放射免疫分析技術摘要RIA是一種微量分析法,就是利用放射性核素標記抗原或抗體,然后與被測的抗體或抗原結合,形成抗原抗體復合物的原理來進行分析的。它兼有放射性同位素的靈敏性和抗原、抗體反應的特異性兩大特點。該法還具有準確性高和精密度好,便于標準化以及操作簡便、經濟等優點。由于RIA具有靈敏度高，特異性強，測量簡單，成本低等優點，RIA在應用方面具有一定的生命力。但是，又因為它最致命的弱點就是使用放射性核素，此外標記物有效使用時間短，難以實現操作和測量的自動化等，它的進一步發展受到一些局限。現在免疫分析技術都在朝著非同位素標記免疫分析的方向發展，自動化儀器已經投入到臨床常規項目的檢測中，使得傳統的RIA使用市場逐漸縮小。不過第五代RIA技術的出現，使得現在的RIA技術較其他方法在方法學有了更多的優勢，尤其是納米磁性固相的應用，為RIA自動化的研制提供了很大幫助。此外，在生命科學的實驗領域，非放射標記免疫技術始終不能代替RIA。關鍵字RIAIRIA基本原理第五代RIA技術1959年，美國科學家Berson和Yalow將放射性同位素測量的高靈敏度與抗原抗體的高特異性巧妙地結合起來，創立了放射免疫分析(radioimmuoassay，RIA)技術。RIA經過半個多世紀的發展，可以分析成百上千種物質，包括激素、維生素、腫瘤相關抗原、抗體、藥物、病毒等。使那些曾認為無法檢測的微量而又具有重要生物活性的物質得以精確定量，為醫學、生命科學的發展做出劃時代的貢獻。因此，1977年Yalow榮獲諾貝爾生理學或醫學獎。隨后，各國學者發展了酶免疫分析(EIA)、熒光(FIA)、時間分辨熒光(TRFIA)和化學發光(CLIA)等非同位素標記免疫分析技術。1.RIA基本原理放射免疫分析法的本質是一種分子相同的被側物質和同位素標記物質,同另一種濃度有限的特異性結合試劑進行的競爭性結合。當同位素標記化合物和特異性結合試劑的量保持一定時,加入的被側物或標準物的量與標記物的量之和多于特異性結合試劑有效結合的數目時,被測物或標準物與標記物一特異性結合試劑復合物之間就呈現一種函數關系。即被測物的量越多,則標記物的被稀釋程度也就越大,使標記物一特異性結合試劑復合物的量逐漸減少,放射性強度側定就越低。根據這種原理來對生物體內的微量物質進行定量測定。以標記化合物為P*.,非標記化合物為P,特異性結合試劑為Q,其反應式構成了放射免疫分析法的理論基礎(圖1)。為了進一步闡明放射免疫分析法的原理,我們再用圖2名加以說明。圖2為我們提供簡單的量的概念,圖名中黑圓點代表標記抗原,空白圓點代表非標記抗原,雙凹型符號代表抗體,A、B、C、D分別代表四種不同濃度的非標記抗原。基于標記抗原和非標記抗原的理化性質相同,與抗體具有相同的結合力,所以隨著非標記抗原含量的增加,標記抗原和抗體相結合的能力所受到的競爭抑制就越大,因而B/F或B/B+F的比值相應愈小,呈相反的關系。圖2放射免疫分析原理示意圖因為標記抗原對抗體的結合被未標記抗原的競爭結合所抑制,于是產生一條抑制曲線相抗體和標記抗體同時反應,生成夾心狀的抗體-抗原-抗體復合物,然后去除游離的標記抗體,測固相抗體-抗原-標記抗體復合物的放射性計數。2.放射免疫技術發展雖然RIA具有靈敏度高，特異性強，測量簡單，成本低等優點，但是它最致命的弱點就是使用放射性核素，此外標記物有效使用時間短，難以實現操作和測量的自動化等，它的進一步發展受到一些局限。早在1983年，Witherpoon就在《免疫分析--將來核醫學的地位會存在嗎》就談到了關于放射免疫技術的未來的發展方向，很有可能是被其他先進的自動化技術所取代。事實證明，現在免疫分析技術都在朝著非同位素標記免疫分析的方向發展，自動化儀器已經投入到臨床常規項目的檢測中，使得傳統的RIA使用市場逐漸縮小。但是，RIA和其它放射示蹤技術仍處在不斷更新換代發展階段。特別是第五代RIA技術的出現，使得現在的RIA技術較其他方法在方法學有了更多的優勢，尤其是納米磁性固相的應用，為RIA自動化的研制提供了很大幫助。此外，在生命科學的實驗領域，非放射標記免疫技術始終不能代替RIA。據李振甲等人的總結，RIA技術從開創至今，按照技術的進步大可劃分為五代。第一代(1959～1964年)RIA技術及競爭結合蛋白分析法(CPBA)開創。第二代(1965～1970年)眾多學者對RIA技術進行了大量實驗研究，將RIA和CPBA技術推進到了臨床實用水平。1968年建立了利用核素標記的抗體檢測抗原的放射分析法(IRMA)。第三代(1971～1980年)RIA技術廣泛的用于小分子化合物的檢測。第四代(1981～1995年)小鼠抗綿羊紅細胞的單克隆抗體(McAb)的出現為RIA提供了新型特異性抗體，使得放射免疫技術靈敏度、特異性提高。第五代RIA技術,是目前正在研發并使用的，它是以磁性微粒子與RIA或IRMA相結合為特點的。磁性微粒子直徑小、表面連有活性基團等特性，使其在包被均一性、反應活性等方面都要優于經典的分析方法。3放射免疫技術的最新進展第五代RIA技術出現后，相應的出現了許多不同的的方法。3.1雙標記液相IRMA技術它是五代RIA技術中最具推廣意義的。主要特征是將兩株高特異性單克隆抗體(McAb)分別標記125I和異硫氰酸熒光素(FITC)共同作為標記試劑，待測樣品在液相中生成雙標記夾心免疫復合物，以抗FITC磁性微粒子固相作為分離劑。實驗結果表明：(1)雙標記液相IRMA比普通的IRMA節省了時間。(2)對于中小化合物，雙標記液相IRMA法的靈敏度明顯高于酶免疫法和化學發光法。(3)檢測量程寬，特異性強，適宜大量樣本檢測。3.2磁性微粒子二抗分離法和磁性微粒子固相一抗法其原理都是以磁性微粒子代替了原來的PR分離劑，免疫反應和分離時間都有不同程度的縮短。兩種方法分析結果存在一定的系統誤差，由于兩種方法本身的差異以及檢測時不可避免的環境因素影響，但此誤差并不影響實際樣品的檢測及臨床診斷。4.放射免疫技術的應用4.1激素類檢測：(1)在垂體性腺激素：卵泡刺激素(FSH)，黃體生成激素(LH)，睪丸酮(T)，雌二醇(E2)，孕酮(P)，催乳素(PRL)，人生長激素(HGH)，人絨毛膜促性腺激素(HCG)，人胎盤催乳素(HPL)等。(2)甲狀腺腺激素。4.2腫瘤類檢測：甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，糖蛋白抗原(CA19-9)，糖蛋白抗原(CA-125，CA15-3)，β2微球蛋白(β2-MG),鐵蛋白放射免疫分析(SF)，前列腺特意抗原(PSA)。4.3放射受體分析：受體是存在于細胞表面、胞漿或細胞核內的生物活性物質，其功能是和細胞外的信息分子(配體)特異性結合，將信息轉變為生物效應。放射受體分析(radioreceptorassay，RRA)或受體的放射配體結合分析(radioligandbindingassay，RBA)是建立在放射性標記配體與受體之間的結合反應，它是目前對受體分子進行定量和定位分析研究的靈敏、可靠的一項技術。臨床上最常見的就是TRAb放射受體分析，血清中TRAb對甲亢與甲減的病因診斷有重要的意義。此外，在生物設計、藥物作用機理、生物效應及疾病的病因探討、診斷和治療等方面的應用已有較大發展。參考文獻常新劍,任俊宏.放射免疫分析法原理及操作注意事項.JPMT.2006,13(12):2172-2173鄭柳.放射免疫檢測技術面臨的現狀與前景.Cont