第七章核酸的分子雜交

一、核酸分子雜交的概念

三、核酸分子雜交的原理四、核酸分子雜交的過程

五、影響雜交的因素

六、核酸分子雜交的基本方法

二、核酸分子雜交的用途

核酸分子雜交（nucleicacidhybridization）是指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。雜交的雙方分別稱為探針與待測核酸，雜交后形成的異源雙鏈分子稱為雜交分子。

一、核酸分子雜交的概念DNA—DNA雜交分子DNA—RNA雜交分子核酸分子雜交技術是目前生命科學研究領域中應用最廣泛的技術之一。用途：1、是定性或定量檢測特異DNA或RNA序列片段的有力工具；2、在基因工程技術中，用放射性標記或非放射性標記的寡核苷酸或cDNA探針進行菌落雜交，可從cDNA文庫或基因組文庫中篩選出特定的克隆，獲得某一重組體；3、用克隆化的DNA片段作探針進行Southern雜交，可確定基因組DNA上特定區域的核苷酸同源順序；二、核酸分子雜交的的用途4、用S1核酸酶或RNA酶消化DNA/RNA或者RNA/RNA雜交體是分析基因轉錄或RNA加工的重要方法；5、對某一已知基因或已克隆測序的基因可利用核酸雜交技術進行染色體定位；6、可用于遺傳病的基因診斷，用于限制性片段長度多態性作疾病的相關分析，基因連鎖分析，法醫學上的性別分析和親子鑒定。7、在人類學研究中，HLA分型等方面也有應用價值。核酸分子雜交的基本原理是：具有互補序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）堿基互補配對結合，重新形成雙鏈；在這一過程中，核酸分子經歷了變性和復性的變化，以及復性過程中分子間鍵的形成和斷裂等。雜交的雙方是待測核酸序列和已知核酸序列。在雜交體系中已知的核酸序列稱作探針（probe），探針通常用于進行核素或非核素示蹤標記。三、核酸分子雜交的原理探針的意義：要檢測某一樣品或基因組DNA中特定的DNA順序或基因片段，首先必須獲得相應的探針，即已知順序的DNA或RNA片段，并使它帶上可檢測到的示蹤標記。分子雜交的形式：⑴固—液相雜交一般在進行某一核酸順序的檢測時，先將待測的單鏈靶核酸固定在適當的載體上，然后置于含相應單鏈核酸探針的雜交反應體系中，通過堿基互補配對原則，兩條單鏈的同源順序通過氫鍵互相結合，形成雙鏈結構。經過對標記探針的檢測可以判斷待檢測樣品中相應順序的存在與否及分子量大小。⑵液相雜交有時也將待測核酸和已知核酸同時放在液體中進行雜交反應。兩種雜交形式的基本原理都是一樣的。1、變性：在物理或化學因素作用下，例如加熱、酸堿或紫外線照射，可以導致兩條DNA鏈之間的氫鍵斷裂，而核酸分子中的所有共價鍵（如磷酸二酯鍵、糖苷鍵等）則不受影響，稱為DNA變性（DNAdenaturation）。四、核酸分子雜交的的過程—DNA的變性與復性導致DNA變性的常用方法有三種：⑴熱變性⑵堿變性⑶化學試劑變性。變性的情況：a.T<700C，DNA幾乎不變性；b.700C<T<900C，DNA部分變性；c.T>900C，DNA變性使雙鏈打開，成為單鏈分子；d.T>1000C，DNA雙鏈分離。所以，一般核酸變性的溫度都選在90～1000C之間。（1）熱變性：當升高核酸溶液的溫度時，核酸雙鏈間的氫鍵發生斷裂，核酸的雙鏈逐漸打開。（2）酸堿變性：當核酸溶液的pH低于3或高于10時，核酸的雙鏈可以完全打開成為單鏈核酸分子。在分子雜交中，最常用的核酸變性方法是堿變性。因通常需要的核酸的載體如凝膠或膜對熱都不穩定。（3）化學試劑變性：當核酸溶液中含有一定濃度的化學試劑如尿素、甲醛等時，兩條鏈之間的氫鍵可以斷裂而形成單鏈核酸分子。

除物理、化學因素外，DNA分子的組成也影響變性。最主要的因素是DNA分子中的GC含量，GC含量高的DNA不易變性，而AT含量高的DNA容易變性。另外，環狀DNA比線性DNA難于變性。

DNA的變性是可逆的，即兩條互補的單鏈DNA分子在變性條件除去后重新按堿基互補原則以氫鍵相連形成雙鏈DNA分子，這一過程稱作DNA復性（DNArenaturation）

。

如果是異源雙鏈分子的結合則稱為雜交。相似的復性或雜交反應可以發生在任何具有互補核苷酸順序的兩條單股核酸鏈之間，如DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA或人工合成的寡核苷酸片段與DNA、RNA等。2、復性1、核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復性速度越快；分子量越大，復性速度越慢。一般情況下：探針濃度為0.1~0.5μg；長度為50~300bp2、溫度：適宜溫度為比Tm值低250C

Tm—雙鏈DNA變性一半所需要的溫度（DNA的溶解溫度，meltingtemperature,Tm）3、離子強度:必須維持較高的雜交反應液和洗膜液的鹽濃度五、影響核酸分子雜交的因素

核酸分子雜交實際上就是兩條互補的單鏈核酸分子通過復性重新締合形成雙鏈的過程。這一過程受到諸多因素的影響。4、雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，從而使得：（1）在低溫下探針更穩定；（2）能更好地保留非共價結合的核酸。一般是：50%甲酰胺35~420C5、核酸分子的復雜性：不同順序的總長度（DNA的堿基數）6、非特異性雜交反應：須在雜交前封閉非特異性雜交位點，以減少其對探針的非特異性吸附作用1.Southern印跡雜交（Southernblot）

——鑒別DNA靶分子（待測核酸是DNA）六、核酸分子雜交的基本方法3.斑點雜交、4.原位雜交、5.核酸酶保護實驗等。2.Northern印跡雜交（Northernblot）

——鑒別RNA靶分子（待測核酸是RNA）根據其用途可將核酸分子雜交分為幾種基本類型：Southern印跡雜交是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA片段轉印并結合到一定的固相支持物上，然后用標記的DNA探針檢測待測DNA的一種方法?；静襟E：（一）Southern印跡雜交

1.待測核酸樣品的制備（1）、制備待測DNA：從樣本的細胞或組織中制備DNA

（2）、DNA的限制酶消化：將DNA切割成大小不同的片段

2.待測DNA樣品的電泳分離：將DNA樣品在0.8~1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以對DNA片段進行分離（瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖形成的網狀物質，具有分子篩的作用，DNA因其分子大小而在瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同達到分離）。

3.凝膠中核酸的變性：對凝膠中的DNA進行堿變性，使其形成較短的單鏈片段。

4.Southern轉膜：將凝膠中的DNA片段轉移到硝酸纖維膜（NC）等固相支持物上。各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置是一樣的，故稱為印跡（blot）。（1）毛細管虹吸印跡法：利用濃鹽轉移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉移到固相支持物上。（見下頁圖）（2）電轉印法：通過電泳作用將凝膠中的DNA轉移到濾膜上。（3）真空轉移法：其原理與毛細管虹吸印跡法相同。Southern轉膜的方法重物濕濾紙吸水紙玻璃板膠膜濕濾紙濕濾紙橋支持平臺玻璃容器20×SSC毛細管虹吸法Southern轉膜示意圖5.探針的制備：用缺口平移或隨機引物標記的方法制備探針、標記。7.雜交結果的檢測（1）

放射線標記——線感光膠片，顯出黑色雜交帶；（2）

非放射線標記——直接顯出雜交帶。6.Southern雜交（1）

預雜交封閉膜上所有能與DNA結合的位點轉印后的膜在預雜交液（不含探針的雜交液）4~6小時（2）

雜交（過夜）Southern印跡雜交在醫學中的應用

Southern印跡雜交技術已有20余年的歷史，在核酸的結構和功能研究中作出過重要貢獻。如：發現成熟B細胞中免疫球蛋白基因重排現象；進行克隆基因的酶切圖譜分析；特定基因的定性和定量；DNA多態性(RFLP,RAPD,AFLP等)分析……

Northern印跡雜交是指將待測RNA樣品經電泳分離后轉移到固相支持物上，然后與標記的核酸探針進行固—液相雜交，以檢測RNA（主要是mRNA）的方法。其基本原理和基本過程與Southern印跡雜交基本相同。只是在以下幾點有所不同。（二）Northern印跡雜交1、靶核酸——RNA2、

RNA電泳——在變性膠中進行（加入變性劑，以維持單線性狀態）3、轉膜——不需要再進行變性和中和，直接用毛細管虹吸法等轉移。（三）斑點及狹縫印跡雜交特點：簡單、快速；但不能鑒別分子量，且特異性不高，有一定的假陽性。

將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維膜和尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達的定性及定量研究，稱為斑點印跡(dotblot)。如印跡是線狀則為狹縫印跡。（四）原位雜交核酸保持在細胞或組織樣本中，經適當的方法處理細胞或組織后，將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交（insituhybridization）。特點：（1）不受組織成分的影響；（2）靈敏度高；（3）可完整保持細胞或組織形態，準確反映組織細胞的相互關系及功能；（4）可檢測多個探針。核酸原位雜交包括組織細胞的固定、預雜交、雜交、沖洗及信號檢測等基本步驟。1、組織或細胞的固定2、組織細胞雜交前的預處理（預雜交）3、探針的選擇和標記4、雜交5、雜交結果檢測重點介紹熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）概念：液相雜交是指待測核酸分子與核酸探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子。種類：（一）RNA酶保護分析法(RNaseprotectionassay,RPA)用于mRNA定量、mRNA末端定位及確定內含子在相應基因中的位置等。（五）液相雜交1、制備待測RNA2、RNA探針的標記3、雜交4、除去單鏈RNA5、電泳分析（二）核酸酶S1保護分析法(nucleaseS1protectionassay)用于基因轉錄起始位點分析及內含子剪切位點分析。其原理與RNA酶保護分析法類似

1、cDNA探針：逆轉錄→cDNA→克隆載體→擴增重組質?！崛≠|?！亟M質?！懈頲DNA片段→分離純化→cDNA探針cDNA探針應用最廣泛2、基因組DNA探針：從基因組文庫→篩選特定基因（或基因片段）→克隆→擴增→純化→切取片段→分離純化→探針3、寡核苷酸探針：一定長度的寡核苷酸片段（十幾個核苷酸以上）4、RNA探針：以RNA作為探針（基因克隆和體外轉錄獲得）七、探針的標記（一）探針的種類1、核素標記物2、非核素標記物（1）半抗原：生物素(biotin)和地高辛(digoxin,digacin,DIG)

（2）配體:生物素既是半抗原，又是親和素(avidin，抗生物素蛋白)，故可用生物素-親和素反應進行雜交信號檢測（3）熒光素：異硫氰酸熒光素(FITC)

（4）化學發光探針（二）標記物1、缺口平移法(nicktranslation)(見圖)

2、隨機引物法(randonprimer)（見圖）3、PCR標記法

4、末端標記法（三）標記方法缺口平移法標記DNA探針DNaseⅠ；Mg2+5'3'模板DNA3'5'5'3'3'隨機打開缺口5'DNA聚合酶；[α-32P]-dCTP；dNTPs標記的探針隨機引物法標記DNA探針5'3'模板DNA3'5'5'3'變性5'3'Klenow聚合酶；[α-32P]-dCTP；dNTPs變性標記的探針隨機引物1、乙醇沉淀法2、SephadexG-