第2講微生物培養(yǎng)與應(yīng)用第1頁[最新考綱]

1.微生物分離和培養(yǎng)2.某種微生物數(shù)量測定3.培養(yǎng)基對微生物選擇作用4.利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)特定產(chǎn)物以及微生物在其它方面應(yīng)用第2頁1．無菌操作技術(shù)包含消毒和滅菌。消毒包含煮沸消毒、巴氏消毒、化學(xué)藥劑消毒和紫外線消毒等；滅菌包含灼燒滅菌、干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌。2．培養(yǎng)基制備包含計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、倒平板等步驟，倒置平板目標(biāo)是預(yù)防培養(yǎng)皿蓋上水滴滴入培養(yǎng)基造成污染。3．大腸桿菌純化包含平板劃線法和稀釋涂布平板法。平板劃線法要求屢次劃線，稀釋涂布平板法要求菌液要充分地稀釋。第3頁4．微生物計(jì)數(shù)要求制作多個(gè)平板，且選擇能長出30～300個(gè)菌落平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。5．尿素分解菌和纖維素分解菌分離都利用了選擇培養(yǎng)基，前者所用培養(yǎng)基中尿素是唯一氮源，后者所用培養(yǎng)基中纖維素是唯一碳源。第4頁[課前導(dǎo)學(xué)]1．培養(yǎng)基概念：人們按照微生物對____________不一樣需求，配制出供其生長繁殖____________。知識(shí)點(diǎn)一微生物試驗(yàn)室培養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)基質(zhì)第5頁2．方法與步驟【答案】固體氮源無機(jī)鹽稱量滅菌溫和強(qiáng)烈全部芽孢平板劃線稀釋涂布平板第6頁3．無菌技術(shù)方法、類型和對象[連一連]【答案】①②⑥—b—Ⅰ、Ⅱ

③④⑤—a—Ⅲ、Ⅳ第7頁4．大腸桿菌純化培養(yǎng)(1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基過程：計(jì)算→______→溶化→滅菌→倒平板。(2)純化大腸桿菌原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌稀釋或分散成_____________，形成單個(gè)菌落，此菌落是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來子細(xì)胞群體。(3)微生物慣用接種方法：____________和稀釋涂布平板法，接種過程依然是__________操作。稱量單個(gè)細(xì)胞平板劃線法細(xì)胞群體第8頁第9頁【答案】B【解析】分析表中成份可知，該培養(yǎng)基中沒有凝固劑，為液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基營養(yǎng)成份齊全，但存在伊紅、美藍(lán)等判別物質(zhì)，屬于判別培養(yǎng)基，A錯(cuò)誤；該培養(yǎng)基中蛋白胨既是唯一氮源，也是碳源，而葡萄糖是絕大多數(shù)生物最常利用碳源，B正確；該培養(yǎng)基中存在無機(jī)鹽和蛋白胨中一些物質(zhì)能夠看作是生長因子，C錯(cuò)誤；培養(yǎng)基調(diào)整完pH還要進(jìn)行滅菌等操作后才能使用，D錯(cuò)誤。第10頁2．以下相關(guān)微生物培養(yǎng)敘述中，不正確是()A．取得純凈培養(yǎng)物關(guān)鍵是預(yù)防雜菌污染B．單菌落分離是消除污染雜菌通用方法C．培養(yǎng)基都必須使用高壓蒸汽滅菌法滅菌D．倒置平板預(yù)防培養(yǎng)皿蓋上冷凝水滴落【答案】C【解析】微生物培養(yǎng)中取得純凈培養(yǎng)物關(guān)鍵是預(yù)防雜菌污染，通常能夠采取稀釋涂布平板法和平板劃線法進(jìn)行單菌落分離，以消除污染雜菌；培養(yǎng)基都需要滅菌，但要依據(jù)實(shí)際情況選擇滅菌方法，假如培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)在高溫條件下易分解，則不能使用高壓蒸汽滅菌法；倒平板后需將培養(yǎng)皿倒置，以預(yù)防培養(yǎng)基蒸氣冷凝成水滴入培養(yǎng)基而污染。第11頁[課前導(dǎo)學(xué)]1．土壤中分解尿素細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)知識(shí)點(diǎn)二微生物篩選和計(jì)數(shù)菌種篩選使用以尿素為唯一______選擇培養(yǎng)基分離方法______________法試驗(yàn)流程土壤取樣→___________→培養(yǎng)與觀察菌種判定以尿素為唯一氮源培養(yǎng)基中加入______指示劑氮源稀釋涂布平板樣品稀釋酚紅2．分離原理：土壤中細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣蒧_________，這種物質(zhì)在把尿素分解成無機(jī)物過程中起__________作用。脲酶催化第12頁3．分解纖維素微生物分離【答案】復(fù)合纖維二糖剛果紅透明圈剛果紅纖維素梯度透明圈第13頁[小題通關(guān)]1．某學(xué)者欲從被石油污染過土壤中分離出能分解石油細(xì)菌，并從中篩選出分解石油能力較強(qiáng)菌株，基本操作過程為采集菌種→選擇培養(yǎng)→純種分離→性能測定。以下敘述錯(cuò)誤是()A．應(yīng)選取以石油為唯一碳源選擇培養(yǎng)基B．可經(jīng)過屢次選擇培養(yǎng)方式來到達(dá)分離和純化目標(biāo)菌目標(biāo)C．單菌落周圍分解圈小菌株降解能力強(qiáng)D．接種后需將平板倒置且需一個(gè)未接種培養(yǎng)基作對照【答案】C【解析】降解石油能力越強(qiáng)菌株，在菌落周圍形成分解圈越大。第14頁2．使用液體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)纖維素分解菌目標(biāo)是()①用液體選擇培養(yǎng)基可取得大量纖維素分解菌②用液體培養(yǎng)基便于稀釋涂布平板③纖維素分解菌只能在液體培養(yǎng)基中生長④用液體培養(yǎng)基可判別纖維素分解菌A．①② B．①③ C．②④ D．③④【答案】A【解析】使用液體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)纖維素分解菌，首先能夠取得大量纖維素分解菌，另首先便于稀釋涂布平板。纖維素分解菌也能夠在固體培養(yǎng)基上生長；判別纖維素分解菌使用是固體培養(yǎng)基。第15頁1．培養(yǎng)基中營養(yǎng)成份：培養(yǎng)基普通都含有水、無機(jī)鹽、碳源、氮源和生長因子，另外，還要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣要求。微生物試驗(yàn)室培養(yǎng)營養(yǎng)要素起源功效碳源無機(jī)碳源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳無機(jī)物①組成細(xì)胞中物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物；②有些既是碳源又是能源有機(jī)碳源糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、石油、花生粉餅等第16頁營養(yǎng)要素起源功效氮源無機(jī)氮源NH3、銨鹽、硝酸鹽、N2等將無機(jī)氮合成含氮代謝產(chǎn)物有機(jī)氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸等合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮代謝產(chǎn)物生長因子維生素、氨基酸、堿基①酶和核酸組成成份；②參加代謝過程中酶促反應(yīng)第17頁2．培養(yǎng)基種類及應(yīng)用劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)應(yīng)用按物理性質(zhì)分液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)半固體培養(yǎng)基加凝固劑(如瓊脂)觀察微生物運(yùn)動(dòng)、分類判定固體培養(yǎng)基微生物分離、判定、活菌計(jì)數(shù)、菌種保藏按用途分選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要微生物生長，促進(jìn)所需微生物生長培養(yǎng)、分離出特定微生物(如培養(yǎng)酵母菌和霉菌，可在培養(yǎng)基中加入青霉素；以尿素為唯一氮源培養(yǎng)基用于分離分解尿素細(xì)菌)判別培養(yǎng)基依據(jù)微生物代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品判別不一樣種類微生物(如可用伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基判別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌)第18頁劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)應(yīng)用按化學(xué)成份分天然培養(yǎng)基含化學(xué)成份不明確天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基成份明確(用化學(xué)成份已知化學(xué)物質(zhì)配成)分類、判別第19頁3．微生物純化培養(yǎng)方法平板劃線法稀釋涂布平板法操作平板劃線法中細(xì)胞分離和稀釋過程發(fā)生在接種環(huán)在固體平板表面上劃線和移動(dòng)過程中。在線開始部分，微生物往往連在一起生長，伴隨線延伸，菌數(shù)逐步降低，最終可能形成純種單個(gè)菌落①將分別盛有9mL水6支試管滅菌，并按101～106次序編號(hào)；②用移液管吸收1mL培養(yǎng)菌液，注入101倍稀釋試管中。用手指輕壓移液管上橡皮頭，吹吸3次，使菌液與水充分混勻；③從101倍稀釋試管中吸收1mL稀釋液，注入102倍稀釋試管中，重復(fù)②步混勻操作。依次類推，直到完成最終1支試管稀釋第20頁方法平板劃線法稀釋涂布平板法注意事項(xiàng)(1)接種環(huán)灼燒：①第一次劃線前灼燒：殺滅接種環(huán)上微生物，防止污染培養(yǎng)物；②每次劃線前灼燒：殺死殘留菌種，確保每次劃線菌種來自上次劃線末端；③劃線結(jié)束后灼燒：殺死殘留菌種，防止污染環(huán)境和感染操作者(2)灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后再進(jìn)行操作，以免溫度太高殺死菌種(3)劃線時(shí)最終一區(qū)域不要與第一區(qū)域相連(4)劃線用力要大小適當(dāng)，預(yù)防用力過大將培養(yǎng)基劃破(1)稀釋操作時(shí)：每支試管及其中9mL水、移液管等均需滅菌；操作時(shí)，試管口和移液管應(yīng)在離火焰1～2cm處(2)涂布平板時(shí)：①涂布器用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精消毒，取出時(shí)，讓多出酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少許酒精涂布器在酒精燈火焰上引燃；②不要將過熱涂布器放在盛放酒精燒杯中，以免引燃其中酒精；③酒精燈與培養(yǎng)皿距離要適當(dāng)，移液管管頭不要接觸任何物體第21頁方法平板劃線法稀釋涂布平板法目標(biāo)在培養(yǎng)基上形成由單個(gè)菌種繁殖而來子細(xì)胞群體——菌落培養(yǎng)平板冷凝后倒置培養(yǎng)，使培養(yǎng)基表面水分愈加好地?fù)]發(fā)，預(yù)防皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基造成污染第22頁

消毒和滅菌比較項(xiàng)目條件結(jié)果慣用方法應(yīng)用范圍消毒較為溫和物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部對人體有害微生物煮沸消毒法日慣用具巴氏消毒法不耐高溫液體化學(xué)藥劑消毒法用酒精擦拭雙手，用氯氣消毒水源滅菌強(qiáng)烈理化原因殺死物體內(nèi)外全部微生物，包含芽孢和孢子灼燒滅菌法接種工具干熱滅菌法玻璃器皿、金屬工具高壓蒸汽滅菌法培養(yǎng)基及容器滅菌第23頁1．回答以下相關(guān)微生物培養(yǎng)問題：(1)如表是某培養(yǎng)液成份含量表，該培養(yǎng)液培養(yǎng)微生物同化作用類型是________；若用此培養(yǎng)液培養(yǎng)固氮微生物，則應(yīng)除去成份是______________，應(yīng)加入物質(zhì)是________________。考查微生物營養(yǎng)成份編號(hào)成份含量①(NH4)HCO30.5g②KH2PO43.0g③CaSO40.5g④FeCl20.5g⑤維生素少許⑥水1000mL第24頁第25頁④培養(yǎng)基配制好后，分裝前應(yīng)進(jìn)行工作是________________________。⑤從配制培養(yǎng)基直到培養(yǎng)完成，所采取預(yù)防雜菌污染方法是__________、__________、__________等。(3)微生物接種方法很多，最慣用是______________和______________。【答案】(1)自養(yǎng)型(NH4)HCO3(或①)有機(jī)物(2)①碳源氮源維生素(或磷酸鹽等)②瓊脂(凝固劑)③所培養(yǎng)微生物對各營養(yǎng)成份需求量④調(diào)整pH⑤高壓蒸汽滅菌燒灼接種環(huán)酒精棉擦手(或棉塞塞試管口、在火焰旁接種)(3)平板劃線法稀釋涂布平板法第26頁【解析】(1)由該培養(yǎng)液中不含有機(jī)碳源，可判斷培養(yǎng)生物同化類型為自養(yǎng)型；若用此培養(yǎng)液培養(yǎng)固氮微生物，則應(yīng)除去氮源NH4HCO3，但需加入有機(jī)物提供碳源。(2)依據(jù)所培養(yǎng)微生物對各營養(yǎng)成份需求量配制培養(yǎng)基成份，若需觀察細(xì)菌菌落情況需用固體培養(yǎng)基，還需添加瓊脂(凝固劑)；微生物培養(yǎng)時(shí)需對培養(yǎng)基、接種工具進(jìn)行無菌處理，并進(jìn)行嚴(yán)格無菌操作。(3)慣用微生物接種方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法。第27頁2．金黃色葡萄球菌是一個(gè)含有高度耐鹽性微生物，可引發(fā)人類患肺炎、腸炎等疾病。金黃色葡萄球菌在血平板(培養(yǎng)基中添加適量血液)上生長時(shí)，可破壞菌落周圍紅細(xì)胞，使其褪色。下列圖為定性檢測鮮牛奶中是否存在金黃色葡萄球菌操作流程，請回答相關(guān)問題：考查微生物純化培養(yǎng)第28頁(1)按細(xì)胞結(jié)構(gòu)分類，金黃色葡萄球菌屬于________生物；從培養(yǎng)過程分析，金黃色葡萄球菌可進(jìn)行________呼吸。(2)7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基為微生物提供營養(yǎng)成份包含________________，用7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)主要目標(biāo)是_______________________。(3)操作中在血平板上接種方法是____________，接種操作前后需要對接種工具進(jìn)行________滅菌。(4)在制備血平板時(shí)需將pH調(diào)整至________(填“微酸性”或“微堿性”)后滅菌，待培養(yǎng)基________后，再加入適量血液。按培養(yǎng)基功效分類，血平板屬于____________培養(yǎng)基。第29頁(5)經(jīng)屢次規(guī)范操作、重復(fù)試驗(yàn)，血平板上均出現(xiàn)________________菌落，初步證實(shí)鮮牛奶中存在金黃色葡萄球菌，但鮮牛奶供給商仍認(rèn)為此菌并非鮮牛奶所攜帶，所以，要對本操作進(jìn)行完善，完善方案是______________________。【答案】(1)原核有氧(2)碳源、氮源、水和無機(jī)鹽增加金黃色葡萄球菌數(shù)量(3)平板劃線法灼燒(4)微堿性冷卻判別(5)周圍存在透明圈設(shè)置不加鮮牛奶但其它操作均相同對照組第30頁【解析】(1)金黃色葡萄球菌是一個(gè)細(xì)菌，屬于原核生物；培養(yǎng)過程無密閉處理，故它進(jìn)行有氧呼吸。(2)7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基可為微生物提供生長所需要碳源、氮源、水和無機(jī)鹽。用7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)是為了增加高度耐鹽性金黃色葡萄球菌數(shù)量。(3)圖示用接種工具是接種環(huán)，說明在血平板上接種方法是平板劃線法；接種工具在接種前后都要進(jìn)行滅菌處理。(4)金黃色葡萄球菌生長環(huán)境為弱堿性，培養(yǎng)基在滅菌前要先調(diào)整pH，因金黃色葡萄球菌能破壞紅細(xì)胞，使其褪色，血平板上出現(xiàn)周圍存在透明圈菌落，說明有金黃色葡萄球菌，故血平板是判別培養(yǎng)基。(5)為增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)論嚴(yán)謹(jǐn)性，應(yīng)增加空白對照組。第31頁

微生物純化三種路徑(1)單菌落挑取法：利用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種到固體平板培養(yǎng)基表面，直接依據(jù)微生物菌落特征利用單菌落挑取方法來取得目標(biāo)微生物。(2)選擇培養(yǎng)法：利用選擇培養(yǎng)基對微生物進(jìn)行選擇培養(yǎng)，直接取得目標(biāo)微生物。(3)判定培養(yǎng)法：利用判別培養(yǎng)基使目標(biāo)微生物菌落展現(xiàn)特有特征，然后篩選目標(biāo)微生物。第32頁1．判定分解尿素細(xì)菌和分解纖維素細(xì)菌方法微生物分離與計(jì)數(shù)項(xiàng)目土壤中尿素分解菌分離試驗(yàn)土壤中纖維素分解菌分離試驗(yàn)土壤采樣采集土壤應(yīng)該選擇含有尿素土壤采集土樣應(yīng)選擇富含纖維素環(huán)境選擇培養(yǎng)選擇土樣，將土樣放在含有尿素作為唯一氮源培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)取土樣，在無菌條件下裝入錐形瓶，在一定條件下振蕩培養(yǎng)1～2d，直到培養(yǎng)液渾濁；選擇培養(yǎng)目標(biāo)是增加纖維素分解菌純度，確保分離得到所需微生物第33頁項(xiàng)目土壤中尿素分解菌分離試驗(yàn)土壤中纖維素分解菌分離試驗(yàn)梯度稀釋選取一定稀釋范圍樣品液進(jìn)行培養(yǎng)以確保菌落數(shù)在30～300依次將培養(yǎng)液稀釋101～107倍判定方法在以尿素為唯一氮源培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌，若指示劑變紅，則pH升高，說明該種菌能分解尿素剛果紅染色法，即在含有纖維素培養(yǎng)基中，加入剛果紅時(shí)，剛果紅與培養(yǎng)基中纖維素形成紅色復(fù)合物；當(dāng)纖維素被分解后，該復(fù)合物不能形成，培養(yǎng)基中出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心透明圈第34頁2．選擇培養(yǎng)基制作方法(1)在培養(yǎng)基全部營養(yǎng)成份具備前提下，依據(jù)一些微生物對一些物質(zhì)抗性，在培養(yǎng)基中加入一些物質(zhì)，以抑制不需要微生物生長，促進(jìn)所需要微生物生長，如培養(yǎng)基中加入高濃度食鹽時(shí)可抑制各種細(xì)菌生長，但不影響金黃色葡萄球菌生長，從而可將該菌分離出來；而在培養(yǎng)基中加入青霉素時(shí)可抑制細(xì)菌、放線菌生長，從而可分離得到酵母菌和霉菌。(2)經(jīng)過改變培養(yǎng)基營養(yǎng)成份到達(dá)分離微生物目標(biāo)。如培養(yǎng)基中缺乏氮源時(shí)，可分離自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而無法生存；培養(yǎng)基中若缺乏有機(jī)碳源則異養(yǎng)微生物無法生存，而自養(yǎng)微生物可利用空氣中CO2制造有機(jī)物得以生存。第35頁(3)利用培養(yǎng)基特定化學(xué)成份分離特定微生物。如當(dāng)石油是唯一碳源時(shí)，可抑制不能利用石油微生物生長，使能夠利用石油微生物生存，從而分離出能消除石油污染微生物。(4)經(jīng)過一些特殊環(huán)境分離微生物。如在高鹽環(huán)境中可分離耐鹽菌，其它菌在鹽濃度高時(shí)易失水而不能生存；在高溫環(huán)境中可分離得到耐高溫微生物，其它微生物在高溫環(huán)境中因酶失活而無法生存。第36頁

微生物篩選過程中必要兩種對照培養(yǎng)基及其作用對照組作用現(xiàn)象結(jié)論未接種培養(yǎng)基有沒有雜菌污染判斷未接種培養(yǎng)皿中無菌落生長未被雜菌污染接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基篩選作用確實(shí)認(rèn)牛肉膏培養(yǎng)基上菌落數(shù)大于選擇培養(yǎng)基上菌落數(shù)選擇培養(yǎng)基含有篩選作用第37頁3．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目標(biāo)方法(1)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法①原理：利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積樣品中微生物數(shù)量。②缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌。(2)間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法)①原理：當(dāng)樣品稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長一個(gè)菌落，起源于樣品稀釋液中一個(gè)活菌。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)平板上菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。第38頁②操作：a．設(shè)置重復(fù)組，增強(qiáng)試驗(yàn)說服力及準(zhǔn)確性。b．為了確保結(jié)果準(zhǔn)確，普通選擇菌落數(shù)在30～300之間平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。③計(jì)算公式：每克樣品中菌株數(shù)＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用稀釋液體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。注意：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)往往比活菌實(shí)際數(shù)目小。這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連在一起時(shí)，平板上觀察到只是一個(gè)菌落。第39頁1．研究被石油污染過土壤中細(xì)菌數(shù)量，并從中篩選出能分解石油細(xì)菌。為了分離和純化高效分解石油細(xì)菌，科研人員利用被石油污染過土壤進(jìn)行如圖A所表示試驗(yàn)。考查微生物分離與計(jì)數(shù)圖A

圖B

第40頁第41頁(3)步驟⑤后取樣測定石油含量目標(biāo)是____________________________。對步驟⑤中某瓶中細(xì)菌計(jì)數(shù)方法有兩種，一個(gè)方法是________________，其菌落數(shù)可代表活菌數(shù)；另一個(gè)方法是________________，該方法