生物芯片技術及其發展第1頁生物芯片定義生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上高密度DNA、抗原、抗體、細胞或組織微點陣(microarray）。生物芯片包含DNA芯片、抗原芯片、抗體芯片、細胞芯片、組織芯片等。1998年世界十大科技突破之一。未來十年最具發展潛力技術。第2頁特點高度并行性：提升試驗進程、利于顯示圖譜快速對照和閱讀。多樣性：可進行樣品多方面分析，提升準確性，降低誤差。微型化：降低試劑用量和反應液體積，提升樣品濃度和反應速率。自動化：降低成本，確保質量。第3頁生物芯片分類還未統一。廣義上：矩陣型芯片、處理型芯片固化材料：基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片、組織芯片第4頁研究歷史1991Affymatrix企業StephenFodor:光刻與光化學技術、多肽和寡聚核苷酸微陣列。DNAChip概念Stanford大學Brown試驗室：預先合成，機械手陣列1995Schena等：基因表示譜1996Cheeetal：DNA測序1996Croninetal：突變檢測1996Sapolsley&Lipshutz：基因圖克隆1996Shalonetal：復雜DNA樣本分析1996Shoemakeretal：缺省突變定量表型分析第5頁分類（依據應用）基因變異檢測芯片疾病檢測(如HIV、P53基因、結核桿菌)法醫判定(如DNA指紋圖譜)表示譜芯片腫瘤相關基因(正常與腫瘤組織表示差異)藥品篩選(培養細胞藥品刺激前后表示差異)發育(同一組織不一樣發育時期基因表示差異)組織發生(不一樣組織或器官基因表示差異)第6頁分類（依據工藝和載體）原位合成法：密集程度高，可合成任意序列寡聚核苷酸，但特異性較差，寡聚核苷酸合成長度有限，且隨長度增加，合成錯誤率增高。成本較高，設計和制造較煩瑣費時。DNA微矩陣法：成本低，易操作，點樣密度通常能滿足需要。芯片載體需表面緊質、光滑固體，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩陣芯片慣用玻片為載體。第7頁分類（依據DNA成份）寡聚核苷酸或DNA片段：約2025個核苷酸堿基，慣用于基因類型分析，如突變、正常變異（多態性）。全部或部分cDNA：約5005000個核苷酸堿基，通慣用于兩種或以上樣本相關基因表示分析。第8頁基因芯片種類ScienceChip：生物分析和診療。NutriChip：食物分析、轉基因、污染檢測。LeukoChip：血液分析、病毒分析、HLA分析。AquaChip：水質分析。SecureChip：含DNA物質判定。ChromoChip：基因分析和染色體序列。ProkaryoChip：原核生物、獸醫、環境保護等。第9頁生物芯片技術主要步驟芯片制備：微點陣樣本制備：DNA提純、擴增、標識雜交：樣本與互補模板形成雙鏈檢測：共聚焦掃描，雙色激光數據處理：定量軟件，數據庫檢索，RNA印跡等。結果

第10頁生物芯片分析1、測定過程應包含五個基本步驟：需處理生物學問題樣本制備生物化學反應檢測數據分析第11頁2、生物學系統控制必須準確地與檢測目標相匹配。

3、生物學樣本必須準確地與生物學種類相匹配。

4、全部基因分析必須平行處理。

5、基因分析技術必須適合微型化和自動化。

6、平行格式必須準確依據生物學樣本次序。

7、檢測系統必須能準確地取得數據。

8、檢測系統取得數據必須能被準確地控制和重復。第12頁9、兩種或以上平行數據組比較應受到單

個試驗所固有特征限制。

10、絕對百分比關系只存在于組合試驗平

行數據組內。

11、平行格式包含內在和外部整個系統

誤差分析原因。

12、在每個系統模塊中采集到該系統全部

變量四維數據時，才能稱為完成生

物系統平行基因分析。

第13頁生物芯片技術12條標準只是一個基本框架。其術語詳細定義和相關理論可參見

/~schena/

/第14頁芯片制備原位合成法（insitusynthesis):又可分為原位光控合成法和原位標準試劑合成法。適合用于寡核苷酸，使用光引導化學原位合成技術。是當前制造高密度寡核苷酸最為成功方法。合成后交聯（post-syntheticattachment):利用手工或自動點樣裝置將預先制備好寡核苷酸或cDNA樣品點在經特殊處理過玻片或其它材料上。主要用于診療、檢測病原體及其它特殊要求中、低密度芯片制備。第15頁兩種制備方法比較原位合成：測序、查明點突變高密度、依據已知DNA編制程序制作復雜、價格昂貴、不能測定未知DNA序列合成后交聯：比較分析制備方式直接和簡單，點樣樣品可事先純化，交聯方式多樣，可設計和制備符合自己需要芯片。中、低密度，樣品浪費較多且制備前需儲存大量樣品。第16頁雜交是芯片技術中除方陣構建外最主要一步液相中探針與DNA片段按堿基配對規則形成雙鏈反應。選擇雜交條件時，必須滿足檢測時靈敏度和特異性。使能檢測到低豐度基因，且能確保每條探針都能與互補模板雜交。適當長度DNA有利于與探針雜交。溫度、非特異性本底等均會影響雜交結果。最好在封閉循環條件下雜交，雜交爐。第17頁樣本制備制備高質量樣本是困難但又是極其主要。制備細胞、組織或整個器官樣本應尤其小心。溫度、激素和營養環境、遺傳背景、組織成份等輕微改變都會使基因表示結果發生顯著改變。用于基因類型分析樣本是DNA，用于表示研究樣本是cDNA。樣本制備后應進行標識，通常為酶標識、熒光標識和核素標識。第18頁結果分析

芯片與標識靶DNA或RNA雜交后，或與標識靶抗原或抗體結合后，可采取以下方法分析處理數據：共聚焦掃描儀：應用最廣，重復性好但靈敏度較低。質譜法：快速、準確，可準確判斷是否存在基因突變和準確判斷突變基因序列位置。探針合成較復雜。化學發光、光導纖維、二極管方陣檢測、直接電荷改變檢測等。第19頁芯片掃讀裝置依據采取光電偶合器件，分為光電倍增管型和CCD型。依據激光光源，可分為激光型和非激光型。應用最為廣泛是激光光源共聚焦掃描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好定位功效，可定量，應用廣泛。第20頁圖象分析復雜雜交圖譜普通需由圖象分析軟件來完成。分析軟件功效：判定每個點陣、最大程度消除本底熒光干擾、解析各種顏色圖象、可標識或排除假陽性、識別和分析對照試驗是否成功、可將信號標準化等。圖象處理軟件必須具備提取基因庫和數據庫能力。第21頁質量控制試驗對照：體外轉錄從cDNA合成mRNA，參入標本中作為對照。此mRNA不與點陣核酸雜交。將不一樣濃度不一樣基因參入標本中，可作為標本間標準化參考。用兩種不一樣吸收光譜熒光素同時分析兩個標本，假如兩種熒光強度一致，可排除標本間變異原因。用單一堿基錯配寡核苷酸做對照可排除交叉雜交。

第22頁結果有效性證實在表示矩陣上，有時難于區分極其相同序列，如基因族組員，亞類或異類存在。比較兩種不一樣DNA序列表示水平時，有些參數如核苷酸成份、二級結構存在和矩陣上DNA長度都會影響雜交。證實矩陣分析結果可用RT-PCR(區分基因族組員,比較不一樣DNA種系表示,證實基因變異或突變和準確測定DNA表示水平)、NorthernBlot(證實某一基因相對表示水平)、WesternBlot(RNA表示是否到達細胞中蛋白水平)、質譜儀(證實矩陣結果是否在蛋白水平)等。第23頁生物芯片技術應用基因表示分析：腫瘤基因突變檢測：遺傳性疾病測序、基因圖繪制和多態性分析：測序微生物菌種判定：毒力基因、抗藥基因藥品研究：新藥篩選、指導合理用藥克隆選擇及文庫篩選第24頁生物芯片技術發展發展趨勢微型化：DNA矩陣越來越小。集成化：矩陣上基因組越來越大。多樣化：測定范圍越來越廣。微量化：測定所需樣本越來越少。全自動化：樣品制備到結果顯示全部分析過程。定量化：如激光捕捉技術，顯微解剖技術等可準確測定一個細胞內一個基因表示。DNA矩陣數據信息庫完善。第25頁生物芯片技術發展技術毛細管電泳芯片技術PCR芯片技術(PCR-Chip)縮微芯片試驗室(lab-on-a-chip)微珠芯片技術(beadArray)抗體和蛋白質陣列技術(Antibodyandprotein-arraytechnology)自我定制芯片技術（makeyourownchip)血氣分析芯片第26頁毛細管電泳芯片技術Mathies最早報道毛細管電泳芯片測序結果，在10分鐘內完成了對433個堿基序列測定。賓夕法尼亞大學Wilding等成功地利用毛細管電泳芯片分離了用于診療杜鑫-貝克肌萎縮多條DNA片段。瑞士Ciba-Geigy企業和加拿大Alberta大學合作利用玻璃毛細管電泳芯片完成了對寡核苷酸分離。第27頁縮微芯片試驗室在一張芯片上完成樣品(如血液、組織等)制備、化學反應、檢測和數據分析。1998年程京博士首次應用LOC實現了從樣品制備到反應結果顯示全部過程，結果地從混有大腸桿菌血清中分離出了細菌。含有加熱器、微泵微閥、微流量控制器、電子化學和電子發光探測器芯片已經問世。也已出現樣品制備、化學反應和分析檢測部分結合芯片。LOC與衛星傳輸和網絡生物信息學結合，將實現高通量、一體化和移動性“未來型掌上試驗室”構想。第28頁抗體和蛋白質陣列技術蛋白質組學(protiomics)興起，促進了抗體和蛋白質陣列技術發展。PareickBrown使用特異性抗體微矩陣，測定了細胞和體液樣本中數千種不一樣蛋白質。Leuking等采取蛋白質微陣列技術，測定了10pg微量蛋白質，并證實假陽性極低。第29頁乳腺癌基因芯片第30頁Stanford乳腺癌微矩陣(Perouetal.1999)每種基因數據以行表示，每個試驗用列表示。顏色強度表示對照和試驗cDNA比率。比率相同時為1。結果為紅色表示mRNA增加，綠色表示降低，灰白色表示缺乏。兩種基因相同性用Pearson相關公式或Euclidian測距公式計算。第31頁DNA微矩陣分析軟組織肉瘤表示

KavineMaillardetal(1999)cDNAs進行DNA表示矩陣，PCR產物包被在經賴氨酸處理玻片上，用Cys3-和Cys5-標識cDNA進行雜交，洗滌后用Scanarray3000掃描儀測定矩陣，表示數據儲存在ACeDB數據庫中，依據數據表示類型區分不一樣基因。第32頁微矩陣分析DNA和蛋白表示

HolgerEickhoffetal.(1999)依據已經有序列數據，組合800000人類EST序列，已重矩陣了38000克隆用于RNA表示分析，克隆經PCR擴增后共價結合于玻片上，每張玻片固定19200個基因片段，標識人組織RNAs與被選38000人基因片段矩陣進行雜交，比較健康與疾病組織圖象，用軟件分析點識別和點定量。使用寡聚核苷酸判定新cDNA克隆，和進入表示載體，使對應蛋白能直接表示，矩陣后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA關系。第33頁生物芯片相關儀器點陣儀：制備芯片。點樣針分為實心和空心兩種，點樣方式有非接觸噴點和接觸點樣兩種。雜交儀：全自動完成調整、加探針、漂洗和熱循環雜交過程。掃描儀：激光共聚焦或CCD直接成像分析結果。第34頁微矩陣儀器介紹QBotQPixQArrayQPetQSoft第35頁第36頁QBot超高解析基因篩選暨排列分析儀。基因菌落篩選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(Gridding)：100000/h基因復制(Replication)：96

96,96

384基因重新排列(Re-Arraying)：正確基因置復制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：0/片全自動液體分注系統(LiquidHandling):96針，注液量1200l，適合PCR產物。分析軟件：分析、質控、上網。環境控制：紫外線照射、空氣濾網、陽極處理鋁板第37頁第38頁QPix半敞開式基因篩選暨排列分析儀(經濟型)基因菌落篩選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(Gridding)：100000/h基因復制(Replication)：96

96,96

384基因重新排列(Re-Arraying)：正確基因置復制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：0/片分析軟件：分析、質控、上網環境控制：紫