1.概念：（1）同尾酶（2）同裂（工）酶（1）同尾酶：來源不同的限制酶，識別及切割序列各不相同，但卻能產生出相同的粘性末端但兩種同尾酶切割形成的DNA片段經連接后所形成的重組序列，不能被原來的限制酶所識別和切割（2）同裂（工）酶：指來源不同，但識別相同靶序列的核酸內切酶同裂酶進行同樣的切割，產生同樣的末端但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同2.了解各種載體的結構、特點與容量，掌握載體的選擇載體特點：能自主復制；易于分離和純化；含有可供選擇的遺傳標記；含有一個或多個多克隆位點（multipleclonesites,MCS）；不含與復制無關的區域；不影響宿主的生長和繁殖常用的載體：質粒，λ噬菌體，粘粒，BAC（細菌人工染色體），YAC（酵母人工染色體）載體名稱受體細胞結構插入片段容量舉例質粒E.coli環狀〈8kbpUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBACE.coli環狀≈300kbPeloBAC系列YAC酵母細胞線性染色體100-2000kb（1）質粒載體的一般生物學特性:①質粒DNA的構型：SC型共價閉合環形DNA（cccDNA）OC型開環DNA（ocDNA）L型性DNA（cDNA）②不同質粒的分子量大小差異相當顯著：106～108D③質粒DNA的復制類型：a.低拷貝的質粒（1～3）：嚴緊型復制控制的質粒b.高拷貝的質粒（10~60）：松弛型復制控制的質粒④質粒DNA的接合性：接合是細菌通過性菌毛相互牽引，然后遺傳物質（主要是質粒DNA）通過胞質通道從供體菌轉移給受體菌，使受體菌獲得的新的穩定遺傳性狀的現象。接合性質粒：能通過接合方式轉移的質粒稱為接合性質粒，F質粒、R質粒、Col質粒和毒力質粒。與兩類基因有關：tra基因、mob基因和bom位點.⑤質粒的不親合性：在同一個大腸桿菌細胞，一般不能同時含有兩種不同的質粒。質粒的不親合性分子基礎：主要是由于它們在復制功能之間的相互干擾。經典質粒載體：pBR322和pUC系列（pUC8/9）結構：pBR322①復制起點ori②Ampr基因③Tetr基因pUC系列（pUC8/9）①復制起點②Ampr基因③lacZ的啟動子④lacZ’基因pUC特點①更小的分子量②選擇方便③克隆便利（2）λ噬菌體載體：一種可在體外包裝的細菌病毒，可高效感染大腸桿菌。基因組DNA呈線性，其兩端的5’末端帶有12個堿基的互補單鏈（粘性末端，cos位點）①噬菌體頭部合成基因,編碼A-F,W7種不同的蛋白質(左側)。②噬菌體的尾部合成基因,編碼10種不同的蛋白質基因(包括J)。③與λ噬菌體的整合、重組等有關的基因(中部)。④與λ噬菌體的表達調控有關的基因右半部分(包括N)。⑤其它與λ噬菌體的DNA合成有關的基因分類：插入型載體，有一位點供外源DNA插入,如凱倫(Charon-40)粒,切點位于－半乳糖苷酶基因內,長35kb,可容9.4~24.2kb,可供克隆小片段DNA和構建基因文庫取代型載體，中央部分有一個可被外源DNA取代的DNA片段，如GEM11/12,可容24kb,可供構建基因文庫（3）粘粒：是將質粒和λ噬菌體改建的一種載體，它含COS序列，插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌體的復制起點和cos末端。全長8kb。可包裝30-45kb長的DNA片段，多用于基因文庫構建。優點：.具有噬菌體的特性（cos位點）：被包裝后能高效轉化E.coli.具有質粒載體的特性：自主復制，帶有抗性標記，易于選擇陽性克隆.高容量的克隆能力：可載高達45kb外源DNA.因不含的基因，故不會裂解.便于定向克隆（4）YAC酵母人工染色體：含有酵母染色體端粒、著絲點及復制起點等功能序列，YAC是迄今容量最大的克隆載體，插入片段平均長度在200－1000Kb，最大可達2Mb主要缺點．存在高比例的嵌合體，即一個YAC克隆含有兩個本來不相連的獨立片段．部分克隆子不穩定，在轉代培養中可能會發生缺失或重排．難與酵母染色體區分開，因為YAC與酵母染色體具有相似的結構．操作時容易發生染色體機械切割.轉化效率低BAC細菌人工染色體：四個功能區：①與BAC復制和分裂有關的基因，parA，parB是分裂所必需的基因，parB與質粒的不相容性有關②復制起點及相關的元件，oriS是單向復制子；repE基因編碼oriS復制所必需的蛋白質Ｅ③抗生素標記基因，載體上攜帶的抗生素標記基因為氯霉素抗性基因，是載體的篩選標記用途：能攜帶約300kb的DNA片段；用于基因組文庫的構建；物理圖譜