限制酶選擇的三大根據1.根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類圖1(1)應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶,以便將目的基因“切出”,如圖甲可選擇PstⅠ(目的基因兩端均具PstⅠ)。(2)不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶,以防破壞目的基因,如圖甲不能選擇SmaⅠ。(2)為防止目的基因和質粒的自身環化和隨意連接,也可使用不一樣的限制酶切割目的基因和質粒,如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要保證質粒上也有這兩種酶的切點),并且這種切點不至于完全破壞“標識基因”。2.根據質粒的特點確定限制酶的種類(1)所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致,以保證具有相似的黏性末端。(2)質粒作為載體必須具有標識基因等,因此所選擇的限制酶盡量不要破壞這些構造,應至少具有一種完好的標識基因,如圖2中限制酶pstⅠ因其會破壞該質粒上唯一的標識基因而不適宜選擇。(3)所選限制酶切點不應位于復制原點處以防破壞復制原點(如圖2中KpnⅠ)。假如所選酶的切點不止一種,則切割重組後也許會丟失某些片段——若丟失的片段含復制起點區,則切割重組後的片段進入受體細胞後不能自主復制。(4)所選限制酶,其切點應位于啟動子與終止子之間,如圖2中HindⅢ會破壞啟動子,EcoRⅠ會破壞終止子,而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可讓目的基因嵌入啟動子與終止子之間。3.參照Ti質粒的T－DNA片段選擇限制酶若質粒上標出T－DNA片段,則所選限制酶切點應位于T－DNA片段中,從而有助于將目的基因嵌入到T－DNA片段上——由于Ti質粒的T－DNA片段最易轉移至受體細胞并且整合到受體細胞染色體DNA上,從而實現“轉化”。如用兩種限制酶XbaⅠ和SacⅠ(兩種酶切出的黏性末端不一樣)切割某DNA,獲得含目的基因的片段。若運用該片段構建基因體現載體,則甲～丁四種Ti質粒中宜選擇“丙”作載體,而不適宜選擇甲、乙、丁。(分析如下)1.(·全國卷Ⅲ,40)圖(a)中的三個DNA片段上依次表達出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內切酶的識別序列與切割位點,圖(b)為某種體現載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。根據基因工程的有關知識,回答問題:(1)經BamHⅠ酶切後得到的目的基因可以與上述體現載體被酶切後的產物連接,理由是_____________________________________________________________________________________________________________________________。(2)若某人運用圖(b)所示的體現載體獲得了甲、乙、丙三種具有目的基因的重組DNA分子,如圖(c)所示,這三種重組DNA分子中,不能在宿主細胞中體現目的基因產物的有,不能體現的原因是___________________________________________________________________________________________________。圖(c)(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶,常見的有和,其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_______________________________。[慧眼識圖獲取信息](1)三種限制酶切割成果分析(2)基因體現載體分析答案(1)Sau3AⅠ兩種酶切割後產生的片段具有相似的黏性末端(2)甲、丙甲中目的基因插入在啟動子的上游,丙中目的基因插入在終止子的下游,兩者的目的基因均不能被轉錄(3)E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶2.(·經典高考)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點,圖1、圖2中標注了有關限制酶的酶切位點,其中切割位點相似的酶不反復標注。請回答問題:(1)用圖中質粒和目的基因構建重組質粒,應選用兩種限制酶切割,酶切後的載體和目的基因片段,通過酶作用後獲得重組質粒。為了擴增重組質粒,需將其轉入處在態的大腸桿菌。(2)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌,應在篩選平板培養基中添加,平板上長出的菌落,常用PCR鑒定,所用的引物構成為圖2中。(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接,連接部位的6個堿基對序列為,對于該部位,這兩種酶(填“都能”、“都不能”或“只有一種能”)切開。(4)若用Sau3AⅠ切圖1質粒最多也許獲得種大小不一樣的DNA片段。審題指導第一步:首先看目的基因兩側有何種切割位點以保障能將目的基因“切出”如圖2使用BamHⅠ、BclⅠ可切斷左側,HindⅢ、Sau3AⅠ可切斷右側第二步:再回到“質粒”,看質粒中限制酶切割位點,如圖中總共有BamHⅠ、BclⅠ、BamHⅠ及HindⅢ四個限制酶識別位點,其中并不存在目的基因中Sau3AⅠ酶識別位點,故不選Sau3AⅠ酶,而BamHⅠ在四環素抗性基因與氨芐青霉素抗性基因中均存在,倘若使用該酶將會導致兩個標識基因同步被破壞,故只能選擇BclⅠ與HindⅢ,而使用此兩類酶將導致氨芐青霉素抗性基因遭破壞,因此制備重組質粒選擇培養基時只能根據“四環素抗性基因”,如下圖所示:此外,根據BamHⅠ和BclⅠ的酶切位點,BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接,連接部位的6個堿基對序列為,這與兩種酶的酶切位點均不一樣,即兩種酶在該片段找不到識別位點。又根據BamHⅠ、BclⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點,Sau3AⅠ在質粒上有三個酶切位點,完全酶切可得到記為A、B、C三種片段,若部分位點被切開,可得到AB、AC、BC、ABC四種片段,因此用Sau3AⅠ切圖1質粒最多也許獲得7種大小不一樣的DNA片段。答案(1)BclⅠ和HindⅢDNA連接感受(2)四環素引物甲和引物丙(3)eq\b\lc\(\a\vs4\al\co1(TGATCCACTAGG))eq\b\lc\(\rc\)(\a\vs4\al\co1(GGATCACCTAGT))都不能(4)71.(·河南中原名校聯考)人類是乙型肝炎病毒的唯一宿主,既有的肝硬化、肝癌多從乙肝發展而來,接種乙肝疫苗是防止乙肝病毒感染的最有效措施。乙型肝炎疫苗的研制先後經歷了血源性疫苗和基因工程疫苗階段。血源性“乙型肝炎疫苗”是取用乙肝病毒感染者的血液,用差速離心提純血液中的乙肝病毒,之後再滅活,制成乙肝疫苗。基因工程乙肝疫苗的生產和使用過程如圖1,圖2示意大腸桿菌質粒的有關基因與限制酶切點；圖3示意有關限制酶在DNA分子中的詳細切點。請回答有關問題:(1)從圖1可知,該目的基因的詳細功能是_________________________________。(2)選擇大腸桿菌質粒作為運載體的原因是____________________________________________________________________________________________________。(3)用基因工程疫苗接種比血源性疫苗更安全,試從疫苗的構造特點解釋原因:___________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)形成有效的重組質粒,選擇合適的限制性內切酶很重要。某學習小組根據圖2和圖3提出了三種方案:單獨使用BamHⅠ、分別使用BamHⅠ和EcoRⅠ以及分別使用HindⅢ和EcoRⅠ,且認為選擇使用BamHⅠ和EcoRⅠ最佳。該方案的長處是______________________________________________________________。假如選擇使用HindⅢ和EcoRⅠ,則在構建重組質粒後,還需要運用技術以檢測目的基因與否導入受體細胞。答案(1)指導合成乙肝病毒外殼(2)①對受體細胞無害；②具標識基因,能對重組DNA與否進入受體細胞進行鑒定；③在宿主細胞內能自我復制；④具有多種酶切位點,供外源基因插入其中。(3)血源性疫苗需滅活破壞其核酸構造,滅活不成功則會導致接種者患乙肝,而基因工程疫苗僅有乙肝病毒外殼,不需要滅活(4)既防止了質粒發生自身環化和目的基因與質粒之間的反向連接,又便于篩選出具有目的基因(重組質粒)的受體細胞DNA分子雜交(或核酸分子雜交、分子雜交)2.(·山東湖北部分重點中學聯考)如圖所示為培育二倍體轉基因抗蟲玉米的兩種思緒。EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ為限制酶(箭頭所指為酶切位點)。回答問題:(1)據圖,獲取目的基因時不能選擇SmaⅠ酶的原因是它_____________________。選擇EcoRⅠ和BamHⅠ酶的長處是可防止目的基因與質粒連接。(2)與思緒1相比,思緒2的最大長處是獲得的轉基因抗蟲玉米。(3)培育轉基因抗蟲玉米的關鍵環節是___________________________________。其目的是使目的基因在受體細胞中______________________________________。(4)將重組質粒導入受精卵,采用最多的措施是農桿菌轉化法,這跟農桿菌的有關。(5)操作⑤常用的措施是________________________________________________。解析(1)題圖顯示:目的基因中存在SmaⅠ的識別位點。若使用SmaⅠ切割外源DNA,則會破壞外源DNA中的目的基因的構造,因此獲取目的基因時不能選擇SmaⅠ切割。EcoRⅠ和BamHⅠ的識別位點不一樣,形成的黏性末端不一樣,因此選擇EcoRⅠ和BamHⅠ切割質粒和外源DNA,其長處是可防止目的基因與質粒反向連接。(2)思緒1是將重組質粒導入玉米的受精卵中,由該受精卵發育成的植株不一定都是純合子,思緒2是將重組質粒導入由花粉通過脫分化形成的愈傷組織中,由該愈傷組織形成的單倍體幼苗2再通過人工誘導,使其染色體加倍,最終得到的玉米株都是純合子。可見,與思緒1相比,思緒2的最大長處是獲得的轉基因抗蟲玉米都是純合子(或答不發生性狀分離)。(3)培育轉基因抗蟲玉米采用的是基因工程技術,該技術的關鍵環節是基因體現載體的構建。構建基因體現載體的目的是:使目的基因在受體細胞中穩定存在并可遺傳給下一代,同步使目的基因可以體現和發揮作用。(4)農桿菌的Ti質粒上具有T－DNA,T－DNA可轉移至受體細胞,并整合到受體細胞的染色體DNA上。在培育轉基因植物時,采用最多的措施是農桿菌轉化法,正是運用了農桿菌的Ti質粒上具有的T—DNA的這一特點。操作⑤是人工誘導染色體數目加倍,常用的措施是用秋水仙素處理幼苗。答案(1)破壞目的基因的構造反向(2)都是純合子(或答不發生性狀分離)(3)基因體現載體的構建穩定存在并可遺傳給下一代同步使目的基因可以體現(4)Ti質粒上具有T－DNA(5)用秋水仙素處理幼苗eq\a\vs4\al\co1(課後·加強訓練)(時間:20分鐘)1.(·河南名校聯盟調研)如圖所示為培育轉基因細菌的操作流程,回答問題:(1)圖中①過程所用工具酶有。為了防止載體和外源DNA自連,應怎樣操作？________________________________________________________。(2)當細菌的轉化過程中吸取的外源DNA是病毒DNA時,該轉化過程又稱轉染。圖中外源DNA來自。為了提高轉染效率,應使用處理細菌。(3)圖中②過程,重組DNA增殖時需要哪些條件？_________________________。(4)圖中③過程,篩選含重組質粒的細菌需用到基因的功能。已知所用載體內有青霉素抗性基因和四環素抗性基因兩種抗性基因,請寫出能在含四環素的培養基上生長,但不能在含青霉素的培養基上生長的細菌即為含外源DNA細菌的前提條件:________________________________________________________________________________________________________________________________(答出兩點即可)。解析根據轉染的定義可知,培育圖示轉基因細菌的外源DNA應來自(DNA)病毒。此外,限制酶也可以答成限制性核酸內切酶。答案(1)限制酶和DNA連接酶應使用兩種限制酶同步切割載體和外源DNA(2)(DNA)病毒Ca2＋(3)模板、原料、酶和能量等(4)標識原細菌不具有青霉素和四環素的抗性基因,外源DNA插入到載體的青霉素抗性基因內部2.(·山東聊城一模)屠呦呦因發現青蒿素治療瘧疾的新療法而獲得諾貝爾獎。寄生于人體細胞內的瘧原蟲是瘧疾的病原體。科學家通過紫外線處理大量青蒿幼苗後,偶爾發現一株高產高效植株,進行基因測序發現該植株控制青蒿素合成有關的一種關鍵酶的基因發生了突變。(1)假如用高產青蒿關鍵酶基因的mRNA反轉錄產生的cDNA片段與載體連接後儲存在一種受體菌群中,這個受體菌群叫做青蒿的；獲得的cDNA與青蒿細胞中該基因堿基序列(填“相似”或“不一樣”)。在提取RNA時需要向提取液中添加RNA酶克制劑,其目的是________________________________。(2)將獲得的突變基因導入一般青蒿之前,先構建基因體現載體,圖1、2中箭頭表達有關限制酶的酶切位點。請回答:用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒時不能使用SmaⅠ切割,原因是。構建重組質粒時在其目的基因前需要添加特定的啟動子,啟動子的作用是。(3)基因體現載體導入組織細胞後,要通過植物組織培養技術培育出青蒿幼苗,該技術的關鍵環節是。鑒定該基因工程與否成功還要進行試驗,不過不能直接在培養基上培養瘧原蟲觀測,其原因是____________________________________________________________________________________________。答案(1)cDNA文庫(或部分基因文庫)不一樣防止RNA的降解(2)SmaⅠ會破壞質粒的抗生素抗性基因及外源DNA的目的基因RNA聚合酶識別和結合位點(3)脫分化和再分化接種瘧原蟲營寄生生活3.(·淄博模擬)研究發現,人體內的N基因是正常基因,無N基因的人會患嚴重腎病而早年夭折,科學家為治愈此病進行了有關探索。下圖是對標識基因(綠色熒光蛋白基因,用GFP基因表達)和N基因的酶切過程。請據圖分析回答問題:(1)切割基因時選用不一樣限制酶的目的是。切割完畢後,需用DNA連接酶將兩基因連接成GFP—N融合基因(如下稱融合基因),該融合基因的上游基由于________________________________________________________________。(2)若用質粒作運載體,需用圖中的酶切割質粒。在構建的融合基因體現載體中,調控融合基因轉錄的構造為。(3)將融合基因體現載體包埋在由磷脂雙分子層構成的脂質體內并轉染ES細胞,融合基因體現載體進入ES細胞的方式為。用激光激發ES細胞并用熒光顯微鏡觀測,可確定細胞內有現象的ES細胞轉染了融合