試驗一考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質的含量（p24）一、目的規定

掌握考馬斯亮藍（CoomassieBrilliantBlue）法測定蛋白質含量原理和措施。二、試驗原理考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是運用蛋白質─染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的迅速、敏捷的措施。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種措施的突出長處，因而正在得到廣泛的應用。這一措施是目前敏捷度最高的蛋白質測定法。考馬斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中為棕紅色，當它與蛋白質通過范德華鍵結合後，變為藍色。在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸取峰（lmax）的位置，由465nm變為595nm。且在蛋白質一定濃度范圍內符合比爾定律，通過測定595nm處光吸取的增長量可知與其結合蛋白質的量。研究發現，染料重要是與蛋白質中的堿性氨基酸（尤其是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。考馬斯亮藍染色法的突出長處是：（1）敏捷度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是由于蛋白質與染料結合後產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數，因而光吸取值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測定迅速、簡便，只需加一種試劑。完畢一種樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大概只要2分鐘即可完畢，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最佳。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。（3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺陷是：（1）由于多種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不一樣，因此考馬斯亮藍染色法用于不一樣蛋白質測定期有較大的偏差，在制作原則曲線時一般選用g—球蛋白為原則蛋白質，以減少這方面的偏差。（2）仍有某些物質干擾此法的測定，重要的干擾物質有：去污劑、TritonX-100、拾二烷基硫酸鈉（SDS）等。三、材料、試劑與器具

（一）、試劑：考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000ml,濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。原則蛋白質溶液：純的牛血清血蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。（二）原則和待測蛋白質溶液1．原則蛋白質溶液純的牛血清血蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。2．待測蛋白質溶液。人血清，使用前用0.15mol/LNaCl稀釋200倍。（二）、器材：1、試管1.5×15cm（×6）和試管架。2、移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；3、可見光分光光度計。（三）、原則曲線制作：試管編號012345未知200ug/ml原則蛋白（ml）0.00.20.40.60.81.00.15mol/LNaCl（ml）21.81.61.41.21.0考馬斯亮藍試劑（ml）666666搖勻，1h內以1號管為空白對照,在595nm處比色蛋白質濃度（ug/ml）0510152025A595nm2、以A595nm為縱坐標，原則蛋白含量為橫坐標（），在坐標軸上繪制原則曲線。1）運用原則曲線查出回歸方程。2）用公式計算回歸方程。一般有關系數應過0.999以上，至少2個9以上。4）、繪圖時近兩使點在一條直線上，在直線上的點應當在直線兩側。（四）、蛋白質含量的測定：樣品即所測蛋白質含量樣品（含量應處理在所測范圍內），根據操作環節1操作，測出樣品的A595nm，然後運用原則曲線或回歸方程求出樣品蛋白質含量。一般被測樣品的A595nm值在0.1—0.5之間，因此上述樣品假如A595nm值太大，可以稀釋後再測A595nm值，然後再計算。（五）、注意事項：玻璃儀器要洗滌潔凈。取量要精確。玻璃儀器要干燥，防止溫度變化。對照：用被測物質以外的物質作空白對照。在試劑加入後的5－20min內測定光吸取，由于在這段時間內顏色是最穩定的。測定中，蛋白－染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完後可用乙醇將藍色的比色杯洗潔凈。試驗二、紫外吸取法測定核酸的含量一、目的1、熟悉紫外分光光度計的基本原理和使用措施。2、學習紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作措施。二、原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子構造中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統（－C＝C一C＝C一），可以強烈吸取250～280nm波長的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸取值在260nm處。遵照Lambert-Beer定律，可以從紫外光吸取值的變化來測定核酸物質的含量。在不一樣pH溶液中嘌呤、嘧啶堿基互變異構的狀況不一樣，紫外吸取光也隨之體現出明顯的差異，它們的摩爾消光系數也隨之不一樣。因此，在測定核酸物質時均應在固定的pH溶液中進行。核酸的摩爾消光系數（或吸取系數），一般以ε（ρ）來表達，即每升具有一摩爾核酸磷的溶液在260nm波長處的消光值（即光密度，或稱為光吸取）。核酸的摩爾消光系數不是一種常數，而是依賴于材料的前處理、溶液的pH和離子強度發生變化。它們的經典數值（pH=7.0）如下：DNA的ε（ρ）=6000～8000RNA的ε（ρ）=7000～10000小牛胸腺DNA鈉鹽溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=6600，DNA的含磷量為9.2%，含1μg/mLDNA鈉鹽的溶液光密度為0.020。RNA溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=7700～7800，RNA的含磷量為9.5%，含1μg/mLRNA溶液的光密度為0.022～0.024。采用紫外分光光度法測定核酸含量時，一般規定：在260nm波長下，濃度為1μg/mL的DNA溶液其光密度為0.020，而濃度為1μg/mL的RNA溶液其光密度為0.024。因此，測定未知濃度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可計算測出其中核酸的含量。該法簡樸、迅速、敏捷度高，如核酸3μg／mL的含量即可測出。對于具有微量蛋白質和核苷酸等吸取紫外光物質的核酸樣品，測定誤差較小，若樣品內混雜有大量的上述吸取紫外光物質，測定誤差較大，應設法事先除去。由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高約40％，這就是眾所周知的增色效應（hyperchromiceffect）。在大分子的核酸中，氫鍵和π-鍵互相作用變化了堿基的共振行為。因此，核酸的光密度低于構成它的核苷酸的光密度，該現象稱為減色效應（hypochromiceffect）。蛋白質和核苷酸也能吸取紫外光。一般蛋白質的吸取高峰在280nm波長處，在260nm處的吸取值僅為核酸的1∕10或更低，因此對于具有微量蛋白質的核酸樣品，測定誤差較小。RNA的260nm與280nm吸取的比值.在2.0以上；DNA的260nm與280nm吸取的比值則在1.9左右，當樣品中蛋白質含量較高時，比值下降。若樣品內混雜有大量的蛋白質和核苷酸等吸取紫外光的物質，應設法事先除去。三、試驗材料、重要儀器和試劑（一）試劑1．原則核酸溶液（酵母RNA或小牛胸腺DNA，用0.01NaOH溶液配制成500μg/ml溶液）2．待測核酸樣品（二）器具1、紫外分光光度計2、微量注射器（50μL）3、移液管3．試劑（1）5%～6%氨水：用25%～30％氨水稀釋5倍。（2）鉬酸銨-過氯酸試劑：取3.6mL70%過氯酸和0.25g鉬酸銨溶于96.4mL蒸餾水中。四、操作環節（一）核酸紫外吸取光譜的測定取100μL的RNA溶液于試管中，加入5mL蒸餾水，搖勻，測定核酸溶液在220～290nm波長范圍的消光值，再用蒸餾水作空白調零。以該溶液在各波段的光吸取值（即A值）為縱坐標，波長為橫坐標，繪制核酸的吸取光譜。（二）核酸溶液含量的測定將上述測吸取光譜溶液的A260直接計算溶液的RNA含量A260A260五、注意事項假如待測的核酸樣品中具有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，則在測定期需加鉬酸銨——過氯酸沉淀劑，沉淀除去大分子核酸，測定上清液A值作為對照。六、思索題1．采用紫外光吸取法測定樣品的核酸含量，有何長處及缺陷？2．若樣品中具有核苷酸類雜質，應怎樣校正？參照答案1．用紫外光吸取法測定樣品的核酸含量，具有簡樸、迅速、敏捷度高的長處，并且待測核酸樣品中具有的微量蛋白質和核苷酸等吸取紫外光物質，產生較小測定誤差。但該法在測定樣品內混雜有大量的上述吸取紫外光物質時，則會產生較大測定誤差，需要設法事先除去。2．當樣品中具有核苷酸類雜質時，需要加鉬酸銨-過氯酸沉淀劑處理，沉淀除去大分子核酸，測定上清液260nm處光密度，以此作為對照；再從未加沉淀劑測得的樣品液260nm光密度中扣除。試驗三植物體內過氧化氫酶活性的測定一、目的過氧化氫酶普遍存在于植物組織中，其活性與植物的代謝強度及抗寒、抗病能力均有關系，故常加以測定。通過試驗可理解過氧化氫酶的作用，并掌握測定過氧化氫酶活性的原理和措施。二、原理過氧化氫酶把過氧化氫分解為水和氧，其活性大小，以一定期間內分解的過氧化氫量來表達，當酶與底物（H2O2）反應結束後，用碘量法測定未分解的H2O2量。以鉬酸銨作催化劑，使H2O2與KI反應，放出游離碘，然後用硫代硫酸鈉滴定碘，其反應式為：H2O2+2KI+H2SO4—→I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O3—→2NaI+Na2S4O6根據空白和測定兩者硫代硫酸鈉滴定用量之差，即可求出過氧化氫酶分解H2O2的量。三、材料、儀器設備及試劑1.材料：水稻葉、甘蔗葉及其他植物葉片。2.儀器設備：分析天平；恒溫水浴；研缽；100ml容量瓶；100ml三角瓶；滴定管；滴定管架；移液管；移液管架；漏斗；洗耳球等。3.試劑及配制1.8mol·L－1H2SO410﹪(NH4.)6MO7O40.02mol·L－1Na2S2O320﹪KI1﹪淀粉液CaCO3粉石英砂0.018﹪H2O2溶液配制：吸取30﹪H2O2原液0.3ml至50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻後再稀釋10倍。四、試驗環節1.過氧化氫酶的提取選用甘蔗功能葉片，擦凈去主脈剪成碎片，混勻後迅速稱取1g放入經冷凍過的研缽中，加少許CaCO3粉末及石英砂，并加入3～4ml蒸餾水，在冰浴上研磨至勻漿，用蒸餾水將勻漿通過漏斗洗入100ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻後過濾。然後再取濾液10ml至100ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻即為酶稀釋液。2.酶活性測定2.1取100ml容量瓶4個，編號，向各瓶精確加入稀釋後的酶液10ml，立即向3、4號瓶中加入1.8mol·L－1H2SO45ml以終止酶活性，作為空白測定。2.2將各瓶放在20℃水浴中保溫5～10min（若室溫超過20℃則以室溫為準）。保溫後向各瓶精確加入0.018﹪H2O2.3將各瓶放在20℃水浴中讓酶與底物（H2O2）作用5min。時間到後迅速取出，立即在1、2號瓶中加入1.8mol·L－1H2SO42.4向4個瓶中各加入20﹪KI1ml和3滴10﹪(NH4.)6MO7O4，搖勻，用0.02mol·L－1Na2S2O3滴定至淡黃色後再加入5滴1﹪淀粉液作指示劑，再用0.02mol·L－1Na2S2O3滴定至藍色剛消失為滴定終點，記錄Na2S2O3用量。五、酶活性計算空白與樣品兩個反復滴定值取平均值按下公式計算出過氧化氫酶活性：被分解H2O2（mg）=〔空白滴定值（ml）－樣品滴定值（ml）〕×C×17.17被分解H2O2（mg）×酶液稀釋倍數過氧化氫酶活性（mgH2O2·g－1Fw·min－1）=————————————————————樣品鮮重（g）×酶促反應時間（min）公式中：C－Na2S2O3量濃度17.17—H2O2摩爾質量試驗四種子粗脂肪的提取一、試驗目的脂肪廣泛存在于油料植物種子和果實中，測定脂肪的含量，可以鑒別其品質的優劣，也是油料作物選種和種質資源調查的常規測定項目。二、試驗原理在理解了試驗目的之後，有關這個試驗有如下幾種問題需要大家思索：1.種子成分很復雜，脂肪的提取怎樣進行？2.什么是粗脂肪？（答：脂肪不溶于水，易溶于有機溶劑（如石油醚）。運用這一特性，選用有機溶劑直接浸提出樣品中的脂肪進行測定。提取物中除脂肪之外，尚有游離脂肪酸、石蠟、磷脂、固醇、色素、有機酸等物質，故浸提物稱粗脂肪。）通過以上問題的思索，我們懂得了脂肪的提取重要是運用其易溶于有機溶劑的特性。詳細的試驗操作粗脂肪的提取，一般采用索氏脂肪提取器。運用脂類物質溶于有機溶劑的特性。在索氏提取器中用有機溶劑（本試驗用石油醚，沸程為30～60℃）對樣品中的脂類物質進行提取。圖索氏脂肪提取器1.浸提管2.通氣管3.虹吸管4.小燒瓶5.冷凝管索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分構成的，提取管兩側分別有虹吸管和連接管。各部分連接處要嚴密不能漏氣。提取時，將待測樣品包在脫脂濾紙包內，放入提取管內。提取瓶內加入石油醚，加熱提取瓶，石油醚氣化，由連接管上升進入冷凝器，凝成液體滴入提取管內，浸提樣品中的脂類物質。待提取管內石油醚液面到達一定高度，溶有粗脂肪的石油醚經虹吸管流入提取瓶。流入提取瓶內的石油醚繼續被加熱氣化、上升、冷凝，滴入提取管內，如此循環往復，直到抽提完全為止。三、材料、儀器與試劑（一）試驗材料大豆、花生、蓖麻、向曰葵、芝麻等油料種子。（二）儀器設備索氏提取器（50mL），燒杯，干燥器，脫脂濾紙，鑷子，分析天平，烘箱，恒溫水浴，脫脂棉。（三）試劑石油醚（化學純，沸程30～60℃）。四、試驗操作1.將洗凈、晾干的芝麻種籽放在80～100℃烘箱中烘4小時。待冷卻後，精確地稱取2～4g，置于研缽中研磨細，將研碎的樣品及擦凈研缽的脫脂棉一并用脫脂濾紙包住用絲線扎好，勿讓樣品漏出。或用特制的濾紙斗裝樣品後，斗口用脫脂棉塞好。放入索氏提取器的提取管內，最終再用石油醚洗凈研缽後倒入提取管內。2.洗凈索氏提取瓶，在105℃烘箱內烘干至恒重，記錄重量。將石油醚加到提取瓶內約為瓶容積的1/2～2/3。把提取器各部分連接後，接口處不能漏氣。用70～80℃恒溫水浴加熱提取瓶，使抽提進行16小時左右，直至抽提管內的石油醚用濾紙檢查無油跡為止。此時表達提取完全。3.提取完畢，取出濾紙包，再回餾一次，洗滌提取管。再繼續蒸餾，當提取管中的石油醚液面靠近虹吸管口而未流入提取瓶時，倒出石油醚。若提取瓶中仍有石油醚，繼續蒸餾，直至提取瓶中石油醚完全蒸完。取下提取瓶，洗凈瓶的外壁，放入105℃烘箱中烘干至恒重，記錄重量。五、注意事項1.本法采用沸點低于60℃的有機溶劑，不能提取出樣品中結合狀態的脂類，故此法又稱為游離脂類定量測定法。2.待測樣品若是液體，應將一定體積的樣品滴在脫脂濾紙上在60～80℃烘箱中烘干後放入提取管內。3.本法使用有機溶劑石油醚（沸程30～60℃）故加熱時不能用明火。六、思索題1.索氏提取法提取的為何是粗脂肪?2.做好本試驗應注意哪些事項?試驗五血清蛋白質醋酸纖維薄膜電泳一、試驗目的學習醋酸纖維薄膜電泳的操作技術，理解電泳技術的基本原理，測定人血清中多種蛋白質的相對含量。二、試驗原理醋酸纖維薄膜電泳(CAME)是以醋酸纖維薄膜(CAM)作支持物的一種區帶電泳技術。醋酸纖維素薄膜是纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯。將它溶于有機溶劑（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）後，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀構造，滲透性強，對分子移動阻力小，厚度為120。醋酸纖維素薄膜作為是電泳支持體有如下長處：①電泳後區帶界線清晰；②通電時間較短（二拾分鐘至一小時）；③它對多種蛋白質（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都幾乎完全不吸附，因此無拖尾現象；④對染料也沒有吸附，因此不結合的染料能完全洗掉，無樣品處幾乎完全無色。它的電滲作用雖高但很均一，不影響樣品的分離效果，由于醋酸纖維素薄膜吸水量較低，因此必需在密閉的容器中進行電泳，并使用較低有電流防止蒸發。本試驗以醋酸纖維素薄膜為電泳支持物，分離人血清蛋白。血清蛋白中具有清蛋白、－球蛋白、－球蛋白、－球蛋白和多種脂蛋白等。多種蛋白質由于氨基酸組分、立體構象、分子量、等電點及行狀不一樣（見下表），在電場中的遷移速度不一樣。分子量小、等電點低的，在相似堿性PH緩沖體系中，帶負電荷多的蛋白質顆粒在電場中遷移速度快。例如人血清蛋白在PH8.6的緩沖體系中電泳，染色後可顯示5條區帶。清蛋白泳動最快，其他依次是球蛋白（如圖1）。醋酸纖維薄膜電泳已經廣泛用于血清蛋白，血紅蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，類固醇及同工酶等的分離分析中，盡管它的辨別力比聚丙酰胺凝膠電泳低，但它具有簡樸，迅速等長處。根據樣品理化性質，從提高電泳速度和辨別力出發選擇緩沖液的種類，pH和離子強度。選擇好的緩沖液最佳是揮發性強，對顯色或紫外光等觀測區帶沒有影響，若樣品含鹽量較高時，宜采用含鹽緩沖液。例如血清蛋白電泳可選用pH8.6的巴比妥緩沖液或硼酸緩沖液；氨基酸的分離則可選用pH7.2的磷酸鹽緩沖液等。電泳時先將濾膜剪成一定長度和寬度的紙條。在欲點樣的位置用鉛筆做上記號，點上樣品，在一定的電壓，電流下電泳一定期間，取下濾膜，進行染色。不一樣物質需采用不一樣的顯色措施，如核苷酸等物質可在紫外分析燈下觀測定位，但許多物質必須經染色劑顯色。醋酸纖維素薄膜電泳染色後區帶可剪下，溶于一定的溶劑中進行光密度測定。也可以浸于折射率為1.474的油中或其他透明液中使之透明，然後直接用光密度計測定。它的缺陷是厚度小，樣品用量很小，不適于制備。將血清樣品點樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中電泳時，血清蛋白質均帶負電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點不一樣而致表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳遷移率不一樣，彼此得以分離。電泳後，CAM經染色和漂洗，可清晰展現清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5條區帶，比色即可計算出血清各蛋白組分的相對百分數。人血清中5種蛋白質的等電點及分子量蛋白質名稱等電點（pI）分子量清蛋白－球蛋白－球蛋白－球蛋白4.885.065.126.85～7.506900～200000～30000090000～150000156000～300000三、材料、儀器與試劑（一）、材料：人血清（二）、儀器醋酸纖維薄膜(8X2mm)；點樣器；染色皿，漂洗器，鑷子；玻璃板；常壓電泳儀；直流電源整流器；水平電泳槽；粗濾紙；直尺和鉛筆（三）、藥物巴比妥緩沖液(pH8.6I=0.06)；氨基黑10B染色液；漂洗液；95％乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸餾水50ml；洗脫液0.4mol／LnaOH；透明液；無水乙醇：冰醋酸＝7：3四、操作環節儀器與薄膜的準備（1）醋酸纖維薄膜的選擇與潤濕用鑷子取一片薄膜，在距醋纖膜一端1.5cm用鉛筆作好標識，然後將薄膜放進緩沖液中，小心放在盛有緩沖液的培養皿中。若漂浮在液面的薄膜在15～30秒內迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此薄膜均勻可以用于電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋或斑點，則表達薄膜不均勻應棄去，以免影響電泳成果。浸泡于緩沖液中約30分鐘，當完全浸透後，用鑷子輕輕取出，夾在兩層濾紙內吸干，方可用于電泳。（2）電泳槽的準備（如下圖）將電泳槽置于水平平臺上，將緩沖液注入電泳槽中，兩邊的電極槽緩沖液的高度要在同一平面。根據電泳槽支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在電泳槽的兩個膜支架上,各放2～４層濾紙條,使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊,另一端浸入電極緩沖液中。當濾紙條所有潤濕後,用玻璃棒輕輕擠壓膜支架上的濾紙以驅趕氣泡,使濾紙的一端緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯絡醋酸纖維薄膜的橋梁，故稱為濾紙橋。點樣將點樣器先在白瓷反應磚上的血清中沾一下，點樣前應在濾紙上反復練習，此步是試驗的關鍵，掌握點樣技術後再正式點樣是獲得清晰區帶的電泳圖譜的重要環節。薄膜浸泡于緩沖液中約30分鐘後，用鑷子輕輕取出，夾在兩層濾紙內吸干，平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上），再在膜條一端2～3厘米處輕輕水平落下并隨即提起，使血清完全深透至薄膜內，形成一定寬度、粗細均勻的直線。電泳用鑷子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙上，點樣面