豬腹瀉病綜合SHANDONGSINDERTEP信得科技集團成立于1999年，歷經二十余年在動保業的深耕，現已發展成為國內集獸用化藥、中苗、診斷試劑、規模化養殖管理、蛋雞產業生態服務、動物糞污有機肥、寵物功能食品等產品的國家級高新技術企業。公司旗下有17家控股、參股子公司(北京信得威特科技有限公司、青島信得藥業有限公司、山東信得動物疫苗有限公司、四川華西動物藥業有限公司、山東泰可豐生物科技有限公司、山東信達基因科技有限公術服務有限公司、得翔、信成等)。現有員工1600余人，十年以上資深員工400余名，占集團員工總數的25%。公司擁有國家認定企業技術中心、博士后科研工作站2個國家級科研平臺；擁有山東省畜禽心、山東省生物制藥工程實驗室、山東省院士工作站等10個省級科研技術創新平臺，是全國一，山東省獸藥產業技術創新聯盟理事長單位，山東省獸藥協會會長單位。迄今為止，公司主持或參與國家標準20項，榮獲各級科技進步獎18項，新獸藥證書19項，獲得各項發明專利28項、實用新型專利、外觀專利等共61項，承擔863計劃等各級科研項目57項。1豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得 1一、豬腹瀉病的病原學 22.PEDV的病原學 2 9 5.其他導致腹瀉的病原學簡介 二、豬腹瀉病的流行病學 2.豬輪狀病毒的流行病學 三、豬腹瀉病的監測與診斷1.豬腹瀉病的臨床檢測 2.PEDV和輪狀病毒的分離鑒定 3.PEDV和輪狀病毒病原診斷方法 4.豬病毒性腹瀉的監測預警 5.對疫苗的免疫效果的評估 四、豬腹瀉病的疫苗及研發進展1.商品化弱毒疫苗 232.商品化滅活疫苗 233.亞單位疫苗 4.載體類疫苗 24 24 24豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得2五、豬流行性腹瀉病的防控策略1.豬病毒性腹瀉防控關鍵點 26 263.后備母豬馴化關鍵點 284.PED馴化流程 295.PED發病場生物安全防控 306.發病豬場的處置措施 32六、豬輪狀病毒的防控策略 32.輪狀病毒發病場處置方案 343.輪狀病毒發病場生物安全 34七、大腸桿菌的防控策略 2.大腸桿菌誘因管理 3.大腸桿菌免疫方案 4.大腸桿菌發病場治療方案 36八、豬腹瀉病常見問題解答1豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得仔豬的腸道未發育完全，自身抵抗力弱，易受各種病原微生物的感染，其中以傳染性腹瀉病原感染導致死亡的損失最大。引起仔豬腹瀉的傳病原既有細菌性的，也有病毒性的。其中導致病毒性的病原gastroenteritisvirus,TGEV)、豬 豬流行性腹瀉(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由PEDV引起的一種以嘔吐，水樣腹瀉和脫水為主要特征的急性、高度接觸性傳染病。各年齡段豬對該病毒均易感，7日齡以內的哺乳仔豬癥狀最為嚴重，感染致死率高達90%-100%,給養豬業造成了極大的經濟損失。該病自被發現以來，長期影響著養豬業的發展。2010年，我國乃至世界范圍內均爆發大規模PEDV疫情，研究顯示，與傳統毒株CV777相比，流行毒株發生了較大的變異，尤其是S基因產生了較大的變異。中國在使用了GⅡb亞支目前該病仍主要依賴免疫母豬產生的母源抗體對哺乳仔豬進行被動保護，而疫苗免疫僅僅是其中一環，本手冊將從病原學、流行病學、疾病診斷檢測、疫苗及制劑和防控策略等多個維度為您梳理近年來2豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER病毒和細菌是均可導致豬群出現腹瀉的癥狀。常見的病毒性病原有豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)、丁型冠狀病毒(PDCoV)、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(SADS-CoV)、杯狀病毒(SV)、豬捷申病毒(PTV),其分類地位及流行現狀如表病毒(Norovirus,NV)、豬腸道病毒(Entervirus)、博卡病毒(Bocavirus)、豬峭病毒(Kobuvirus,PKV)、星狀病毒(Astrovirus,PAstVAV)和呼腸弧病毒(MammalianReavirus)等也能導致豬腹瀉但表1主要豬病毒性腹瀉病原的種類1α冠狀病毒屬<10日齡2α冠狀病毒屬3豬輪狀病毒(PoRV)4δ冠狀病毒10日齡左右5狀病毒(SADS-CoV)α冠狀病毒屬<10日齡6杯狀病毒(SV)札如病毒屬7豬捷申病毒(PTV)細菌和寄生蟲也能導致豬出現腹瀉癥狀。到導致腹瀉的細菌性病原有致病性大腸桿菌、梭菌、沙門氏菌、胞內勞森菌、小腸結腸炎耶爾森菌、痢疾密螺旋體、彎曲桿菌等。寄生蟲如仔豬胞屬球蟲、隱胞子蟲、蛔蟲、豬胃線蟲、弓形蟲、豬類圓線蟲、小袋纖毛蟲也能導致豬出現腹瀉癥狀。需要特別指出的是，病毒性腹瀉往往會損傷消化道細胞，進而為細菌的定植創造條件，此外由于小腸絨毛在哺乳期更新速度較慢，如遭到破壞將嚴重影響仔豬對營養物質的吸收，因此應優先防控病毒性腹瀉的感染，其中對PEDV和輪狀病毒的防控尤其需要重視。PEDV和輪狀病毒感染后常容易繼發大腸桿菌病，因此以上三種2.1分類地位1971年，英國某豬場發生了嚴重的腹瀉；此后幾年，歐洲的多個國家相繼發生了嚴重的腹瀉疫情。PEDV首次被證實于1978年，比利時科學家收集了幾份腹瀉的仔豬樣品，并在顯微鏡中發現了一株具有典型冠狀病毒特征的病毒，將其命名為CV777。后來科學家研究發現這株病毒并不是由已經發現的豬傳3隨后我國各地均發生了嚴重的腹瀉疫情。我國學者對PEDV進行分離測序，與經典PEDV毒株進行對比分析發現，我國新流行的PEDV毒株發生了明顯的變異，主要毒力基因S基因出現了插入、缺失和突變。經過遺傳進化分析，PEDV變異株為新出現的GⅡ群，與傳統毒株CV777 (GI群)等親緣關系較遠。豬流行性腹瀉病毒被病毒分類委員會(TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ITCV)歸類于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)。冠狀病毒屬(Coronavirus)總共被分為4個亞群：α-冠狀病毒(Alphacoronavirus),β-冠狀病毒(Betacoronavirus),γ-冠狀病毒(Gammacoronavirus)和δ-冠狀病毒(Deltacoronavirus)。PEDV屬于α-冠狀病毒，而冠狀病毒四個亞群分類見表2。表2冠狀病毒種類冠狀病毒屬PEDV、TGEV、HCoV-229E、PRCβ-冠狀病毒IBV、SW1、TCoV等2.2.PEDV的理化特性為：①熱穩定性差，經60℃或60℃以上為：①熱穩定性差，經60℃或60℃以上感，如：過氧乙酸(1:500)、二氯異氰脲酸鈉(1:1000)、脂質溶劑如戊二醛(1:1%氫氧化鈉(燒堿)等，皆可使PEDV失去感染力；④糞便中存活力強(見表3),N蛋白E蛋白4表3PEDV在糞便中不同條件下存活時間存活時間≥28天14-28天10分鐘(75%滅活)30分鐘10分鐘9個月PEDV基因組約為28kb左右，擁有5'端帽子結構和3'端尾巴結構，基因組含有九個基因：兩個非翻譯區(untranslatedregion,UTR)、兩個多聚蛋白、纖突蛋白(Spike,S)、小膜蛋白(Envelope,E)、膜糖蛋白(Membrane,M)、核衣殼蛋白(Nucleoprotein,N)以及一個非結構蛋白(ORF3)。其中兩個多聚蛋白ppla和pp1b,可在蛋白酶的切割作用下分解為16個非結構蛋白(NSP1-NSP16),功能如表4所示。PEDV的基因組從5端到3端依次為：5'UTR-ppla/pp1b-S基因-ORF3-E基因-M基因-N基因-3'UTR,基因組結構如圖2所示，結構蛋白功能如表5所示。PEDV的5′端及3'端的非翻譯區在UTR的ORF中存在著頸環的結構，是冠狀病毒基因表達或復制轉錄調控所必需的。NonstructuralgenesMERdRpHELExoNEndoUN7-MTase圖2PEDV的基因組結構35抑制宿主蛋白的合成，引起宿主mRNA的衰與病毒在細胞內的增殖有關，影響病毒的蛋白質表達。病毒的的木瓜樣蛋白酶(PLP),具有去泛素化酶(DUB)活性，可以識別NSP1/2,NSP2/3和NSP3/4之間NSP1、NSP2和NSP3,從而有利于病毒的復制，也可以調先天性免疫應答。屬于3C樣蛋白酶，主要參與冠狀病毒蛋白的切NSP16切割釋放，與病毒各個階段的復制有關并在病毒的期中發揮作用。激活omegasome通路使內質網產生自噬體，提高內質網上的Ptdlns3P水平，直接或間接通過MTOR信號通路的制自噬體的擴張。具有拮抗I型IFN啟動子活性和應答的功能。參與nsp12基因的合成，實現病毒基因組的完全轉錄和復程中發揮了重要作用。目前功能尚未發現。是PEDV的RNA依賴的RNA聚合酶，N轉錄復合體的中心酶。DNA和RNA。主要編碼具有尿苷酸活性的特異性核糖核酸加工過程中發揮作用。主要編碼S-腺苷甲硫氨酸依賴型核苷-2-O′甲基轉移酶。是PEDV基因組中的輔助蛋白，是一個能提高病毒增殖能力的離子通道蛋白，可以促進囊泡的形成及病毒的增殖。豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得6編碼蛋白E編碼PEDV的跨膜蛋白，主要參與病毒蛋白的搬運M編碼病毒的膜糖蛋白，蛋白上含有3個跨膜N編碼PEDV的核衣殼蛋白，具有磷酸化功能，2.4.PEDV的致病機理隨著體液的流動，主要聚集在小腸的上皮細胞，病毒進入細胞后不斷進行增殖，并向周圍健康組織擴散，直至小腸全部病變，小腸絨毛變短或者脫落，造成吸收表面積大幅度減少，從而導致消化不良，同時大量小分子物質在腸細胞表面堆積造成表面滲透壓升高，從而引起滲透性腹瀉，最終機體衰竭死亡。由于成年豬的小腸絨毛2-4天可更新一代，但乳豬-絨毛更新需要7-10天，PEDV在早期感染會導致仔豬小腸變薄，影響對營養物質的吸收，因此PEDV發病日齡越早，造成的損失越大(見圖3)。Penpheralbhoodvess7豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER豬腹瀉病綜合防控手冊SINDERPEDV感染后也會引起母豬流產，對妊娠后0-40天的母豬影響極大。根據溫氏大華農的研究數據，PEDV感染后會導致母豬分娩率降低、返情率升高、流產率升高等臨床表現，其次母豬的泌乳減少甚至停止回乳，情期紊亂，平均會耽誤1個發情周期(見表6)。胰島素生長因子及瘦素起到維持孕期穩定并抑制排卵的作用。PEDV的感染影響可能造成孕激素變化進而(3)營養不良；PEDV感染后，病毒在腸絨毛上皮細胞內復制，腸絨毛萎縮；小腸酶吸收能力的降低造成吸收不良型腹瀉，導致妊娠失敗或胚胎/胎兒死亡。2.5.PED的臨床癥狀及病理變化PEDV可以感染各個日齡段的豬只，日齡越小的豬只臨床癥狀越嚴重。PEDV的自然感染潛伏期一般為5~8天，人工感染潛伏期為10~30小時。仔豬PED發病后，2小時開始精神沉郁，食欲不振，4小時左右開始出現吐奶癥狀，6小時左右出現腹瀉癥狀，12小時左右癥狀加劇，出現脫水癥狀，24小時左右出現水樣腹瀉，脫水嚴重，仔豬頻死，36小時左右仔豬開始死亡，若仔豬耐過，則會在72小時左右出現細菌性繼發感染，需要輔助以抗生素治療，病程如圖4所示。PED產房發病非常急，并迅速擴散至8PED免疫較好的場區，在產房有母源抗體的保護，仔豬感染后不會發病，但是會體內帶毒，仔豬轉至下游保育段，受到環境應激的影響，會表現出不食、腹瀉及脫水的癥狀，如圖5所示。生長段的豬感染一般不會導致死亡，但是會損傷腸道，引起腸絨毛損傷，嚴重者會導致細菌的繼發感染，造成持續性腹瀉，影響生產成績。圖5保育豬感染PED臨床癥狀及剖檢圖片2.5.2PED臨床感染癥狀PEDV感染后可引起豬只腹瀉、嘔吐和脫水等癥狀，感染率可達90-100%。通常來說，危害最大的是一周齡內的仔豬，仔豬感染后，精神狀態較差，畏寒，缺少食欲，常常伴隨嚴重的嘔吐及脫水，最嚴重的癥狀是腹瀉。其他年齡段豬只感染后出現腹瀉，但可以恢復正常(見圖6)。9圖6仔豬感染癥狀深度的比值降低(見圖7)。圖7腸道組織學切片3.輪狀病毒的病原學3.1輪狀病毒結構及分類地位豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得表7輪狀病毒基因及功能核蛋白，刺激病毒的RNA復制甲基轉移酶內衣殼蛋白其病毒粒子由外至內為三層結構，最外層為VP7蛋白和VP4蛋白，下層為VP6蛋白，最內層為VP2、VP1和VP3錨定在VP2蛋白內側，在病毒復制發揮作用(見圖8)。VP7蛋白上含有病毒的主要中和表位區，VP4蛋白上含有血凝素抗原，VP6蛋白在病毒粒子中占比超過50%,是最豐富的抗原，通過序列對比分析VP6基因確定病毒的基因型，核苷酸同源性>53%的毒株為同一基因型，共劃分為10種輪狀病毒(A-J)。根據VP4和VP7的基因還可以把輪狀病毒進一步分成37個P型和27個G型，臨床上毒株以G型命名的較為普遍，但需要指出的是即使是同一種G型，差異也可能會很大。圖8輪狀病毒的病毒粒子結構豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得輪狀病毒不同基因型差異較大的一個原因是其基因組由11個獨立的雙鏈RNA片段組成(見圖9),即基因組RNA是11段不連續的RNA,在復制時11個RNA片段分別復制，與禽流感病毒類似，這種分圖9輪狀病毒的病毒的RNA分11個節段3.2輪狀病毒的理化性質輪狀病毒的理化性質較為穩定，對環境因素如溫度、pH變化等具有較強的抵抗力。存在于病豬所排糞便中的病毒可在室溫下存活3個月，60℃時仍可存活30min。由于沒有囊膜，輪狀病毒對化學類消毒劑抵抗能力很強，對次氯酸鹽，乙醚，氯仿等均具有一定的抵抗力，因此在豬場中很難徹底清除豬的3.3輪狀病毒的致病機理PoRV經口鼻感染動物機體，由于能抵抗蛋白分解酶和胃酸的作用，所以能順利通過胃而到達小腸，經胰蛋白酶激活而感染小腸絨毛頂部上皮，在其中增殖并使之發生變要在小腸上皮細胞中復制，外衣殼蛋白VP4通過與唾液酸相互作用，與易感細胞結合，進入細胞破壞腸絨毛，導致液體吸收不足，造成吸收不良性腹瀉。此外，病毒NSP4基因也會破壞細胞內鈣離子通道，導致氯離子外流，引起分泌性腹瀉(如圖10所示)。Neurotransmitters實驗證明，感染后小豬的小腸絨毛上皮細胞的功能發生了改變，如葡萄糖偶聯的鈉轉運破壞，雙糖酶的活性降低，胸腺嘧啶激酶活性增加等，這些病理生理變化均會促進吸收不良性腹瀉的發生，加重輪豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得體外研究表明，豬輪狀病毒與致病性大腸桿菌混和感染時，由于二者在致病過程更多毒素進入細胞，導致細菌和毒素吸收增加，以致于輪狀病毒與產腸毒素大腸桿菌混合感染可引起敗血癥，所造成的危害要遠遠大于二者之和，斷奶仔豬單獨接種輪狀病毒或β產腸毒素大腸桿菌可能會導致短暫的腹瀉或幾乎不產生腹瀉，然而，先接種β產腸毒素大腸桿菌，然后再接種輪狀病毒，就會使β3.4輪狀病毒的臨床癥狀輪狀病毒可感染各日齡段豬只，病變主要限于消化道。發病早期精神委頓，常瀉，糞便水樣或糊狀，色黃白或暗黑，腹瀉越久，脫水越明顯，體重因此可減輕30%,有時小腸廣泛出血，腸系膜淋巴結腫大。自然感染潛伏期一般為1~4天，7日齡以內仔豬感染腹瀉持續時間久，死亡率低于10%。7日齡以上仔豬癥狀較輕，多為亞臨床感染，豬只大于40日齡后，一般不表現明顯的癥狀。豬場感染輪狀病毒后，病原會長期存在，母豬感染后，體內會產生抗體，此時小源抗體的保護，不會產生明顯癥狀，當仔豬14日齡至斷奶前后，母源抗體降低，豬只會出現腹瀉癥狀。若仔豬發病日齡較晚，此時不會表現出典型的的水樣腹瀉，多表現出牙膏狀的腹瀉，往往會認為是換料導致的應激而忽略掉，輪狀對大日齡的仔豬影響較低，但是會損傷仔豬腸道，加重斷奶后的細菌性繼發4.1大腸桿菌的分類地位大腸桿菌屬于革蘭氏陰性短桿菌，長1-3微米、寬0.4-0.7微米，有莢膜或微莢膜結構，無芽孢。以周身菌毛粘附，以鞭毛運動，需氧或兼性厭氧。大腸桿菌可通過毒力因子劃分為產腸毒素大腸桿菌 (ETEC)、腸道致病性大腸桿菌(EPEC)和產志賀毒素大腸桿菌(STEC)等，如表8所示。表8豬源大腸桿菌主要疾病斷奶仔豬腹瀉/Eae(緊密黏附素)//Eae(緊密黏附素)敗血病/多發性漿膜炎豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得4.2大腸桿菌的致病機理內毒素是革蘭陰性菌細胞壁外膜上的一種脂多糖(LPS)和微量蛋白質的復合物，LPS是細菌的主要抗原及致病性部分。LPS是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有廣泛生物活性的細菌結構成分。腸黏膜功能正常時，內毒素不會引起損傷，還會增強機體的特異性和非特異性免疫力。腸道菌群失調的情況下，腸道內的致病菌，特別是腸道內的致病菌革蘭陰性菌就會大量生長、繁殖并釋放大可引起腸源性內毒素移位。大量內毒素進入血液循環，可激活巨噬細胞、中性粒細胞、血管內皮細胞IL-8、IL-12等細胞因子、黏附分子及NO等炎癥介質和溶菌酶的釋放及ROS的生成，嚴重者可導大腸桿菌引起的腹瀉致病機理與病毒性腹瀉總結如表9。表9大腸桿菌引起的腹瀉與病毒性腹瀉致病機理的差異產腸毒素大腸桿菌(ETEC)特異性受體結合，破壞腸上皮細胞膜的功能和液腸道致病性大腸桿菌(EPEC)4.3大腸桿菌病臨床癥狀和危害產腸毒素大腸桿菌主要引起分泌性腹瀉，會變薄、松弛，伴有黃色透明液體，有時有氣體，腸腸道致病性大腸桿菌多引起滲透性腹瀉，仔豬最開始表現為消化道癥狀，進一步發展成為腸毒素血癥或敗血癥，伴發脫水癥狀，口鼻發紫，四肢發紺，精神抑郁，體重下降，不久仔豬死亡。剖檢后，腸道擴張、液體充脹，充血、腸黏膜粗糙，呈顆粒狀(腸上皮壞死、絨毛萎縮),急性炎癥、纖產志賀毒素大腸桿菌又稱水腫病，會伴發分泌性腹瀉，眼臉、頸部腹側(下頜)、胃和結腸系膜水腫，精神萎靡抑郁，脫水衰竭，震顫，叫聲嘶5.1豬德爾塔冠狀病毒5.1.1病原學豬德爾塔冠狀病毒，又稱豬δ冠狀病毒、豬丁型冠狀病毒。PDCoV屬于尼羅病毒目，冠狀病毒科，德爾塔病毒屬(δ冠狀病毒)。PDCoV有直徑60-180nm。PDCoV基因組約25.4kb,含有四種結構蛋白：纖突蛋白(S),小膜蛋白(E),膜蛋白(M),核衣殼(N),結構如圖6所示。豬腹瀉病綜合防控手冊pplapplab2323圖11PDCoV基因組結構豬德爾塔在臨床上發病率不高，造成的損失也并不持續，呈區域性流行，在臨床防控中以生物安全5.1.2臨床癥狀食欲減退或廢絕。斷奶豬、母豬常呈精神委頓、厭食和持續性腹瀉大約1周，逐漸恢復正常，少數豬恢復后生長發育不良。育肥豬在感染后常發生腹瀉，多1周后康復。成年豬癥狀較輕，有的僅表現嘔吐，重者水樣腹瀉3~4天可自愈。5.2.1病原學豬傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，病毒粒子呈圓形、橢圓形或多邊形。病毒直徑為90-200nm,有雙層膜，外膜覆有花瓣樣突起，突起長約18-24nm,突起以極小的柄連接于囊膜的表層，其末端呈球狀。TGEV為單股RNA病毒，基因組全長約為28kb,病毒粒子由3種主要結構蛋白構成，一種是磷蛋白(N,即核蛋白),它包裹著基因組RNA;另一種是膜結合蛋白(M),主要包埋在脂質囊膜中；An3AnEAnMAn7豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得第三種為大的糖蛋白(S),它形成病毒的突起。據推測，E2在決定宿主細胞親嗜性方面起作用，還具有膜融合作用，使病毒核蛋白進入細胞漿，E2還攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定簇，在提高獲得免疫力中一般2周齡以內的仔豬感染后12-24小時會出現嘔吐，繼而出現嚴重的水樣或糊狀腹瀉，糞便呈黃色，常夾有未消化的凝乳塊，惡臭，體重迅速下降，7日齡內仔豬發病死亡率可達100%。斷奶仔豬感染有些母豬與患病仔豬密切接觸反復感染，癥狀較重，體溫升高，泌乳停止，嘔吐、食欲不振和腹瀉，也過PRCV的哺乳仔豬和斷奶仔豬，使用TGEV野毒進行攻毒，可部分對TGEV產生保護作用，且縮短了TGEV的病程，減少了仔豬排毒量和腹瀉程度。因此，推測TGEV的發病率降低與PRCV的廣泛流行具有1.豬流行性腹瀉病毒的流行病學1.2.豬流行性腹瀉病毒的分型方法20世紀70-80年代，PEDV廣泛流行于歐洲次發現PED的疫情。此后，直到21世紀初，在亞法國和比利時等歐洲國家分別報道了PEDV的爆有99%的同源性，且與韓國的PEDVGIb變異苗的研發，PEDV疫情的到控制。2010年10月份致死率達到80%-100%,在1年內造成了100萬株皆為PEDV變異株，屬于GⅡ群，說明我國當2010年以來發現的毒株被稱為新型PEDV毒株。傳進化分析可以分為三個大群(如圖12),包括中國經典毒株(LZC,CH/S/19與原型毒株(CV777DR13/1999)同屬GIa亞群，而GIb亞群主要包括細胞適應疫苗毒株(弱SD-M,SQ2014SC1402)。GⅡ群也可分為GⅡa基因發生變異會導致PEDV的毒力發生改變。基于中國地區分離的S基因繪制遺傳進化樹(如圖13),發現2010年之后中國的PEDV毒株主要分豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER為兩個大的分支(G1和G2),G1分支主要包含經典PEDV毒株和重組毒株，而中國近幾年的PEDV流行株大多數屬于G2分支，此分支也是PEDV的新型變異株，G2分支的毒株主要包含GⅡa和GⅡb二個亞群。PEDV的優勢毒株從最開始的GI群，逐漸轉移為GⅡ群(GⅡb亞群),但是，近幾年PEDV的GⅡa亞型越來越多的被分離出來，PEDV的ORF3基因也是病毒的主要毒力基因，將其與中國地區不同時間不同地域分離的PEDV毒株進行對比分析，繪制遺傳進化樹(如圖14),結果表明ORF3基因被分成了兩個大群(A群和B群),其中A群主要包括GI群的部分和GⅡb亞群，而B群主要包括GI群的部分和圖14PEDVORF3基因遺傳進化樹2013年，美國爆發PED疫情，同樣造成了巨大的損失。2013年，流行性腹瀉首次在美國暴發便造成了巨大的經濟損失。2014年，美國分離出OH851毒株，檢測為PEDV變異株，可能是由至2016年底，新型PEDV毒株(non毒株和SINDEL毒株)已經傳播至北美洲、南美洲、亞洲和歐洲。PEDV屬于高變異毒株，變異還在持續進行，在歐洲地區出現了PEDV和TGEV的重組冠狀病毒(SeCoV),例如意大利(2009-2012)、德國(2012)和東歐(2016)。1.3.豬流行性腹瀉病毒的變異1.4.豬流行性腹瀉病毒的傳播規律PEDV變異株相比于經典PEDV毒株發生了較大的變異，基于PEDV的全基因組序列分析，發現有四個區域變異較大：①位于nsp2和nsp3區域之間；②位于S基因的S1區域；③位于S基因其中第三處變化可鑒別適應細胞培養的疫苗毒株(GIb亞群)和野生型流行毒株(Gla亞群和GIlb亞群),ORF3基因在毒株適應體外連續細胞傳代PEDV的流行具有明顯季節發病性，多發生于寒冷季節，我國常在冬春季節出現流行，每年的11月至次年的4月份是高發期。但是近幾年，豬流行性腹瀉的季節性發病特征越來越不明顯，許多豬在PEDV流行過的豬場，該病在豬群中豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得生長群往往會發生PED的疫情，會引起嚴重的細2.3輪狀病毒的傳播規律2.豬輪狀病毒的流行病學2.1輪狀病毒的分型編碼6個結構蛋白和5個非結構蛋白，通過序列源性>53%的毒株為同一基因型，共劃分為10種ClassipcationWorkingGroup在第7次會議上談因決定的。VP4基因核苷酸同源性大干80%可認大于85%可認定為同一基因型(I型),VP7核苷2.2豬輪狀病毒的流行現狀中國地區流行的豬輪狀病毒G基因型有G5、G4和G3為主(如圖15所示)。P基因型2.4輪狀病毒的公共衛生學播，但是檢測到動物-人之間重排的RVA圖16),表明RVA具有人畜共患的潛力。豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER1.豬腹瀉病的臨床檢測分泌性腹瀉。圖17廣泛pH試紙條2.PEDV和輪狀病毒的分離鑒定2.1PEDV的分離鑒定 豬腹瀉病綜合防控手冊豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER2.2輪狀病毒的分離鑒定加入含的胰酶DMEM培養基6mL,待細胞出現明顯細胞病變(CPE)的時候(如圖19),超低溫冰箱3.PEDV和輪狀病毒病原診斷方法表10實驗室診斷方法②靈敏度高；③可進行規模化樣品檢測；④操作容易。實時熒光定量RT-PCR技術的發現實現了RT-豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得酶聯免疫吸附實驗(ELISA)是基于抗原抗體特異性結合的檢測方法，主要包含：①包被的抗原或抗體的固相支持物(聚苯乙烯塑料微孔或試管);②酶標記的抗體或抗原；③酶的反應底物。ELISA方法類型主要包括：直接ELISA,間接目前臨床檢測上用的較多的主要是間接ELISA和阻直接ELISA方法是最簡單的一種，將抗原按再簡單洗滌后進行封閉，洗滌除去多余封閉液，加入稀釋好的特異性酶標抗體，37℃吸附1h后，吸間接ELISA方法主要是采用PEDV滅活的病毒蛋白或重組表達的蛋白作為包被抗原，將待測抗體加入相應抗原孔中37℃吸附1h,通過洗滌去除未結合牢靠的抗體，再加入酶標二抗，通過洗滌去除未結合牢靠的抗體，再加入HRP底物顯色液與阻斷ELISA方法主要是采用PEDV滅活的病毒蛋白或重組表達的蛋白作為包被抗原，制備PEDV相對應的特異性單克隆抗體或者多克隆抗度下與血清中特異性抗體競爭結合抗原，當血清中免疫熒光檢測方法是將熒光物質標記在目標抗原(或抗體)上，通過特異性免疫反應檢測抗體 (或抗原),如果二者可以結合形成帶有熒光物質的復合物，可以在熒光顯微鏡下觀察到熒光，反所以在病毒檢測的診斷方法中，它的結果比較可靠且特異性高。PEDV進行免疫熒光檢測時，需要將疑似樣品制作成冷凍切片或抹片，該方法檢測率較高，但是存在較多弊端：①檢測周期長；②檢測過程中容易受到污染；③檢測方法不易操作。因4.豬病毒性腹瀉的監測預警可通過監測血清IgA抗體對PEDV進行有效的預警。血清中的PEDV-IgA是單體IgA,在血清匯總含量低，一般只在PEDV感染時，才能在中檢測到。因此可以對產前30-60天的母豬進行血清IgA抗體檢測，如果檢測為lgA陽性，則表肛門拭子進行病原學RT-PCR確診，并通過緊急免5.對疫苗的免疫效果的評估方式，而激發IgA抗體需要依靠活苗的刺激，而檢能夠中和病毒的抗體，檢測中和抗體雖然不能保證中和抗體和IgA抗體結果對比，發現選的場，IgA抗體的水平與中和抗體的值呈正相關。因此，選擇使用活苗免疫的豬場，可以通過培養自己的中和抗體檢測團隊，使用檢測中和抗體的方案5.2中和抗體檢測步驟①標記：在培養3天左右的Vero細胞板上標記好血清編號、時間、檢測人、檢測日期，并設②配置接毒液：DMEM+1%雙抗+1%接毒③稀釋血清：把96孔細胞培養板整板加入用移液排槍在H列吹吸混合后吸取100ul混合液加入G列，依次2倍稀釋至A列，棄去最后100ul④配置病毒液：根據種毒效價把種毒加入接豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得毒液中，得到效價為103的病毒液，將病毒液懸空加入96孔板中(病毒對照孔除外),每孔加入100ul⑤放入CO2恒溫培養箱中培養1個小時；⑥病毒對照：取100ul病毒液加入離心管中，連續稀釋至10-4,放入4℃冰箱冷藏備用⑦把備用細胞板內溶液，用PBS潤洗3遍，最后一遍要甩干凈(PBS提前37℃水浴);⑧把感作1個小時后的混合液從低濃度到高濃度列依次轉移到備用細胞板內，放入CO2恒溫培養箱中孵育2個小時；⑨取出培養板棄去板內溶液，PBS潤洗3遍，每孔加入200ul的接毒液，病毒對照加100ul,病毒對照依次加入不同濃度的病毒液，醫用膠布封板，放入CO2培養箱培養2-3天；⑩待時間到達后，在光學顯微鏡下觀察病變，讀取中和抗體結果。豬腹瀉病綜合防控手冊豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER滅活苗安全穩定，但是相應的需要更大的免疫劑量，而且存在免疫持續時間短等問題。這些缺點促進了PEDV弱毒疫苗的研發，細胞傳代致弱是篩選PEDV弱毒疫苗株的常用方法。伶有恩等與PED的防控。韓國學者將PEDV毒株DR13株在Vero細胞上傳代至F100代進行致弱，研發的DR13弱毒疫苗用于韓國PED的預防。2010年開始由于PEDV毒株發生變異，中國使用的TGE和PED二聯滅活和弱毒疫苗的保護力下降。馮力研究員等研發了PEDV,TGEV以及輪狀病毒三聯弱毒活疫苗(弱毒H毒株+弱毒產生免疫力，免疫期6個月，對混合感染和單一感染的仔豬均有較好的預防作用。隨后TGEV(HB08株)和PEDV(ZJ08株)二聯弱毒苗也被官方批準應用于中國PED的防控。由PEDV變異株AJ1102在針對輪狀病毒的防控中，目前輪狀病毒有商品化的弱毒苗(G5型),從上市以來，我國豬輪狀病毒的G5型得到了有效控制。多位學者通過③免疫期長。滅活疫苗是用加熱或化學劑(通常是福爾馬林)等方法對病毒或細菌培養物進行滅活。主要分是最早被研制成功的。王明研究員等用CV777毒株感染仔豬，取發病仔豬小腸粘膜及內容物制備了PED氫氧化鋁滅活苗，制成了我國第一個PED疫苗。疫苗免疫后兩周開始產生免疫力，免疫期可達6個月。還紅華等將從腹瀉糞便樣品中分離的PEDV毒株與TGEV毒株分別經口接種未經母乳喂養的新生仔豬，取典型發病豬的小腸，制成PED和TGE二聯油乳劑滅活苗，動物試驗的結果表明該疫苗有較好的效果。組織滅活苗有較好的保護性能，但是操作繁瑣且生產成本高以及質量難以控制自從PEDV在Vero細胞上增殖的方法被發現以后，極大地促進了細胞滅活苗的發展。馬思奇研究員等采用在病毒培養液中添加適量胰酶的培養方法，將PEDVCV777毒株適應于Vero細胞，將PEDV傳代毒制備氫氧化鋁滅活苗，獲得較高的保護率。由于PED和TGE的經常混合感染，馬思奇研究員等將TGEV和PEDV毒株進行細胞傳代，再次成功研發了滅活TGE和PED二聯氫氧化鋁滅活苗，在2003年之前用于中國PED的預防，有效的控制了PED和TGE的發生。自從2010年開始，PEDV新毒株的出現導致了PED的發病率明顯提高，美國、韓國、加拿大疫情的控制。我國也通過分離新型變異株，研發了多種PEDV的滅活苗，如豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗等，極大地控制了我國PEDV在輪狀病毒的防控中，弱毒苗具有較好的效果，但是要激發更高水平的抗體，需要滅活苗的輔助，目前還未有輪狀滅活苗上市。此外，輪狀病毒在中國地區流行基因型眾多，且不同基因型間毒株且不同基因型毒株存在交叉保護力，急需能夠有效利用體外表達系統大量獲得病毒的免疫原。因為其中不含有病原體的遺傳信息和感染性組分，亞單位豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER原核表達系統的蛋白表達量很大，可以滿足大劑量需求，常用的表達系統是大腸桿菌表達系統。Piao等將PEDV變異株S1區域氨基端基因以包涵體的形式在大腸桿菌菌株BL21中表達，蛋白免疫小鼠后可以產生高效價的IgG血清，表明純化后可以作為抗PEDV變異株的亞單位疫苗。原核表達系統中常常會影響蛋白的構象和免疫原性，而真核表達會更接近于天然構象真核表達系統常用的有多種不同的方法，常用的有真核細胞和昆蟲細胞等。Oh等采用哺乳細胞表達系統將PEDVS1基因在PK-15細胞中獲得表達，蛋白加入佐劑后注射免疫妊娠母豬，新生仔豬對PEDV產生了有效免疫。Makadiya等將親和標記的PEDVS1蛋白在酵母、昆蟲和HEK-293T細胞中表達，發現HEK-293T細胞表達的蛋白有效誘導了母豬和仔豬產生抗PEDV的抗體，表明其適于作為PED亞單4.載體類疫苗活載體疫苗是指運用基因工程的方法改造非致病性微生物，使其表達特定病原的抗原決定簇，從而進行疫苗的研發，常用的微生物有酵母菌、乳酸桿菌以及副痘病毒等。活載體疫苗主要分為病毒活載體疫苗與細菌活載體疫苗，兩個疫苗的優缺點如表11所示。核酸疫苗又名DNA疫苗，通過把目的基因插入到特定載體，再把載體注入動物體內，使動物Harrisvaccines公司研發的RNA核酸疫苗依據甲病毒表達載體表達了PEDVS基因，但是對仔豬和張等用減毒鼠傷寒沙門氏菌表達TGEV和PEDVS基因構建了二價DNA疫苗，動物實驗表明可以促進免疫應答。Yi等也運用PEDV的S基因構建了通過分析大量的臨床發病案例，發現PED的防控僅靠疫苗免疫并不能有效地預防PED,需要一系列的管理手段，保證母源抗體傳遞給仔豬，而豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得部分生物安全較差的豬場，即使做好了免疫，依舊會出現發病情況。仔豬口服對型的高效價抗體可以目前在研抗體分卵黃抗體和單克隆抗體兩類，其優缺點見表12。卵黃抗體(Yolkimmunoglobulin,IgY)又類的法氏囊受到外界抗原刺激產生的特異性免疫應特異性且無毒副作用，在禽類疾病的治療和預防中得到廣泛應用。隨著卵黃抗體使用技術的成熟，卵IgY與母豬初乳中的抗體具有相同功能，仔進入血液中持續發揮作用。崔煥忠等(2012年)通過動物實驗證明卵黃抗體對病毒性腹瀉有很好的預防和治療效果。王建明等(2002年)通過實驗驗證卵黃抗體可以降低斷奶仔豬的發病率。李冰等(2014年)通過實驗證明了制備的抗流行性腹瀉卵黃抗體在進行預防和治療PED具有顯著效果。陳魯勇等(2003年)通過實驗證明，卵黃抗體能夠提高斷奶仔豬的日增重量，提高飼料報酬。卵黃抗體在臨床中廣泛使用，并取得了較好的效果，在PED發病豬場用針對PEDV流行毒株制備的卵黃此外，有學者證明高免母牛初乳等也能對針對PEDV的主要毒力基因S基因制備篩選的單克隆抗體對于PEDV的防控也有較好的效果，有學者通過大腸桿菌來表達的針對PEDV的鼠源單克隆抗體，抗體可以有效中和PEDV,降低病毒對靶細胞的侵害(Zhangetal.,2016b)。表12抗體特點對比表毒副作用無毒副作用豬腹瀉病綜合防控手冊豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER豬流行性腹瀉目前已成為一個免疫管理類疾病，僅僅通過免疫打造高抗豬群，不足以保護豬群不發病。豬流行性腹瀉的防控主要包含三個關鍵點：①免疫管理：通過選擇合適的疫苗以及免疫程序，打造具有高水平抗體的母豬群，并通過抗體監測手段保證豬群的抗體均一性，不留凈豬；②生物安全：外防病原入侵，加強人員與物資的進場管理，內控病原擴散，通過初乳管理保證仔豬抗體水平，加強消殺降低環境中病原含量，控制病原擴散；③緊急治療：發病早期快速灌服抗生素可以有而發病后期精準用藥可以快速控制繼發細菌感染，幫助PEDV的防控主要通過免疫母豬，產生高水平抗體傳遞給仔豬。對于PEDV的防控最有效的抗體是slgA,它是局部粘膜免疫，抵抗腸道感染的主要抗體，含有分泌鏈，避免被腸胃消化酶的消化。母豬能夠產生高水平的slgA的關鍵是使用活毒感染，通過活毒刺激機體產生黏膜免疫應答，并通過后續的加強免疫，可以保證母豬產前產生足量的slgA(如圖20)。滅活疫苗免疫滅活疫苗免疫刺激粘膜免疫產生更高水平的IgA抗體活毒刺激粘膜免疫應答，特異性抗體遷移至乳腺通過母乳提供抗體被動保護圖20局部黏膜面免疫的作用機理母豬免疫之后，體內產生的能夠分泌抗體的特異性淋巴細胞，通過血液循環運輸到乳腺部位的血管處，淋巴細胞通過整合素α4β7與乳腺血管內皮細胞MAdCAM-1受體結合進入乳腺。此后，淋巴細胞通過表達CCR10與乳腺上皮表達的CCL28結合進入乳腺腺泡，分泌抗體混合于乳汁中，傳遞給仔豬(如圖豬腹瀉病綜合防控手冊圖21腸道-乳腺軸抗體分泌機制目前，PED防控最有效的是“活+死”的免疫方案，通過活苗免疫刺激母豬產生高水平的slgA以及滅活苗的加強免疫，打造豬群整齊的高水平抗體。活苗的免疫可以選擇弱毒苗或者使用強毒返飼，商品化弱毒苗可根據產品說明書使用，而生物安全條件較好的豬場可選擇強毒返飼，可刺激母豬產生更高水平的抗體，保護力相比于弱毒更強。PED的免疫方案需要根據豬場的情況，靈活選擇免疫方案，以下為推薦免疫方案，見表13。表13PEDV活+滅免疫方案制定PEDV免疫后，需要對豬群整體的抗體水平進行監測，保證母豬在生產的時候具有較高的母源抗體。目前，PEDV的抗體水平監測具有完善的方案，可以選擇方案很多，不具備細胞實驗室的豬場可以選擇商品化的試劑盒，也可選擇外部機構進行檢測。具有細胞實驗室的豬場，可以選擇中和實驗若選擇中和實驗進行監測，可在母豬孕100天的時候采血檢測，母豬通過活苗和2針滅活苗的免疫，在孕100天時，中和抗體水平1:128的比例高于80%,若豬群抗體水平不合格，可在產前緊急補免1針滅活苗。中和試驗也可以選擇在免疫過程中進行監測，通常在返飼21天后，豬群的中和抗體水平1:32的比例高于80%;在免疫1針滅活苗后2周左右，豬群的中和抗體水平1:64的比例高于80%;在免疫2針滅活苗后1周左右，豬群的中和抗體水平1:128的比例高于80%。此外，能存在抗體為0的豬，若出現不合格豬只，需要盡豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得孕10d孕20dPOS左孕10d孕20dPOS左孕70d孕100dP08專P09左后備集中至孕60d進行返飼，隔離15d返飼21d后，中和抗體可達1:32次產前40d+產前20d,免疫2針滅活苗一免后中和抗體達1:64二免后中和抗體達1:128龍州3.后備母豬馴化關鍵點陽性病料返飼是比較傳統的方案，具有病毒含量不穩定，返飼之后排毒時間長的劣勢。目前使用較多且效果比較好的方法是使用穩定傳代的病毒液，能夠較好的控制返飼劑量，保證豬群的感染均一性，達到母豬返飼通常是在后備段集中后統一進行。選擇病毒液進行返飼時，病毒感染母豬后，在感染2天左右出現腹瀉癥狀，在返飼7-10天時達到腹瀉高峰期，豬群整體腹瀉比例高于20%,若豬群之前接觸整體感染均一性的情況下，豬群排毒期通常在12天左右。在返飼7天后，豬群開始產生中和抗體，約在3-4周后，抗體水平達到最高值。返飼對于成年豬的影響較低，僅會降低7天的采食量于日增重。返飼需要避開配種前后時間，會影響場區約1%的配準率。孕40d之前盡量不進行返飼，小孕齡返飼會引起部分母豬的流產，主要原因是：①母豬感染PEDV后，機體會產生炎癥反應，導致前列腺素分泌增加，子宮肌肉收縮加劇，最終導致流產；②PEDV感染后，若腹瀉情況較為嚴重，會導致母豬腸道受損，應激導致流產。母豬返飼規律豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得返飼方案確認返飼方案確認生物安全標準確認返飼效果及數據跟蹤全場返飼前培訓返飼前責任劃分場區解封返飼物資準備返飼執行場區風險排查場區決定使用返飼方案后，獸醫需要和場長等生產干部確認人、車、物和豬流的規劃，需要預留出至少15天的返飼時間，返飼期間場區處于靜默狀態，豬流禁止移動，必要情況下需要提前報備規劃，避開返飼區域。車流需要提前規劃路線，嚴禁與返飼區域交叉，遵循先凈區后臟區的線路開展生產工作，非必要活動可以延后。物品做好15天的規劃，可提前進入生產區域，返飼期間減少物品的移動。返飼單元與待產單元的人員需要提前進入單元，返飼期間居住于生產區，減少移動，其他單元人員上下班嚴格規劃路線，禁止經過返飼區域，后勤人員路線也需要嚴格制定順序，避免人員交叉，或將臟區病原帶到管理干部需要提前準備返飼物資。返飼種毒可以選擇陽性病料或者病毒培養液，相較于陽性病料，更加返飼種毒(配套的連續注射器或者口服飼喂槍)、5mL采血器、防護類物資(隔離服、口罩、乳膠手套)、泡沫盒、冰塊、開瓶器、采樣拭子和人員生產生活物資(提前準備好15天用量，非必要減少進物資次數)。返飼前獸醫需要對全場人員進行會議培訓，講解PEDV的特性，強調本次返飼使用的為強毒，若生物安全不到位，造成病原擴散會產生極大的危害。并現場確認返飼期間各個環節的責任人，確保返飼的4.2馴化期間操作目前，根據豬舍的模式，返飼方法可分為定位欄返飼和大圈返飼，豬場可根據場區情況選擇合適的定位欄返飼步驟：①返飼操作人員需要對返飼豬只提前一頓進行控食，并確定各個單體欄每頭份的種毒用量；②飼養人員需要提前檢查打料期是否正常運行，水槽水量是否過多，預留水量不沒過飼料為準；③兩人操作，飼養人員逐頭打料，返飼人員將種毒加到飼料最上層，保證每頭豬都進食到種毒；④對于不食豬做好標記，待返飼結束后，保定不食豬，將種毒打到豬嘴里，保證感染均一性。豬腹瀉病綜合防控手冊大圈逐頭返飼步驟：①需要指導飼養人員提前兩天使用誘食劑(奶粉等)進行誘食，每天兩次；②返飼人員確定好返飼劑量，返飼人員站在圈外使用飼喂槍逐頭進行口服返飼，并做好標記；③不食豬只，返飼人員沾腳消毒后，進圈內保定豬只，將種毒打逐頭飼喂返飼飼喂搶逐頭飼喂返飼飼喂搶返飼期間的高危時間段為3-10天，此時間段為排毒高峰期，場區環境中病原含量較高。場區除靜默15天的時間外，在高危期間尤其要注意各類工作，謹防散毒。返飼人員在單元內封閉隔離，其他人員規避進出返飼單元，單元封閉參考非瘟檢出返飼期間及返飼前1天應該停止場區的水源消毒，避免水源中的消毒劑殺滅PEDV病原，影響返飼使用毒株為活毒，在運送至場區的過程中需要保證全程冷凍。場區收到病毒培養液后，可提前置于冷藏中化凍，嚴禁加熱解凍，否則會損害病毒活力。此外，病毒液不可反復凍融，否則易導致病毒含量降低，且返飼操作需要在6小時內完成，過以下兩個指標進行判斷：①抗原檢測，選擇返飼后3、5、7、11天采(腹瀉豬)肛門拭子，若檢測到PEDV抗原則判為排毒，后續不再進行采樣重復檢測；②飼養員每天巡欄記錄豬群的腹瀉比例，按整體累計比例，不重復計算，大圈按圈統計(≥3頭腹瀉豬，定義為腹瀉圈),豬群的整體腹瀉比例應高于20%。這兩個條件皆合格之后，方可判定為PED可能會導致腹瀉比例較低，可在返飼21天后采返飼后不可立即進行單元消毒，需要整體腹瀉比例達到30%以上時，執行環境消毒。在返飼結束前，需要對大環境采樣進行采樣，采樣范圍要廣，對單元過道欄板、地面、墻壁、洗澡間等位置皆要采集，檢測結果均為陰性，確保安全后方可解返飼操作結束后，使用物品需要嚴格消毒后方可丟棄。返飼期間使用的隔離服，膠鞋，工裝等物品在單元內使用消毒劑浸泡消毒，一次性手套或者P7瓶使用消毒劑浸泡消毒處理后，裝入到相應返飼之后，需要對返飼效果進行追蹤，可通5.PED發病場生物安全防控5.1豬流管理豬流在移動前需要嚴格規劃路線，新上產房的母豬與發病斷奶豬需嚴格消毒后再移動，豬群流轉路線、轉豬車輛和接豬人員不能交叉，轉豬前后豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得后備進群前1周采集糞便監控排毒情況，每單元采集5份樣品，有異常延后進群。發病單元內豬場發生PED之后，需要全場執行隔離，嚴禁發生PED單元飼養員進入或接觸未發生單元、元必須刷鞋沾腳，隨身攜帶物品消毒之后方可進入單元。飼養員需要定時巡欄，若發現腹瀉豬必須立豬場防疫人員在執行免疫時，需要按區域和批次進行劃分，嚴禁人員交叉跨區域進行免疫，以需安排人員分開免疫，防疫員進出單元需要嚴格做后勤水電維修人員不可私自進出單元，在需要進入單元作業時，提前向場段長報備，經審批同意后方可進入豬舍作業。后勤人員在進入豬舍前需要執行嚴格的消毒措施，攜帶工具浸泡消毒，并由飼養員進行監督，消毒合格后才可攜帶工具進入。送飯、送物資與拉死豬等后勤人員，需要規劃好順序與路線，遵循先凈區后臟區，先仔豬后大豬的原則，不可隨意在場區流轉，嚴禁不同業務間發病單元內需要執行最小單元格管理，單元內所有使用物品分門別類，正常圈與異常圈分開飼養員間不準相互借用物品，批次結束后，可浸泡物品需要浸泡消毒，不可浸泡物品隨批次轉至單元內發病后，嚴禁開展閹割斷尾和免疫的全群性操作，待發病高峰期結束，延后開展。單元內的腹瀉糞便病原含量極高，需要使用干燥粉進行覆蓋，及時用沾有消毒劑的拖把進行清理，再用干燥粉覆蓋圈舍，保持圈舍的干燥，待圈舍內消毒完畢后，再對過道進行霧化消毒，降低單元內的病原醫療廢棄物與垃圾使用內膜袋分類后，使用消毒劑進行全面消毒后，統一清理出單元。單元走到及物發病單元批次結束后，需要嚴格執行單元內的刷圈清消，保證眼觀無糞污，采樣檢測病原為陰場區在進行拉死豬業務時，需要遵循按照先且拉死豬人員工作前需要進行洗澡換衣，并對車輛進行嚴格的洗消烘，拉運過程中不能與其他業務有交叉。拉死豬結束后，需要對道路進行消毒，拉豬工具和車輛進行消毒，人員洗澡消毒后方可進入生場內有轉豬業務時，需要提前規劃車輛移動路線，人員工作前需要進行洗澡換衣，并對車輛進行嚴格的洗消烘，拉運過程中不能與其他業務有交車輛的刷洗要干凈無死角，車斗、底盤、輪胎、擋泥板無肉眼可見糞便、血漬、動物毛發、污物等。刷車要在洗車棚中，嚴禁露天刷車及污水橫流，清洗房必須頂部及四周密封，污水經暗道收集。車輛刷洗干凈后，必須進行烘干，溫度需要達到65°C,并維持30分鐘。5.5場區管理措施場區內執行臟凈道管理方案，將場區的道路分為臟道和凈道，場區業務開展需要做好路線的規劃，避免不同業務間交叉。若無法進行臟凈道分離豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER信得不同批次飼養員上下班建議分時間，運送物資需與正常單元分時段進行，業務結束后灑水車對途徑地進行全面消毒，嚴禁使用高壓沖洗，需選擇高壓霧化消毒的方式。場區不同區域的交界處，需設置消豬舍內需要定期檢查墻壁及設備，墻體有縫場區還需定期開展四害的防控，定期滅鼠、6.發病豬場的處置措施場區出現腹瀉癥狀，飼養員需要臨床快速初判，檢測腹瀉的類型，若判定為病毒性腹瀉，需要場區管理干部需緊急成立疾病專項群，指導場區人6.2緊急隔離確診病原為PEDV后，需要快速采樣確診感發病區域嚴格執行隔離，禁止出入單元，與其他單元交叉，并快速預警上下游場區，避免病原跨場區管理干部盡快排查病原入口，查找場區的生物安全入口。外放入侵，排查進入場區的風險點，盡快切斷外部病原的風險。內控擴散，對場區PEDV的潛伏期最長可達7天，場區需要整理發病前10天的業務，盡快梳理出業務開展時間正常單元與發病單元，正常圈與發病圈的物糞刷、消毒桶各準備4個，做好標記。一個用于正常圈，其他三個用于異常圈，每使用一個的消毒時間都大于五分鐘，確保腹瀉圈的任何物品不接觸正發病期間嚴禁開展全群性操作，例如全群治療、閹割斷尾等，需延后至發病高峰期結束開展。注射治療時，先輕微圈后嚴重圈，一圈一針頭，打完一圈連續注射器進行更換(配備2把連續注射器，交替使用，浸泡消毒),嚴禁將腹瀉仔豬拿到過道，進行治療，腹瀉糞便污染過道，糞刷趕豬一圈一消毒進行治療，飼養員治療異常圈穿隔離服，處理完噴淋關閉，可帶豬消毒。每天單元帶豬消毒，噴霧消毒4遍，消毒后需覆蓋蒙脫石干燥產床。連續3天；②適當降低母豬的飼喂量，防止母豬出仔豬治療：①腹瀉豬灌服硫酸慶大霉素(早期使用，嚴重腹瀉豬無效);②全群灌服蒙脫石懸進行腹腔補液，補液位置為仔豬倒數第二對乳頭左6.6測序分析需要將檢測為陽性的腹瀉病料盡快測序，進行毒株遺傳進化分析，知曉場區流行毒株。根據測序結果選擇對型的疫苗進行免疫，并及時調整后續豬腹瀉病綜合防控手冊豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER豬輪狀病毒的免疫與PEDV類似，需要使用活苗刺激母豬的黏膜免疫，產生IgA抗體，方能達到較豬輪狀病毒能夠感染豬的G基因型有12種，不同基因型間的交叉保護力較差，選擇對型的基因型進行免疫是最為有效的手段。因此，場區檢出輪狀病毒后，需要盡快進行測序，知曉場區流行的輪狀病毒基因型，針對性的選擇疫苗產品，或者聯系生物公司分離本場毒株，進行產品的定制，也是行之有效目前，中國地區流行的輪狀病毒基因型最多的是G9型，其次為G5、G4和G3型。輪狀病毒致弱時間久，可以選擇已經致弱成熟的弱毒苗，再用與本場毒株匹配的滅活苗，可輪狀病毒的免疫日齡建議選擇在產前40天和產前20天免疫，具體的免疫針數需要根據場區的發病情況選擇(如表15),發病嚴重的豬場，建議選擇兩針活苗的免疫；發病比例較低，想要降低輪狀危害的豬場，可以選擇免疫一針活苗，發生過輪狀病毒疫情，想要維持場區安全生產的豬場，可以選擇兩輪狀病毒的活苗免疫有三種方案：①逐頭口服：建議每頭豬免疫2mL,使用VE槍逐頭免疫，免疫前可提前4h控水控料，將疫苗打在料上，保證每頭豬吃到疫苗；②飲水免疫：提前計算好免疫頭份，每次1頭份。其中免疫效果最佳的是前兩種進行口服免疫。1.2免疫效果評估可以在產前采血檢測母豬的抗體水平來判斷免疫效使用活苗免疫的場也可以選擇中和抗體進行檢測，1.2.2免疫后生產成績評估③21日齡矯正末重：通過對比免疫前后21④保育日增重：記錄保育段日增重和料比，豬腹瀉病綜合防控手冊2.1緊急隔離場區出現腹瀉癥狀，飼養員需要臨床快速初判，檢測腹瀉的類型，若判定為病毒性腹瀉，需要第一時間上報場區管理干部，并采樣送檢確診病原。確診病原為輪狀病毒后，需要快速采樣確診感染面積，檢出單元執行靜默措施。發病區域嚴格執連續3天；②適當降低母豬的飼喂量，防止母豬仔豬治療：①腹瀉豬灌服硫酸慶大霉素(早期使用，嚴重腹瀉豬無效);②全群灌服蒙脫石懸液，可降低病原載量，每日兩次；③脫水嚴重豬可進行腹腔補液，補液位置為仔豬倒數第二對乳頭左2.4測序分析2.2發病單元解決方案正常單元與發病單元，正常圈與發病圈的物糞刷、消毒桶各準備4個，做好標記。一個用于正常圈，其他三個用于異常圈，每使用一個的消毒時間都大于五分鐘，確保腹瀉圈的任何物品不接觸正發病期間嚴禁開展全群性操作，例如全群治療、閹割斷尾等，需延后至發病高峰期結束開展。注射治療時，先輕微圈后嚴重圈，一圈一針頭，打完一圈連續注射器進行更換(配備2把連續注射器，交替使用，浸泡消毒),嚴禁將腹瀉仔豬拿到過道，進行治療，腹瀉糞便污染過道，糞刷趕豬一圈一消毒進行治療，飼養員治療異常圈穿隔離服，處理完需要將檢測為陽性的腹瀉病料盡快測序，進根據測序結果選擇對型的疫苗進行免疫，并及時調2.5發病豬群的飼喂方案發病單元在轉群時，需要重視豬群的前七天飼喂，如果做好飼喂管理，后續豬群會降低細菌的要保證采食量最大化，保證第1天開口率，遵循少加勤添的原則，按天按頓逐步遞增，每次飼喂不論不能一刀切，要根據每圈豬的體重決定飼喂量。針消毒4遍，消毒后需覆蓋蒙脫石干燥產床。2.3治療用藥方案母豬治療：①使用恩諾沙星治療，一天一針，發生輪狀疫情的場區生物安全同PED方案一致，輪狀疫情相對溫和，可以將生物安全措施限制豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER豬腹瀉病綜合防控手冊SINDER大腸桿菌的防控一定是預防大于治療的，一定要在前期做好誘因的管理，避免豬群集體失衡，導致大腸桿菌發病后，需要遵循早發現、早預警和早治療的原則，快速行動起來，才能避免造成更大2.大腸桿菌誘因管理單元接豬時的體感溫度低，容易造成冷應激。單元內接豬前需要進行烘干及預升溫，烘干操作需要維持溫度在50-55℃,并持續4h。單元內密封不嚴，有賊風產生，也會導致豬群腹瀉。避免賊風產生的做法有：①刷圈檢查，防止鋁管道被腐蝕，尤其是在采食區下方，飼料中的無機鹽會加速管道腐蝕；③單元首尾兩端的豬單元內溫濕度調節不合理，噴淋過度、風速應對措施是：①做好單元小環境控制，根據單元內據當地的氣溫設置參數，在寒冷的冬季，需要做好2.2飼喂管理豬群發生腹瀉，飼喂管理是重點。例如，小斷水斷料等都會造成豬只集體失衡，引起腹瀉的發生。應對措施有：①重視飼喂管理，避免大豬和小豬的飼料混合，并做好人員培訓，加強考核；②批次清料，養豬批次結束后，需要及時清理剩余飼料，避免用錯和腐敗的現象；③接豬前期和期次換料期間添加防腹瀉藥(拌料/飲水),連用5-7慢慢過渡期次料，維護好體重；⑤避免斷水斷料應激，斷水斷料后容易暴飲暴食，引起消化不良，增豬場的水源出現問題，會導致場區出現嚴重的腹瀉問題。例如，單元水中細菌超標、水質未凈需要在飲用水中添加飲用性消毒劑，殺滅水中的病保證飲用水的標準；③定期進行水管的清洗，防止飲用水定期采樣，進行病原檢測及細菌數計數，避2.4現場管理豬場預防大腸桿菌導致的腹瀉，現場管理手①加強場區的預警系統，定期對飼養人員進行培訓，培養飼養員的臨床識別能力，發現腹瀉問題或異常狀況及時上報，場區管理人員及獸醫盡快現場檢查，及時植入治療措施②完善場區的獎罰措施，大腸桿菌發病后，及時有效的治療可以快速控制疫豬腹瀉病綜合防控手冊情，降低損失，場區需要給飼養員做好發病單元的大腸桿菌的發生是一個積累的過程，獸醫需要定期培養飼養員的臨床用藥治療能力，爭取做到早發現3.大腸桿菌免疫方案大腸桿菌的血清型眾多，不同場區流行的細菌血清型、毒力和耐藥性皆不相同，大腸桿菌等細菌類腹瀉的免疫，行之有效的方案采用多聯多目前大腸桿菌在產房高發的是F4、F5和F6在母豬孕期免疫兩針疫苗，并通過初乳管理做好仔大腸桿菌另一個高發的階段是保育前期，此時由于母源抗體的消失及豬只轉群應激，豬群易發損失十分巨大。針對水腫病可以選擇分離場區的菌可以有效防控保育前期水腫病的發生，提升場區成素，做發病場藥敏試驗，做好數據儲備，待場區發病后，優先選擇最敏感的藥物使用，以達到快速控大腸桿菌是一種能夠快速適應環境產生耐藥性的細菌。定期的藥敏試驗可以及時選擇有效的抗藥敏試驗可以支撐精準用藥外，還可以幫助場區選擇有效且價格低廉的藥品，能夠達成經本增效豬場在防空疾病的時候，做好場區或者本區域的疾病流調，對于所有疫病的控制都是有效的方案。場區可以對不同日齡段和不同批次的豬只采樣檢測，并做好發病案例復盤，根據場區過往的發病歷史繪制發病日齡圖(如圖23)。大腸桿菌的發生是有一個積累的過程，大腸桿菌發病早期，臨床癥狀并不明顯，待整個群體出現明顯癥狀的時候，豬舍內細菌的含量已經十分高了，此時，即使快速的精準用藥，豬只依舊會持續幾天的高死亡。因此，根據場區發病歷史繪制的發病日齡圖就可以作為我們的有效工具，觀察場區在哪一日齡段高發腹瀉，我們可以在發病前幾天植入4.1精準用藥對于大腸桿菌長時間流行的豬場，需要周期性的采集本場腹瀉病料，送就近實驗室進行藥敏試驗。選擇市面上對大腸桿菌有抑制殺滅效果的抗生目前，國家在大力倡導減抗替抗，提前規劃可以保持企業在未來的競爭力。噬菌體目前存在的較大問題是過胃困難，可以使用噬菌體+抗生素的方案，相比于單獨使用噬菌體或者抗生素，效果更優。卵黃抗體目前還未有商品化產品，預計未來圖23不同日齡大腸桿菌檢出趨勢1.都有哪些病毒可導致腹瀉，臨床癥狀有哪些差別?1致病性強死亡率高；2致病性強，死亡率高；3豬輪狀病毒(PoRV)輪狀病毒可分為七個亞群(A~G),豬主要感染A亞群。A亞群可進一步分為G血清型(27個)和P血清型(374PEDV極為相似，只是癥狀5病毒(SADS-CoV)高暫不明確6杯狀病毒(SV)7豬捷申病毒(PTV)的是5型和8型2.豬流行性腹瀉目前是如何分型的?3.豬流行性腹瀉對各個日齡段的影響?PEDV可以感染任何日齡、任何工段豬只。PEDV對7日齡內仔豬危害最大，最的采食量。豬腹瀉病綜合防控手冊豬腹瀉病綜合防控手冊