合成生物系統(tǒng)Syntheticbiologysystems李琬生物物理教研室分子生物學(xué)館212liwan@教學(xué)大綱掌握：相關(guān)概念，基本路線，最小基因組和必需基因，重構(gòu)T7噬菌體了解：雙不對(duì)稱PCR，兩步合成完整基因法，遞歸PCR，裝配PCR，轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的重組，TBIO法與TBC法，聚合酶鏈組裝法，LCR與PCA的結(jié)合，應(yīng)用程序化微芯片精確合成基因，尺蠖延伸方法，多米諾克隆與BreT重獲，人工合成脊髓灰質(zhì)炎病毒，合成基因組控制的ΦX174噬菌體，重構(gòu)1918年西班牙流感病毒，人造基因組控制的活細(xì)胞生物模塊——生命體的設(shè)計(jì)與改造最小基因組——部件的功能實(shí)現(xiàn)合成基因組技術(shù)——技術(shù)支持從頭合成基因組合成簡(jiǎn)化的生物系統(tǒng)合成多細(xì)胞系統(tǒng)無細(xì)胞合成生物系統(tǒng)※△※△※※從頭合成（denovosynthesis）基因組合成基因獲得自然界中不存在的基因合成基因組制造一個(gè)由化學(xué)合成基因組控制的合成細(xì)胞。合成基因組學(xué)對(duì)目的基因進(jìn)行人工設(shè)計(jì)根據(jù)設(shè)計(jì)對(duì)基因組進(jìn)行合成、組裝及移植合成基因組策略自上而下大規(guī)模敲除微生物基因組序列自下而上從頭全合成及拼接成完整的基因組

相關(guān)概念基本路線方法※※相關(guān)概念從頭合成生物體內(nèi)用最原始的原料、最簡(jiǎn)單的前體物質(zhì)，消耗較多能量，逐步合成生物分子的途徑。※從頭合成基因以A、C、T、G四種堿基為原料，按照一定的目的要求，以一定的順序最終連接成具有一定長(zhǎng)度基因的過程。從頭合成基因組從頭合成個(gè)體或細(xì)胞所含的全套基因的過程。基本路線按照預(yù)先設(shè)計(jì)的DNA序列，以A、C、T、G四種堿基為原料，按照需要依次合成寡核苷酸；將寡核苷酸按一定的順序組裝成較短的DNA序列，對(duì)于基因長(zhǎng)度較短的序列（400～600bp），在這一步即可完成基因合成；※按一定的順序?qū)⒉煌墓押塑账徇B接成長(zhǎng)的DNA片段及長(zhǎng)基因序列（kb）；通過酶連接法或體內(nèi)重組，合成更長(zhǎng)的基因并組成基因組的長(zhǎng)片段（>10kb）；在大腸桿菌及酵母中依次組裝，最后達(dá)到超過1Mb的基因組；將合成的基因組移植到細(xì)胞中去，并使合成的基因組的基因按要求表達(dá)。合成基因和基因組的方法（1）雙不對(duì)稱PCR（2）兩步合成完整基因法（3）遞歸PCR（4）裝配PCR（5）轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的重組（6）TBIO法與TBC法（7）聚合酶鏈組裝法（8）LCR與PCA的結(jié)合（9）應(yīng)用程序化微芯片精確合成基因（10）尺蠖延伸方法（11）多米諾克隆與BreT重獲聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)一種用于放大擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈低溫（60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈（1）雙不對(duì)稱PCR(dualasymmetricPCR，DA-PCR)基本原理采用不等量的一對(duì)引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA。雙不對(duì)稱PCR就是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，同時(shí)應(yīng)用4個(gè)引物以化學(xué)方法合成長(zhǎng)度為17～100個(gè)堿基的4個(gè)相鄰的寡核苷酸，這4個(gè)寡核苷酸之間有15～17個(gè)堿基的重疊序列。在PCR過程中，這些寡核苷酸作為引物。在隨后的PCR擴(kuò)增中，這些雙不對(duì)稱擴(kuò)增的片段通過重疊序列，最終產(chǎn)生一個(gè)雙鏈全長(zhǎng)產(chǎn)物。（2）兩步合成完整基因法DA-PCR與OE-PCR（重疊延伸PCR，overlapextensionPCR）結(jié)合的方法。能有效降低成本，節(jié)約時(shí)間。靶DNA被分割成寡核苷酸25~50bp將每四個(gè)相鄰的寡核苷酸引物混合每個(gè)DA-PCR主要產(chǎn)物橫跨由四個(gè)寡核苷酸所覆蓋的整個(gè)序列，且與相鄰DA-PCR產(chǎn)物重疊達(dá)90bp。利用DA-PCR產(chǎn)物間有擴(kuò)增的部分重疊序列，可以有效地合成全基因產(chǎn)物。DA-PCR產(chǎn)物混合并純化（3）遞歸PCR（recursivePCR）一種合成完整基因的新方法。優(yōu)點(diǎn)相對(duì)于傳統(tǒng)方法，節(jié)約成本，并簡(jiǎn)化了基因的合成過程，而且有合成更大基因片段的潛力。化學(xué)合成的寡核苷酸僅代表每條鏈中的部分序列。將寡核苷酸混合并進(jìn)行PCR3’端重疊序列擴(kuò)展延長(zhǎng)產(chǎn)生了更長(zhǎng)的雙鏈基因產(chǎn)物重復(fù)以上過程直到獲得全長(zhǎng)基因產(chǎn)物（4）裝配PCR（assemblyPCR）由大量寡核苷酸一步合成一個(gè)基因及一個(gè)完整的質(zhì)粒的一種方法。優(yōu)點(diǎn)成本較低過程合成寡核苷酸基因裝配基因擴(kuò)增克隆56個(gè)寡核苷酸編碼啟動(dòng)子區(qū)和bla結(jié)構(gòu)基因的雙鏈，正負(fù)鏈均由28個(gè)寡核苷酸構(gòu)成。互補(bǔ)的寡核苷酸存在20nt重疊序列，所有寡核苷酸可以覆蓋雙鏈的全部序列。質(zhì)粒（5）轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的重組（transformation-associatedrecombination，TAR）特異性的克隆人類DNA的方法可用于克隆包含重復(fù)序列的大片段DNA端粒將制備的攜帶兩個(gè)遺傳標(biāo)記M1和M2的人類DNA的線性載體，直接轉(zhuǎn)移到酵母原生質(zhì)體中。人類DNA與載體上的重復(fù)序列間進(jìn)行TAR。（6）TBC法與TBIO法TBC：熱力學(xué)平衡法（thermodynamicallybalancedconventionalmethod）TBIO：熱力學(xué)平衡雙向延伸法（thermodynamicallybalancedinside-out）TBC基于PCR并優(yōu)化引物的基因合成方法。用TBC引物組合成四組連續(xù)的重疊雙鏈DNA片段PCR兩步合成全長(zhǎng)并擴(kuò)增的重疊DNA片段連續(xù)的重疊DNA片段的PCR裝配合成全長(zhǎng)DNA片段TBIO基于PCR的基因合成方法能夠合成具有高保真度的、較長(zhǎng)的基因序列首先合成中心片段再純化所合成的產(chǎn)物經(jīng)PCR一步合成全長(zhǎng)的內(nèi)部DNA片段用前5對(duì)引物合成起始內(nèi)部雙鏈DNA片段使用5對(duì)外部引物，由內(nèi)向外雙向延伸內(nèi)部起始片段經(jīng)PCR產(chǎn)生全長(zhǎng)DNA片段（7）聚合酶鏈組裝法(polymerasechainassembly，PCA)將覆蓋整個(gè)基因序列、有部分重疊的寡核苷酸通過退火、延伸變得更長(zhǎng)一些，然后再與其他寡核苷酸或延伸產(chǎn)物之間通過變性、退火及延伸的循環(huán)，最終得到全長(zhǎng)基因。（8）LCR與PCA的結(jié)合LCR：連接酶鏈反應(yīng)（ligasechainreaction）由一系列化學(xué)合成的寡核苷酸組合全長(zhǎng)基因組。合成噬菌體設(shè)計(jì)、合成、凝膠純化寡核苷酸在Taq連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)寡核苷酸的PCA過程PCR擴(kuò)增上步合成的DNA分子將合成的線性DNA分子轉(zhuǎn)換成具有感染性的環(huán)狀分子（9）應(yīng)用程序化微芯片精確合成基因（10）尺蠖延伸方法（inchwormelongation，IWe）克隆大型DNA在載體中克隆并延伸基因基本思路LPS：landingpadsequence，停泊位點(diǎn)序列LPA：LPSarray，2個(gè)依次排列并且方位正確的LPS。靶基因通過與LPS介導(dǎo)的同源重組克隆入載體中。先參照靶基因PCR合成2個(gè)小DNA側(cè)翼序列LPS，并整合在載體的克隆位點(diǎn)LPS以串聯(lián)形式與載體相連接產(chǎn)生一組LPA質(zhì)粒（11）多米諾克隆與BreT重獲（dominocloningandBacillusrecombinationaltransferretrieval）可以廣泛應(yīng)用于任何重組基因組設(shè)計(jì)。多米諾方法一系列的靶DNA片段（多米諾克隆）通過同源重組連接到載體中。當(dāng)按照目的順序排放這些多米諾克隆，并重復(fù)這種連接反應(yīng)時(shí)，會(huì)使原始DNA序列在載體中延長(zhǎng)。當(dāng)通過多米諾方法把完整靶基因都重組進(jìn)載體后進(jìn)行BreT重獲。BreT重獲將線性化的BreT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化帶有靶基因的細(xì)胞，通過同源重組，BreT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移發(fā)生，靶DNA以適合多種應(yīng)用的環(huán)狀質(zhì)粒形式重獲。方法引物原理產(chǎn)物DA-PCR4個(gè)不等量PCR全長(zhǎng)DA-PCR+OE-PCR4個(gè)一組PCR全長(zhǎng)遞歸PCR寡核苷酸PCR完整基因裝配PCR大量寡核苷酸PCR基因、完整質(zhì)粒TAR重組人類DNA，包含重復(fù)序列的大片段DNATBC4組PCR全長(zhǎng)TBIO內(nèi)部＋外部PCR高保真度、較長(zhǎng)基因序列PCA寡核苷酸全長(zhǎng)LCR+PCA寡核苷酸全長(zhǎng)微芯片PCRIwe重組大型DNABret重組任何基因組合成簡(jiǎn)化的生物系統(tǒng)最小基因組和必需基因人工合成脊髓灰質(zhì)炎病毒合成基因組控制的ΦX174噬菌體重構(gòu)T7噬菌體重構(gòu)1918年西班牙流感病毒人造基因組控制的活細(xì)胞※△載體細(xì)胞應(yīng)具有精簡(jiǎn)基因組，即最小基因組，從而最大限度地降低噪聲干擾，使得其他阻礙通路不能夠?qū)υO(shè)計(jì)的系統(tǒng)產(chǎn)生影響，減少了不希望出現(xiàn)的相互作用，提高對(duì)所設(shè)計(jì)系統(tǒng)的可控性和可操作性。最小基因組和必需基因（essentialgenes）※最小基因組在最適宜條件下維持細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所必需的最小數(shù)目的基因最少需要多少個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因才能支持一個(gè)完整的細(xì)菌作為特定功能的基因的載體被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞底盤中，最終構(gòu)建具有特定功能的最小人工細(xì)胞。細(xì)胞底盤（硬件）：包含代謝系統(tǒng)的容器或分隔的空間，其中不包括遺傳信息或基因組（軟件）。研究的核心確定基因?qū)τ诰S持系統(tǒng)正常生命活動(dòng)的必需性找到必需基因構(gòu)建策略：自上而下：以活細(xì)胞為基礎(chǔ)來檢驗(yàn)多少個(gè)基因被刪除之后仍能保持細(xì)胞的生存能力自下而上：對(duì)必需基因進(jìn)行重新設(shè)計(jì)、合成與組裝。必需基因維持生命體正常生命活動(dòng)所必需的基因。把基因組中的基因逐一剔除來鑒別該基因是否必需。14種細(xì)菌和6種真核生物基因組——近1萬個(gè)必需基因必需基因數(shù)據(jù)庫/必需基因的研究方法比較基因組學(xué)大規(guī)模基因失活實(shí)驗(yàn)基于代謝網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)方法基因組精簡(jiǎn)研究方法基于自殺質(zhì)粒的同源重組方法基于線性DNA的同源重組方法基于位點(diǎn)特異性重組酶的方法基于轉(zhuǎn)座子的方法大腸桿菌刪除了29.7%的基因后仍然能夠生存谷氨酸棒狀桿菌刪除188個(gè)非必需基因后存活是否存在相對(duì)于所有物種通用的最小基因組？在比較基因級(jí)學(xué)研究中，當(dāng)物種及其環(huán)境多樣性足夠大時(shí)，人們所獲得的最小基因組的基因數(shù)為0，即并不存在所有物種必需基因的交集。某些生命必需的功能，在不同物種中由非同源的基因所編碼，在序列上幾乎沒有相似性；在同一物種中也可能由多個(gè)基因發(fā)揮同一功能，其中一個(gè)基因的失活不能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，因此可能被誤認(rèn)為非必需基因。理論上，通用最小基因組概念的前提是所有生命起源于一個(gè)“最晚出現(xiàn)的共同祖先”，即所有遺傳信息起源于同一套基因組。然而，事實(shí)上是一個(gè)初始細(xì)胞群體，分別是古生菌、真細(xì)菌和真核生物的遺傳基礎(chǔ)。以必需基因的集合作為最小基因組，那么最小細(xì)胞只能在最優(yōu)條件下生存，而不能持續(xù)生存，尤其是當(dāng)環(huán)境條件有所波動(dòng)的情況下。人工合成脊髓灰質(zhì)炎病毒

（poliovirus）已知最簡(jiǎn)單的、可增殖的基因系統(tǒng)。單股正鏈RNA病毒病毒侵入細(xì)胞后，RNA在病毒蛋白、RNA依賴的聚合酶及其他相關(guān)蛋白的幫助下，轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈以此為模板合成新的病毒基因組。T7RNA聚合酶啟動(dòng)子在無細(xì)胞培養(yǎng)液中翻譯并復(fù)制，最終重新裝配成具有侵染能力的脊髓灰質(zhì)炎病毒。與病毒基因組RNA互補(bǔ)的cDNA合成基因組控制的ΦX174噬菌體自然界的ΦX174的基因序列共有5386個(gè)堿基對(duì)、11個(gè)基因LCR與PCA相結(jié)合的方法設(shè)計(jì)并化學(xué)合成寡核苷酸利用LCR與PCA相結(jié)合的方法，使核苷酸精確合成5～6kb的DNA片段將合成的基因組DNA注入宿主細(xì)胞雖然試驗(yàn)僅涉及簡(jiǎn)單的生物系統(tǒng)的合成，但該項(xiàng)成果提供了快速且精準(zhǔn)合成較長(zhǎng)DNA的能力，為操作較復(fù)雜生命體奠定了基礎(chǔ)。重構(gòu)T7噬菌體專一的感染大腸桿菌的溶解性噬菌體T7噬菌體侵染的計(jì)算機(jī)量化仿真模型計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)結(jié)果嚴(yán)重失配△模塊化改造不改變基因組外部功能改善內(nèi)部結(jié)構(gòu)、質(zhì)量和性能去除基因的重疊性和多效性重構(gòu)后的T7噬菌體被命名為T7.1噬菌體。重新注釋野生型噬菌體T7基因組確定功能片段的邊界：開放閱讀框、操縱元件等。限制性酶切位點(diǎn)藍(lán)色：編碼區(qū)域紫色：RBS粉色：RNaseIII識(shí)別位點(diǎn)黃色：轉(zhuǎn)錄終止子灰色：其他將含有39977個(gè)堿基對(duì)的T7噬菌體基因組劃分為73個(gè)單元每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)元件這73個(gè)單元的邊界和區(qū)域內(nèi)部均不能出現(xiàn)編碼重疊。基因3的RBS與基因2.8有部分重疊復(fù)制重疊部分，用編號(hào)為28和29的基因元件將其分開大寫字母為被替換堿基，替換后的基因序列并未改變?cè)摶虮磉_(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。重新注釋野生型噬菌體T7基因組確定功能片段的邊界：開放閱讀框、操縱元件等。元件序列之間不重復(fù)；各個(gè)元件只編碼自己的序列，不具有其他的功能；每個(gè)元件可以獨(dú)立和準(zhǔn)確地操作；能夠指導(dǎo)新的噬菌體存活。GenomeCalligrapher:AWebToolforRefactoringBacterialGenomeSequencesfordeNovoDNASynthesis重構(gòu)1918年西班牙流感病毒構(gòu)建含有西班牙流感病毒株所有8個(gè)基因的重構(gòu)病毒埋葬的流感死者肺組織——5個(gè)基因全基因組分析——3個(gè)基因應(yīng)用反射遺傳學(xué)方法及技術(shù)重構(gòu)病毒注入細(xì)菌組合完整病毒基因組將病毒基因組注入人或動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)，生成病毒蛋白質(zhì)人造基因組控制的活細(xì)胞支原體是目前發(fā)現(xiàn)的最小、最簡(jiǎn)單的具有自我繁殖能力的細(xì)胞，其基因組也是原核生物中最小的，因此支原體成為合成生物學(xué)研究的較佳對(duì)象。將合成的基因組進(jìn)行甲基化修飾將構(gòu)建好的人工合成基因組移植入受體細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞經(jīng)過不斷分裂傳代，具有人造基因組的細(xì)胞在培養(yǎng)基中篩選出來，含有天然DNA的細(xì)胞的逐漸消失，最終只剩下由合成DNA控制的人工嵌合體細(xì)胞。合成細(xì)胞即使受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)并不是合成的，因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)表型被蛋白質(zhì)和攜帶的合成基因組所稀釋，構(gòu)建的由化學(xué)方法合成的DNA片段裝配的基因組控制的細(xì)胞也可以稱為合成細(xì)胞。在之后復(fù)制形成克隆，其后代將不會(huì)帶有任何的原始受體細(xì)胞的蛋白質(zhì)分子。嵌合基因組細(xì)胞重組有活性的蝙蝠嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（severeacuterespiratorysyndrome，SARS）樣冠狀病毒轉(zhuǎn)化生殖支原體教學(xué)大綱掌握：細(xì)胞群體系統(tǒng)脈沖發(fā)生器，利用邏輯運(yùn)算構(gòu)建多細(xì)胞工程網(wǎng)絡(luò)模塊，環(huán)境治理，大腸桿菌成像系統(tǒng)了解：群體感應(yīng)，程序化圖案生成系統(tǒng)，維護(hù)健康合成多細(xì)胞系統(tǒng)（multicellularsystem）單個(gè)細(xì)胞——其它細(xì)胞的作用多細(xì)胞協(xié)同運(yùn)作多細(xì)胞生命體

基礎(chǔ)研究應(yīng)用△※△※基礎(chǔ)研究（1）群體感應(yīng)（2）細(xì)胞群體系統(tǒng)脈沖發(fā)生器（3）人工多細(xì)胞系統(tǒng)程序化圖案生成系統(tǒng)（4）利用分配運(yùn)算構(gòu)建多細(xì)胞工程網(wǎng)絡(luò)模塊△※（1）群體感應(yīng)（quorumsensing，QS）細(xì)胞濃度達(dá)到一定閾值后，細(xì)胞的基因表達(dá)情況受細(xì)胞密度調(diào)控的機(jī)制。是多細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)展的早期調(diào)控步驟之一。細(xì)胞群體受群體感應(yīng)現(xiàn)象的制約。用于系統(tǒng)群體細(xì)胞之間的同步響應(yīng)通過小分子的擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞群體間的通訊與協(xié)作在控制細(xì)菌致病性中起重要作用將費(fèi)氏弧菌中響應(yīng)群體感應(yīng)的基因分別植入兩種獨(dú)立的細(xì)胞中。發(fā)生細(xì)胞接受細(xì)胞人工調(diào)控細(xì)胞群體濃度利用信號(hào)感應(yīng)系統(tǒng)控制細(xì)胞凋亡來調(diào)控細(xì)胞群體濃度的基因線路。（2）控制群體數(shù)量（populationcontrol）的功能基因線路細(xì)胞增長(zhǎng)細(xì)胞凋亡（apoptosis）信號(hào)分子當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到或超過閾值后，LuxR與AHL結(jié)合，并啟動(dòng)啟動(dòng)子PluxI融合基因檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)量引起細(xì)胞凋亡細(xì)胞密度此環(huán)境下可能達(dá)到的最大細(xì)胞密度CcdB蛋白的濃度細(xì)胞生長(zhǎng)速率常數(shù)細(xì)胞死亡速率常數(shù)信號(hào)分子AHL的濃度CcdB生成速率常數(shù)CcdB降解速率常數(shù)AHL生成速率常數(shù)AHL降解速率常數(shù)細(xì)胞自然生長(zhǎng)的logistic模型細(xì)胞凋亡的速率

穩(wěn)定狀態(tài)下Quorum-sensingcrosstalk-drivensyntheticcircuitsfromunimodalitytotrimodality細(xì)胞群體系統(tǒng)脈沖發(fā)生器（pulser）脈沖對(duì)于連續(xù)信號(hào)在整個(gè)信號(hào)周期內(nèi)短時(shí)間發(fā)生的信號(hào)，大部分信號(hào)周期內(nèi)沒有信號(hào)。像人的脈搏一樣。在短時(shí)間內(nèi)突變，隨后又迅速返回其初始值的物理量。△細(xì)胞群體系統(tǒng)脈沖發(fā)生器依據(jù)遺傳線路對(duì)信號(hào)濃度隨時(shí)間變化的響應(yīng)構(gòu)建的一種包含脈沖信號(hào)的合成細(xì)胞群體系統(tǒng)。含有具有前饋調(diào)節(jié)能力的脈沖發(fā)生器遺傳線路沒有細(xì)胞間的通訊和交流脈沖發(fā)生細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答，表達(dá)GFP和CI持續(xù)傳播的AHL信號(hào)導(dǎo)致CI濃度超過臨界值，對(duì)GFP的表達(dá)產(chǎn)生抑制發(fā)生器細(xì)胞隨著GFP的降解，熒光消失發(fā)生器細(xì)胞向脈沖發(fā)生細(xì)胞發(fā)出AHL信號(hào)aTc不同AHL濃度不同AHL增長(zhǎng)速度脈沖的最大振幅和時(shí)間不僅依賴于誘導(dǎo)物的最終濃度，還與誘導(dǎo)物的濃度增長(zhǎng)速率有關(guān)。（3）人工多細(xì)胞系統(tǒng)程序化圖案生成系統(tǒng)距離近，過高濃度的AHL過表達(dá)CI蛋白和LacIM1蛋白，LacIM1蛋白抑制熒光蛋白的啟動(dòng)子距離適當(dāng)，適量的AHL引起適量的CI蛋白和LacIM1蛋白的表達(dá)。CI對(duì)下游啟動(dòng)子的抑制作用使lacI基本不表達(dá)，LacIM1基因表達(dá)的量不足以抑制下游熒光蛋白的啟動(dòng)子距離遠(yuǎn)，過少的AHL無法開啟足量的CI蛋白和LacIm1蛋白，無法抑制下游基因，使lacI基因表達(dá)，產(chǎn)生的LacI蛋白抑制熒光蛋白的表達(dá)利用邏輯運(yùn)算構(gòu)建多細(xì)胞工程網(wǎng)絡(luò)模塊類似于邏輯門等單細(xì)胞遺傳線路，細(xì)胞群體系統(tǒng)及多細(xì)胞系統(tǒng)的交流、通訊及功能執(zhí)行，也可通過使用邏輯運(yùn)算設(shè)計(jì)工程化模塊加以實(shí)現(xiàn)。※NOTIDENTITYANDNANDORNORimplies:(!x)||yN-IMPLIES外源輸入其他信號(hào)分子可擴(kuò)散的輸入分子輸入信號(hào)引發(fā)產(chǎn)物生成的信號(hào)具有抑制作用的信號(hào)輸出產(chǎn)物擴(kuò)散性的信號(hào)分子目標(biāo)產(chǎn)物脫氧土霉素NOT報(bào)告細(xì)胞，用來在活性菌體實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行定量分析工程復(fù)合線路應(yīng)用（1）環(huán)境治理：砷離子的檢測(cè)（2）維護(hù)健康：癌癥治療（3）大腸桿菌成像系統(tǒng)△※（1）環(huán)境治理：砷離子的檢測(cè)水質(zhì)的檢測(cè)氫化物原子吸收光譜法有針對(duì)性的檢驗(yàn)砷的方法Gutzeit砷檢測(cè)法這些方法普遍存在分析時(shí)間長(zhǎng)、誤差大、費(fèi)用昂貴、不易維護(hù)等缺點(diǎn)。最重要的是，檢測(cè)的靈敏度過低。以微生物作為監(jiān)測(cè)器，利用pH的變化作為砷離子存在與否的信號(hào)，以檢測(cè)水中的砷含量。該方法不僅具有成本低的優(yōu)點(diǎn)，并且檢測(cè)靈敏度較高。環(huán)境中只有乳糖而無砷離子時(shí)乳糖與LacI結(jié)合，解除其對(duì)啟動(dòng)子4的抑制啟動(dòng)子4啟動(dòng)尿素酶基因表達(dá)產(chǎn)生尿素酶，催化尿素轉(zhuǎn)化為氨和二氧化碳，堿性增加環(huán)境中砷濃度較低時(shí)砷離子與ArsR結(jié)合，解除對(duì)啟動(dòng)子2的抑制λcI表達(dá)，產(chǎn)生CI蛋白抑制啟動(dòng)子4，關(guān)閉尿素酶基因的表達(dá)，沒有酸或堿的產(chǎn)生環(huán)境中砷離子濃度較高時(shí)解除對(duì)啟動(dòng)子1的抑制lacZ編碼的β-半乳糖苷酶催化乳糖發(fā)酵，分解為乙酸和乳糖酸，酸性增加砷離子與ArsD結(jié)合（2）維護(hù)健康：癌癥治療通過分別取自假結(jié)核菌的inv基因和五鯢的lux操縱系統(tǒng)、fdhF啟動(dòng)子和阿拉伯糖操縱子融合，構(gòu)建了pAC-LuxInv質(zhì)粒，使大腸桿菌細(xì)胞能選擇性地在高細(xì)胞密度、低氧微環(huán)境和化學(xué)誘導(dǎo)后具有入侵腫瘤的能力。如果在入侵之后能利用可執(zhí)行方案調(diào)節(jié)好大腸桿菌與人類細(xì)胞的相互協(xié)調(diào)關(guān)系，不引起免疫反應(yīng)等不良后果，并且使大腸桿菌具有釋放或者催化合成某種可殺死癌細(xì)胞的物質(zhì)，那么靶向治療癌癥、引起最小的副作用將成為可能。（3）大腸桿菌成像系統(tǒng)一個(gè)細(xì)菌系統(tǒng)，包括感光和顯影兩大子系統(tǒng)，可以由紅光觸發(fā)該系統(tǒng)在不同狀態(tài)之間開關(guān)。當(dāng)接收一類光投射到菌體后，可產(chǎn)生高清晰度的二位化學(xué)圖像。教學(xué)大綱掌握：無細(xì)胞合成生物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)合成的機(jī)制和優(yōu)越性了解：原核表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)，高通量篩選和功能蛋白質(zhì)組學(xué)，蛋白質(zhì)進(jìn)化，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行特殊標(biāo)記無細(xì)胞（cell-free）合成生物系統(tǒng)蛋白質(zhì)生物合成——核糖體tRNA、蛋白質(zhì)折疊加工必需的酶和各種相關(guān)因子——各種細(xì)胞的裂解液RNA模板、氨基酸和能量——提供外源其他的細(xì)胞結(jié)構(gòu)——無需無細(xì)胞合成系統(tǒng)是一種以外源mRNA或DNA為模板，利用細(xì)胞抽提物的酶系，通過添加氨基酸、T7RNA聚合酶和能量物質(zhì)等來表達(dá)蛋白