第四章免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù)是指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學（或生物）發(fā)光劑等作為示蹤物，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)，并籍助于熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標檢測儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定，可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對抗原抗體反應(yīng)進行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定。原位雜交共聚焦顯微鏡原位雜交照片第一節(jié)免疫熒光技術(shù)一、經(jīng)典的免疫熒光技術(shù)二、現(xiàn)代免疫熒光分析技術(shù)一、經(jīng)典的免疫熒光技術(shù)基本原理：免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合。以熒光素作為標記物，與已知的抗體（或抗原，較少用）結(jié)合，但不影響其免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。免疫熒光標記技術(shù)（一）熒光抗體的制備1、抗體2、熒光及熒光素3、熒光素標記抗體的方法4、標記抗體的純化與質(zhì)量鑒定5、標記抗體的保存1、抗體用于制備熒光素結(jié)合的抗體要求特異性強，純度高，效價滿意，瓊脂雙向擴散效價不低于1：32（稀釋抗體）或環(huán)狀沉淀試驗效價高于1：4000（稀釋抗原）。2、熒光及熒光素適用于抗體標記的熒光素須具備以下條件：（1）應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定共價鍵結(jié)合的化學基團，或易于轉(zhuǎn)變成此類基團而不破壞其熒光結(jié)構(gòu)（2）熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合的需要能量很少。（3）與抗體或抗原結(jié)合后，應(yīng)不影響其免疫學特異性。（4）結(jié)合物產(chǎn)生的熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光對比鮮明，能清晰地判斷。（5）熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡便、快速、游離的熒光素及其降解產(chǎn)物容易去除。此外，結(jié)合物在一般貯存條件下性能穩(wěn)定，可保存使用較長時間。目前用于標記抗體的熒光素主要有——異硫氰酸熒光黃（FITC）——四乙基羅丹明（RB200）——四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）。3、熒光素標記抗體的方法FITC標記法：分為直接標記法和半透膜滲透標記法。直接標記法A．取適量提純的IgG，用生理鹽水和0.5mol/L、pH9.5碳酸鹽緩沖液（9：1）稀釋為20mg/mL。將容器放置冰浴內(nèi)；B．按每mg抗體蛋白內(nèi)加入0.01~0.02mgFITC（即二者比例為1：50~1：100）。用分析天平稱取所需量的FITC，先溶解于少量碳酸鹽緩沖液（同上），再逐滴緩慢加入蛋白液內(nèi)。邊加邊攪拌混勻，避免產(chǎn)生氣泡，約在5~10分鐘內(nèi)加完；C．將容器（瓶口加塞密閉）及電磁攪拌器移置4~6℃冰箱內(nèi)，繼續(xù)緩慢攪拌結(jié)合12~18小時（亦可在20~25℃室溫下攪拌結(jié)合2~4小時）。去除游離熒光素：先將結(jié)合物經(jīng)離心沉淀（3000r/min，20分鐘）除去少量沉淀物，取上清置透析袋內(nèi)，用0.01mol/L、pH7.2磷酸緩沖液（PBS）于4℃透析3~5天（PBS液量應(yīng)為結(jié)合物的100倍，并需多次更換透析液）。或?qū)⒔Y(jié)合物通過SephadexG-50凝膠柱層析，收集第1洗脫峰，合并，即為熒光抗體。4、標記抗體的純化與質(zhì)量鑒定標記抗體的純化——游離熒光素的去除——未標記及過度標記蛋白的去除——非期望抗體或交叉反應(yīng)抗體的去除4、標記抗體的純化與質(zhì)量鑒定標記抗體的鑒定——抗體效價——熒光素（F）與蛋白質(zhì)（P）結(jié)合比率（F/P值）4、標記抗體的純化與質(zhì)量鑒定特異性染色滴度測定——直接法——間接法標記抗體的特異性鑒定——吸收試驗——抑制試驗5、標記抗體的保存經(jīng)鑒定合格的熒光抗體，可加入0.01%硫柳汞或0.1%疊氮鈉防腐，小量分裝(0.5mL/安瓿)，置0~4℃可保存1年左右；-20℃可保存2~3年，但取出后應(yīng)快速融化，并避免反復凍融。冰凍干燥后可保存較長時間。（二）熒光抗體染色方法用途：測定細胞表面抗原和受體各種病原微生物的快速檢查和鑒定組織內(nèi)抗原的定性和定位研究各種自身抗體的檢測（二）熒光抗體染色方法標本來源穿刺液體液、胸腹水、尿液培養(yǎng)細胞活體組織取材（二）熒光抗體染色方法標本保存選擇適當?shù)墓潭▌┗铙w組織選擇適當?shù)那衅椒ǎǘ晒饪贵w染色方法直接法間接法二、現(xiàn)代免疫熒光分析技術(shù)（一）熒光偏振免疫分析法（二） 均相熒光免疫測定（三） 熒光激活細胞分類儀（四） 時間分辨熒光免疫測定熒光與發(fā)光免疫分析第二節(jié)放射免疫技術(shù)一、放射免疫測定（RIA）二、免疫放射測定（IRMA）三、放射受體分析主要材料和試劑標記抗原標準抗原或待測物標準品特異性抗體分離劑γ-計數(shù)儀低溫離心機標記抗原制備——氯胺T法標記抗原制備——乳過氧化物酶法標記抗原制備——氯甘脲法測定方法——胰島素含量的測定二、免疫放射測定測定方法直接IRMA法雙抗體夾心IRMA法間接IRMA法BAS-IRMA法測定方法——雙抗體夾心IRMA法第三節(jié)免疫酶技術(shù)

免疫酶組織化學技術(shù)免疫酶技術(shù){均相酶免疫測定酶免疫測定{非均相酶免疫測定

非均相酶免疫測定{固相酶免疫測定（ELISA）液相酶免疫測定HRP追蹤技術(shù)免疫組織化學染色一、酶標抗體的制備用于標記抗體（或抗原）的酶應(yīng)符合下列要求——純度及比活性高，且價廉易得——性質(zhì)穩(wěn)定，可溶性好；而且容易和抗體（或抗原）連接，二者的活性均不受影響——受檢組織或體液中不存在與標記酶相同的內(nèi)源性酶或抑制物；——檢測方法簡易、敏感、精確——酶的底物對人體健康無危害常用的標記酶辣根過氧化物酶堿性磷酸酶葡萄糖氧化酶β-D半乳糖苷酶二、非均相酶免疫測定（一）固相酶免疫測定（二）液相酶免疫測定酶聯(lián)免疫吸附試驗（一）固相酶免疫測定——間接法（一）固相酶免疫測定——雙抗體夾心法