基因工程1、什么是基因工程？2、基因工程一般步驟？3、每一個步驟的操作方法及考點分別是什么？請以20題利用農桿菌轉化法將Bapt基因導入紫杉醇細胞為例來說明基因工程的一般步驟和各步驟的注意事項。[2018全國1卷]艾弗里肺炎雙球菌轉化實驗對基因工程啟示：

DNA可從一種生物個體轉移到另外一種生物[2017全國1卷]DNA為什么能實現不同生物的轉移，從結構和功能兩個方面進行分析？DNA雙螺旋結構(結構上的可能性)；

生物界共用一套遺傳密碼(功

能上可能性)科學家將非洲爪蟾中能表達抗菌肽的基因轉入大腸桿菌，并在大腸桿菌表達相同的抗菌肽，說明了

。生物界共用一套遺傳密碼①質粒可以作為基因工程的載體；②重組DNA可以進入受體細胞；③不同物種之間可以實現基因交流[2018全國1卷]博耶和科恩將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌表達：重組的DNA轉入大腸桿菌中，轉錄出相同的mRNA,說明了？①獲取目的基因的方法有哪些？基因組文庫從細胞中提取DNA細胞基因組DNA質粒質粒酶切DNA連接酶連接限制酶酶切導入細菌中基因組文庫克隆提取酶切的DNA片段cDNA文庫逆轉錄逆轉錄酶酶切的cDNA片段限制酶酶切質粒質粒酶切連接導入細菌中cDNA文庫克隆提取基因組DNA限制酶酶切mRNA逆轉錄得cDNA，酶切拼接質粒，導入細菌中保存為文庫基因組文庫cDNA文庫（部分基因文庫）一、PCR的原理及應用1、PCR的原理；條件；擴增的過程怎樣？P1472021湖北卷16.某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中有效的是（

）A.增加模板DNA的量

B.延長熱變性的時間C.延長延伸的時間

D.提高復性的溫度溫度低時，即使引物和模版之間的匹配不完全，氫鍵也可能足夠穩定，導致引物結合到非目標區域，而合適的高溫條件下，只有完全互補的區域才能穩定結合。一、PCR的原理及應用1、PCR的原理；條件；擴增的過程怎樣？2、關于PCR的考點總結：P147①PCR中引物的選擇與設計：如何選擇引物？會寫引物序列？②PCR過程中的計算；③PCR的應用：在目的基因兩端加上特定的限制酶識別序列；利用PCR獲得融合基因；定點突變，改造基因。④⑤某科研團隊為建立具有紅色熒光的轉基因小鼠，將紅色熒光基因R（左圖）插入表達載體（右圖）中，構建基因表達載體。已知圖中R基因的轉錄方向為從左到右，幾種限制酶的識別序列和切割位點見下表。回答下列問題。(2)已知R基因轉錄形成的mRNA序列為5’—UGAACGCUA．.....（中間序列）…..GUCGACUCG—3’，請寫出R基因進行PCR擴增時所用的2種引物序列

、

。（各寫出6個堿基序列即可）P147(3)利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似（如圖所示）。第

輪循環產物中開始出現目的基因兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段，第4輪循環后，產物中目的基因兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段有

個。20022240226822(n-1)2n-2n137152n-12×2n-22某科研團隊為建立具有紅色熒光的轉基因小鼠，將紅色熒光基因R（左圖）插入表達載體（右圖）中，構建基因表達載體。已知圖中R基因的轉錄方向為從左到右，幾種限制酶的識別序列和切割位點見下表。回答下列問題。(2)已知R基因轉錄形成的mRNA序列為5’—UGAACGCUA．.....（中間序列）…..GUCGACUCG—3’，請寫出R基因進行PCR擴增時所用的2種引物序列

、

。（各寫出6個堿基序列即可）P147(3)利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似（如圖所示）。第

輪循環產物中開始出現目的基因兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段，第4輪循環后，產物中目的基因兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段有

個。ABCDEABCDEABCDEACBCDEAD引物丙引物乙引物甲若是選用不同的引物搭配，擴增結果有何不同？ABCABCDEABCDEAC引物丙引物乙引物丙引物乙BCAABCBCA引物丙引物乙若選用引物乙丙，擴增產物為乙丙之間的片段，大小為350bp。若選用引物甲丙呢？擴增產物大小為450bpBCDEADBCDEAC引物乙引物甲引物甲引物乙引物乙引物甲BCEADDC若選用甲乙兩種引物呢？若是兩種引物為同一方向，則最終無擴增產物。5′3′5′3′待添加的限制酶的識別序列5′5′5′5′5′3′3′5′3′3′5′3′5′3′5′3′5′3′待添加的限制酶的識別序列5′3′3′5′3′3′在目的基因兩端加上特定的限制酶識別序列將限制酶酶切序列加在引物的5′端53535353第一輪第二輪20.(10分）CRISPR/Cas9基因編輯技術已被廣泛應用于基因治療等領域。其基本工具sgRNA/Cas9來源于原核細胞，包括具有導向功能的sgRNA和行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白，技術原理如圖甲所示。回答下列問題：（2）構建表達載體。人工合成的sgRNA基因如圖丙，需要通過____________擴增，為了確保酶切后能正確連接到質粒上（相應酶切序列如圖丙），需在引物1的5'端加上堿基序列

，引物2的5'端加上堿基序列

P150.10獲得融合基因在基因工程時通常在目的基因的下游連上一個標記基因，如綠色熒光蛋白基因，形成融合基因，導入受體細胞，標記基因的作用是用來檢驗或指示我們的目的基因是否成功導入受體細胞并表達。1、標記基因要和目的基因處在同一套啟動子和終止子內部；2、標記基因一般建議連在目的基因的下游；3、目的基因和標記基因的DNA水平和mRNA水平是融合的，翻譯的蛋白質是兩個獨立的蛋白質。（八省聯考20）細菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP將特異性底物A蛋白磷酸化，改變A蛋白的活性從而應答外界刺激，調控細菌的生長。研究者將Y基因（編碼蛋白激酶Y）與GFP基因（編碼綠色熒光蛋白）拼接成Y-GFP融合基因（Y-GFP基因），導入載體，并表達出融合蛋白（Y-GFP蛋白），以分析蛋白激酶Y的功能，實驗過程如圖所示。回答下列問題。(2)構建Y基因與GFP基因的融合基因時，應將Y基因中編碼終止密碼子的序列刪除，理由是

。(4)利用表達的具有綠色熒光的Y-GFP蛋白還可開展的實驗有

（答出1個即可）。

分析A蛋白被磷酸化的水平如何獲得Y-GFP的融合基因呢？除了用PCR技術外，根據題意，可以如何判定Y-GFP基因成功導入大腸桿菌并表達了呢？獲得融合基因3′5′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′3′5′3′5′再依靠另兩種末端引物進行PCR。不同大小的擴增產物用電泳分離3′3′5′5′3′5′3′5′5′5′5′3′5′3′5′3′3′5′5′5′3′3′ABCD注意加入引物的要求，以及最后進行大量擴增的引物的選擇。（4）菌株A中，X和Y基因的表達均可以提高發酵中乙醇產量。研究人員將X和Y基因融合在一起，構建了XY融合基因能表達的菌株E（如圖），其在發酵中具有更高的乙醇產量。菌株E中無單獨的X和Y基因，且其他基因未被破壞。簡要寫出由菌株A到菌株E的構建思路

。獲得融合基因從菌株A獲得X、Y基因，使用4種引物分別擴增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互補配對，可形成具有重疊鏈的PCR產物，接著利用融合PCR技術構建融合基因，再將獲得的融合基因構建基因表達載體，將基因表達載體導入菌株，進行目的基因檢測與鑒定，最終獲得菌株E。t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和腦血栓的急救藥。然而，為心梗患者注射大劑量的t-PA會誘發顱內出血。研究證實，將t-PA蛋白第84位的氨基酸替換后，能顯著降低出血副作用。(1)獲得能顯著降低出血副作用的t-PA改良蛋白的正確順序是

(選擇正確的編號并進行排序)。①t-PA蛋白功能分析和結構設計

②借助易錯PCR技術對t-PA基因進行隨機突變③借助定點突變改造t-PA基因序列

④檢驗t-PA蛋白的結構和功能⑤設計t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列

⑥利用工程菌發酵合成t-PA蛋白(2)改造t-PA基因序列可以利用如圖1、2所示的基因定點突變技術。圖1表示重疊延伸PCR技術，其中第1對引物是指

,兩對引物參與的PCR過程不能在同一反應系統中進行，原因是

。不選擇產物A進一步延伸的原因是

。

5353ATG535353AG5353T53A第一輪第二輪G535C353AG53如何進行定點突變8.如圖表示利用重疊延伸PCR技術改造目的基因的原理。下列相關敘述錯誤的是(

)A.圖示操作結束后可繼續選用引物1、4進行PCR4,以獲得大量改造后的目的基因B.操作中引物2和引物3序列應含有擬突變位點,且可以互補C.應選用引物1和引物4進行PCR3,以獲得大量目的基因序列D.此過程實現的基因序列改變屬于基因突變,未發生基因重組答案:C重疊延伸PCR重點在于引物的選擇和產物的選擇9.定點誘變技術是近年來生物工程研究中發展迅速的一個領域。通過定點誘變可以在體外改造目的DNA分子,進而研究基因的表達以及蛋白質的結構與功能之間的關系。經典的大引物PCR定點誘變技術成為基于PCR的定點誘變技術中應用最普遍的方法,操作過程如圖甲。研究者欲改造某基因并將其導入大腸桿菌的質粒中保存,該質粒含有氨芐青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位點,結構如圖乙。回答下列問題。(1)利用大引物PCR進行定點誘變需要進行兩輪PCR(PCR1和PCR2),在PCR1中,至少需要

個循環才能獲得圖甲所示的大引物。在PCR2中,要獲得帶有突變位點的改良基因,引物應選用大引物兩條鏈中的

(填“①”或“②”)。2②大引物PCRt-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和腦血栓的急救藥。然而，為心梗患者注射大劑量的t-PA會誘發顱內出血。研究證實，將t-PA蛋白第84位的氨基酸替換后，能顯著降低出血副作用。(1)獲得能顯著降低出血副作用的t-PA改良蛋白的正確順序是

(選擇正確的編號并進行排序)。①t-PA蛋白功能分析和結構設計

②借助易錯PCR技術對t-PA基因進行隨機突變③借助定點突變改造t-PA基因序列

④檢驗t-PA蛋白的結構和功能⑤設計t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列

⑥利用工程菌發酵合成t-PA蛋白(2)改造t-PA基因序列可以利用如圖1、2所示的基因定點突變技術。圖1表示重疊延伸PCR技術，其中第1對引物是指

,兩對引物參與的PCR過程不能在同一反應系統中進行，原因是

。不選擇產物A進一步延伸的原因是

。

(3)圖2表示CBE單堿基編輯系統，該系統由三個元件構成，其中“dCas9蛋白+胞苷脫氨酶”在sgRNA的引導下，對結合區域第4-8位點的堿基C脫氨反應變成U,最終實現C→T的不可逆編輯。過程②

(發生/未發生)磷酸二酯鍵的斷裂和形成。CBE

單堿基編輯系統將靶位點胞嘧啶脫氨基后，細胞復制

次，子代DNA中靶位點堿基對由C-G徹底替換成A-T,實現單堿基編輯。4.常規PCR只能擴增兩引物間的DNA區段,要擴增已知DNA序列兩側的未知DNA序列,可用反向PCR技術。反向PCR技術擴增的原理如圖所示。下列敘述正確的是(

)考法3利用反向PCR技術擴增已知DNA序列兩側的未知DNA序列A.酶切階段,L中不能含有酶切時所選限制酶的識別序列B.環化階段,可選E.coliDNA連接酶而不能選T4DNA連接酶C.應選擇引物2和引物3進行PCR,且二者不能互補配對D.PCR擴增,每輪循環前應加入限制酶將環狀DNA切割成線狀①獲取目的基因的方法有哪些？①需要用到哪些工具酶？選擇上有何要求？載體有何要求？二、基因工程的基本工具磷酸二酯鍵T4DNA連接酶P143pBI121載體多克隆位點是目的基因插入部位，一般具有多種限制酶的酶切位點RNA聚合酶識別位點，啟動轉錄。具有物種和組織細胞特異性可轉移至細胞的染色體DNA上抗卡那霉素基因，用于重組質粒的篩選T-DNAT-DNA動子啟標R記基因Kan多克隆位點復制原點終子止轉錄終止信號啟動子位于基因上游，是RNA聚合酶識別和結合位點，驅動基因轉錄。組成型啟動子（一直干活）組織特異性啟動子（特定組織中干活）誘導性啟動子（特定誘導物下干活）終止子位于基因下游，提供轉錄終止的信號。P1432024河北卷22.新城疫病毒可引起家禽急性敗血性傳染病，我國科學家將該病毒相關基因改造為r2HN，使其在水稻胚乳特異表達，制備獲得r2HN疫苗，并對其免疫效果進行了檢測。回答下列問題：（1）實驗所用載體的部分結構及其限制酶識別位點如圖1所示。其中GtP為啟動子，若使r2HN僅在水稻胚乳表達，GtP應為______啟動子。Nos為終止子，其作用為_______。r2HN基因內部不含載體的限制酶識別位點。因此，可選擇限制酶________和________對r2HN基因與載體進行酶切，用于表達載體的構建。（2）利用________方法將r2HN基因導入水稻愈傷組織。為檢測r2HN表達情況，可通過PCR技術檢測________________，通過________技術檢測是否翻譯出r2HN蛋白。研究者設計了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表達載體，將其轉入駒形桿菌后構建出一株能合成BC膜并可實現光控染色的工程菌株，該工程菌株產生的BC膜可通過特定圖案的光照處理后形成所需黑色圖案，這為新型紡織原料的有機制造及印染工藝升級提供了新思路（圖一）。回答下列問題：(2)研究者利用T7噬菌體的DNA構建了一種可被藍光調控的基因表達載體，這是由于T7噬菌體的DNA可以表達一種RNA聚合酶（T7RNAP），利用該酶作為“開關”可控制載體上有關基因的表達。藍光調控載體的原理如下圖二：①原本T7RNAP兩部分分離時不具有活性，在藍光照射下，藍光光敏蛋白標簽nMag與pMag相識別進而促成T7RNAP的N端與T7RNAP的C端結合，使T7RNAP具有活性；②有活性的T7RNAP會識別特異型啟動子PT7，然后與基因表達載體特定位點結合開啟有關基因的表達。所構建的基因表達載體的部分序列如圖三，該序列含有基因Ⅰ、基因Ⅱ、基因Ⅲ，這些基因的表達均需有關的RNA聚合酶識別并結合相關的啟動子后才能開啟，該載體中的啟動子有兩種：一種是通用型啟動子PBAD，能被工程菌的RNA聚合酶識別，另一種是特異型啟動子PT7，僅能被T7RNAP識別。請根據圖示中基因表達的物質進行分析，在構建載體時，為實現藍光控制染色，啟動子①②③依次為_____（填“PBAD”或“PT7”），理由是_____________。(3)根據預設的圖案用藍光照射已長出的BC菌膜并繼續培養一段時間，隨后將其轉至染色池處理，發現只有經藍光照射的區域被染成黑色，其原因是藍光照射后_______。關于限制酶的選擇1、限制酶的選擇要求；P1422、不同題目里限定條件要看清。（綿陽一診20）某科研團隊為建立具有紅色熒光的轉基因小鼠，將紅色熒光基因R（左圖）插入表達載體（右圖）中，構建基因表達載體。已知圖中R基因的轉錄方向為從左到右，幾種限制酶的識別序列和切割位點見下表。回答下列問題。限制酶BamHIMfeIEcoRIHindⅢ識別序列和切割位點G↓GATCCC↓AATTGG↓AATTCA↓AGCTT(1)使用限制酶

切割含R基因的DNA片段，使用限制酶

切割圖中的質粒，再用

酶連接成重組質粒。(4

)圖3分別表示通過基因定點突變技術獲得并酶切后的t-PA

改良基因、質粒pCLY11與一些限制酶的識別序列和酶切位點。要想將t-PA

改良基因與質粒pCLY11高效連接，需用限制酶

切割質粒。解題關鍵：一定看清題干信息，找到突破點。①獲取目的基因的方法有哪些？①需要用到哪些工具酶？選擇上有何要求？載體有何要求？①如何將目的基因導入受體細胞？如何檢測目的基因是否導入了受體細胞雙抗法和藍白班法

某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因）。有人將此質粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，