方法技術原理效果成本舉例化學法滲透沖擊滲透壓破壞細胞溫和便宜血紅細胞的破壞酶消化法細胞壁被消化，使細胞破碎溫和昂貴

增溶法表面活性劑溶解細胞壁溫和適中膽鹽作用于大腸桿菌脂溶法有機溶劑溶解細胞壁并使之失穩適中便宜甲苯破碎酵母細胞堿處理法堿的皂化作用使細胞壁融解劇烈便宜

方法技術原理效果成本舉例機械法勻漿法（片型）細胞被攪拌器劈碎適中適中動物組織及動物細胞研磨法細胞被研磨物磨碎適中便宜

超聲波法用超聲波的空穴作用使細胞破碎適中昂貴細胞懸浮液小規模處理勻漿法（孔型）須使細胞通過的小孔，使細胞受到剪切力而破碎劇烈適中細胞懸浮液大規模處理珠磨破碎法細胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細胞懸浮液和植物細胞的大規模處理詳細內容：機械法

主要通過機械切力的作用使組織細胞破碎的方法，常用的器械有組織搗碎機、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。

1.

組織搗碎機

將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。一般用于動物組織、植物肉質種子、柔嫩的葉芽等，轉速可高達10000rpm/M以上。由于旋轉刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。

2.

勻漿器

先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料，除玻璃外，還可以用硬質塑料、不銹鋼、人造熒光樹脂等。此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。

存在的問題；較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器，質地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。

3.

研缽

多用于細菌或其他堅硬植物材料，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。

4.

細菌磨

是一種改良了的研磨器，比研缽具有更大的研磨面積，而且低部有出口。操作時先把細菌和研磨粉調成糊狀，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可將細菌細胞完全磨碎。

物理法

主要通過各種物理因素使組織細胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有：

1.

反復凍溶法

原理：因突然冷凍，細胞內冰晶的形成及

胞內外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。

方法：將待破碎的細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。

特點：此法適用于組織細胞，多用于動物性材料，對微生物細胞作用較差。

2.

急熱驟冷法

將材料投入沸水中，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻，此法可用于細菌及病毒材料。

3.

超聲波處理

用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，頻高于15～20KHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎。其破碎機理：可能與空化現象引起的沖擊波和剪切力有關。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及首種類型等因素有關。

特點：操作簡單，重復性較好，節省時間；多用于微生物和組織細胞的破碎。

存在問題：超聲波破碎在實驗室規模應用較普遍，處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，但是超聲波產生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。空化作用是細胞破壞的直接原因，同時會產生活性氧，所以要加一些巰基保護劑。

化學及生物化學法

1.

自溶法

在一定PH和適當的溫度下，利用組織細胞內自身的酶系統將細胞破碎的方法。此過程需較長時間，常用少量防腐劑如甲苯、氯仿等防止細胞的污染。

2.

酶溶法

利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細胞壁分解，使細胞內含物釋放出來。有些細菌對溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后，使之轉為對溶菌酶敏感而溶解。

特點：

a)

此法適用多種微生物；

b)

具有作用條件溫和；

c)

內含物成分不易受到破壞；

d)

細胞壁損壞的程度可以控制。

存在的問題：易造成產物抑制作用，這可能是導致胞內物質釋放率低的一個重要因素。而且溶酶價格高，限制了大規模利用。若回收溶酶，則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質提取，給進一步純化帶來困難。

3.

化學滲透法

某些有機溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內合物有選擇地滲透出來。其作用機理；化學滲透取決于化學試劑的類型以及細胞壁和膜的結構與組成。

特點：多用于破碎細菌，且作用比較溫和；提取核酸時，常用此法破碎細胞。

存在的問題：時間長，效率低；化學試劑毒性較強，同時對產物也有毒害作用，進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。

小結

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質的提取。離心機的六大使用注意事項目前，實驗室常用的是電動離心機電動離心機轉動速度快，要注意安全，特別要防止在離心機運轉期間，因不平衡或試管墊老化，而使離心機邊工作邊移動，一致從實驗臺上掉下來，或因蓋子未蓋，離心管因振動而破裂后，玻璃碎片旋轉飛出，造成事故。因此使用離心機時，必須注意以下操作。離心機套管底部要墊棉花或試管墊。電動離心機如有噪音或機身振動時，應立即切斷電源，即時排除故障。離心機在預冷狀態時，離心機蓋必須關閉，離心結束后取出轉頭要倒置于實驗臺上，擦干腔內余水，離心機蓋處于打開狀態。轉頭蓋在擰緊后一定要用手指觸摸轉頭與轉蓋之間有無縫隙，如有縫隙要擰開重新擰緊，直至確認無縫隙方可啟動離心機。離心管必須對稱放入套管中，防止機身振動，若只有一支樣品管另外一支要用等質量的水代替。分離結束后，先關閉離心機，在離心機停止轉動后，方可打開離心機蓋，取出樣品，不可用外力強制其停止運動。離心期間，實驗者不得離開去做別的事。密度梯度離心的原理不同顆粒之間存在沉降系數差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶的方法。用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細胞的介質要求：1）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）PH中性或易調為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細胞無毒。密度梯度離心機離心示例葉綠體的分離實驗原理將植物組織勻漿后懸浮在等滲介質中進行差速離心，是分離細胞器的常用方法。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀、稠密度，也與離心力以及懸浮介質的粘度有關。在一給定的離心場中，同一時間內，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞組分。實驗步驟：1.選取新鮮的菠菜嫩葉，洗擦干后去除葉梗及粗脈，稱30g于0.35mol/L氯化鈉溶液150ml中置組織搗碎機或研缽中。2.利用組織搗碎機低速（5000r/min）勻漿，3~5min，或研磨成勻漿。3.用6層紗布過濾，濾液盛于燒杯中。4.取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。5.將上清液在3000r/min下離心5min，棄去上清液，沉淀即為葉綠體（混有部分細胞核）。6.沉淀用0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮。7.取葉綠體懸液1滴置于載玻片上，加蓋玻片后用普通光學顯微鏡觀察。

教學問題：高中生物必修1中研究細胞器的分離方法是差速離心法，必修2中研究DNA復制方式——半保留復制的方法是密度梯度離心法，兩者之間有什么區別？一、差速離心法差速離心法是交替使用低速和高速離心，用不同強度的離心力使具有不同質量的物質分級分離的方法。此法適用于混合樣品中各沉降系數差別較大組分的分離。1．工作原理通常兩個組分的沉降系數差在10倍以上時可以用此法分離。例如某樣品中有大、中、小三個組分，用差速離心法分離時，把樣品放在離心管內，先按大組分的沉降系數選擇離心轉速和離心時間，當離心結束時正好使大組分全部沉降到離心管底部，這時中小組分中的一部分也會沉降到底部。若原始樣品液中三個組分的含量相等，則在原始樣品液中大組分占總組分量的三分之一。通過一次離心后分離出的大組分沉淀占總組分量約90%。如要進一步提純可以把此沉淀物再溶解，再按大組分的沉降條件離心，得到大組分的第二次離心沉淀。通過多次對沉淀和上清液差速離心，可以把三個沉降系數有差別的組份分離提純，所以這個方法又稱為分步離心法。2．差速離心法的優缺點差速離心法的優點是樣品的處理量較大，可用于大量樣品的初分離。其缺點是分離復雜樣品和要求分離純度較高時，離心次數多，操作繁雜。由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中間損失，所以離心分辨力差。實際分離時由于離心時的對流、擴散和收取沉淀時的污染，對于一些沉降系數相差不大的組分無法進行完全的分離提純。產品的純度和回收率都達不到上述理論值。因此差速離心法主要用于大量樣品的初步分離提純。二、密度梯度離心法密度梯度離心法又稱為區帶離心法，可以同時使樣品中幾個或全部組分分離，具有良好的分辨率。離心時先將樣品溶液置于一個由梯度材料形成的密度梯度液體柱中，離心后被分離組分以區帶層分布于梯度柱中。1．工作原理不同顆粒之間存在沉降系數差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶的方法。介質梯度應預先形成，介質的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油。密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。

2．密度梯度離心法的優缺點

密度梯度離心法的優點是分離效果好，可一次性獲得較純凈顆