，通過生長增殖每一種細胞形成一種細胞集落●3、貼壁培養（單層細胞培養）分散的細胞懸浮在培養瓶中很快(就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁，貼壁后的細胞形態形成多態性，呈單層生長單層培養的正常細胞保持接觸克制(contactinhibition)的特性●4、懸浮培養細胞在培養過程中不貼壁，始終懸浮在培養液中生長，如T細胞5、細胞壽命正常細胞培養的世代數有限癌細胞和轉化的細胞能無限生長6、原代培養（primaryculture）：從動物機體取出的進行培養的細胞群。原代培養的細胞生長比較緩慢，并且繁殖一定的代數后（普通10代以內）停止生長，需要從更換培養基。7．細胞株（cellstrain）：從原代培養細胞群中篩選出的含有特定性質或標志的細胞群，能夠繁殖50代左右，在培養過程中其特性始終保持。8、細胞系：原代培養的細胞經初次傳代成功后即成細胞系（有的稱10代之內的細胞為原代細胞）A:細胞系的生存期有限，稱為有限細胞系B:已獲無限繁殖能力能持續生存的細胞系，稱持續細胞系或無限細胞系惡性的無限細胞系(癌化細胞)普通稱為惡性轉化細胞系永生性而無惡性的細胞系，稱無限細胞系或轉化細胞系三種培養（二）植物細胞培養

1、組織培養：誘發產生愈傷組織，如果條件適宜，可培養出再生植株根據植物細胞的全能性發展起來的運用植物植株的不同組織培養成完整植株辦法葉片、莖段、根等都能夠通過誘導形成愈傷組織2、懸浮細胞培養：在愈傷組織培養技術基礎上發展起來的一種培養技術。適合于進行產業化大規模細胞培養，制取植物代謝產物細胞工程

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