GB/TXXXXX—XXXX

酶聯(lián)免疫試劑盒檢測通則

1范圍

本文件描述了酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測一般要求和檢測過程。

本文件適用于酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T4889數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋正態(tài)分布均值和方差的估計(jì)與檢驗(yàn)

GB/T27404實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4一般要求

產(chǎn)品

酶聯(lián)免疫試劑盒應(yīng)附產(chǎn)品說明書，或等同的指導(dǎo)性文件。

實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室的生物安全管理應(yīng)符合GB19489中的相應(yīng)要求。

檢測人員

檢測人員應(yīng)熟悉相關(guān)法律法規(guī)、檢測方法原理，掌握質(zhì)量檢測操作規(guī)范、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量管理和實(shí)

驗(yàn)安全等專業(yè)知識(shí)和技能。

檢測指標(biāo)

標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、靈敏度、精密度、正確度和特異性。

5檢測過程

檢測樣品的選擇及制備

1

GB/TXXXXX—XXXX

5.1.1陰性樣品與待分析樣品應(yīng)來源于同一物種，并具有相似的結(jié)構(gòu)特性，包括不含有或方法學(xué)未能

檢出目標(biāo)分析物的樣品，以及含有或添加其他與目標(biāo)分析物結(jié)果類似物質(zhì)（易產(chǎn)生交叉反應(yīng)）的樣品，

按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的步驟進(jìn)行前處理。

5.1.2陽性樣品是指含有目標(biāo)分析物的待測樣品，按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的步驟進(jìn)行前處理。

5.1.3陰性樣品和陽性樣品應(yīng)具有基質(zhì)符合性，以及與實(shí)際樣品所含除目標(biāo)分析物外其他成分的相似

性，重點(diǎn)考慮典型樣品基質(zhì)或相似基質(zhì)，綜合考慮蛋白、脂肪、水分、糖分、高聚物或多聚體物質(zhì)、色

澤、酸堿性等影響檢測的組分進(jìn)行區(qū)分選擇。

5.1.4對于多種目標(biāo)分析物的檢測，盡可能對全部目標(biāo)分析物進(jìn)行檢測，若因客觀條件限制不能檢測

全部目標(biāo)分析物，宜對所有目標(biāo)分析物進(jìn)行分類（如結(jié)構(gòu)類似程度、危害程度等），每一類至少選擇一

種目標(biāo)分析物進(jìn)行檢測。

5.1.5陽性樣品或陰性樣品宜采用國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、參考物質(zhì)或者質(zhì)量控制品等，選擇適宜的實(shí)驗(yàn)

室標(biāo)準(zhǔn)分析方法或經(jīng)典方法對樣品中的目標(biāo)分析物進(jìn)行儀器測定，確認(rèn)所有陰性樣品不能檢出目標(biāo)分

析物，確認(rèn)所有陽性樣品中目標(biāo)分析物的濃度。測定完成后的各類樣品應(yīng)進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)處理，形成盲樣，

可自行制備。

試劑準(zhǔn)備

將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，在室溫平衡15-30分鐘后，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品、

洗滌緩沖液、樣本稀釋液、抗體工作液、酶標(biāo)抗體工作液、底物、終止液等相關(guān)試劑。

操作步驟

根據(jù)待測樣本數(shù)量、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白對照孔的數(shù)量決定所需的酶標(biāo)板板條數(shù)，每個(gè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)

溶液重復(fù)測定2次或3次。記錄實(shí)際加樣情況，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作。

結(jié)果計(jì)算

5.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的程序操作，讀取各孔的吸光值并取平均值，通過系列標(biāo)準(zhǔn)濃度與針對

每個(gè)濃度獲得的平均吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到四參數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線或其他規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行四參數(shù)曲線擬合，按式（1）建立方程，

并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

???

y=?+?······································································(1)

1+()?

??50

式中：

y—吸光度值；

a—最大吸光度值；

b—吸光度增加速率參數(shù)，即曲線在EC50處的斜率；

EC50—半數(shù)抑制濃度；

d—最小吸光度值；

相關(guān)系數(shù)的計(jì)算：利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理軟件計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

2

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5.4.2數(shù)據(jù)計(jì)算

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到每個(gè)樣本的測定濃度值。若樣本吸光度值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，則先稀釋至合

適倍數(shù)，重新進(jìn)行檢測，其分析結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得的濃度乘以稀釋倍數(shù)。

數(shù)據(jù)分析

5.5.1靈敏度

重復(fù)測定空白樣本或陰性樣本不少于10次，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到對應(yīng)濃度的平均值（??0）和標(biāo)準(zhǔn)

偏差（s），計(jì)算??0+3s，即為檢出限。計(jì)算??0+10s，即為定量限。

5.5.2精密度

使用同一批次的試劑盒，選取低、中、高3個(gè)濃度水平的陽性樣本重復(fù)測定10次，計(jì)算得到批內(nèi)變

異系數(shù)。使用3個(gè)不同批次的同一試劑盒，選取低、中、高3個(gè)濃度水平的陽性樣本每個(gè)批次重復(fù)測定3

次，計(jì)算得到批間變異系數(shù)。

按式（2）計(jì)算變異系數(shù)：

?

CV=×100%·········································································(2)

??

式中：

CV—變異系數(shù)，單位為%；

s—標(biāo)準(zhǔn)偏差；

??—重復(fù)測定的平均值。

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的變異系數(shù)范圍可參考附錄A。

5.5.3正確度

5.5.3.1與參比方法的一致性

采用試劑盒與已知的國際或國家認(rèn)可的參考方法對同一份樣本進(jìn)行重復(fù)測定10次，按GB/T4889中

的F檢驗(yàn)和T-檢驗(yàn)進(jìn)行評價(jià)，具體參見附錄B。

5.5.3.2采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

對有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行10次重復(fù)檢測，計(jì)算10次重復(fù)檢測的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)，按照公式

（3）計(jì)算正確度。

檢測值

正確度(%)=×100%·····························································(3)

認(rèn)定值

5.5.3.3回收率

選用試劑盒適用的每種基體，添加低、中、高3個(gè)濃度水平的目標(biāo)分析物，每個(gè)水平重復(fù)測定10次，

計(jì)算檢測結(jié)果的平均值與理論值的偏差。3個(gè)濃度水平的偏差范圍可參考附錄C。

5.5.4特異性

按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的程序操作，測定與目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)類似物或功能類似物的交叉反應(yīng)。

3

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對于夾心法試劑盒，配制一定濃度（C）的結(jié)構(gòu)類似物，采用試劑盒檢測計(jì)算得到相應(yīng)的濃度(C′)，

按照公式（4）計(jì)算交叉反應(yīng)率（CR）。

?′

CR=×100%·······································································(4)

?

式中：

CR—交叉反應(yīng)率，單位為%；

C—結(jié)構(gòu)類似物的配制濃度；

C′—結(jié)構(gòu)類似物的測定濃度；

對于競爭法試劑盒，將結(jié)構(gòu)類似物稀釋至系列濃度，按照4.4.1步驟得到相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度，按

照公式（4）計(jì)算交叉反應(yīng)率。

目標(biāo)物的??

CR=50×100%·································································(5)

類似物的??50

式中：

CR—交叉反應(yīng)率，%；

EC50—半數(shù)抑制濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。

4

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附錄A

（資料性）

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的變異系數(shù)范圍

被測組分含量實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（CV）/%

0.1μg/kg43

1μg/kg30

10μg/kg21

100μg/kg15

1mg/kg11

10mg/kg7.5

100mg/kg5.3

1000mg/kg3.8

1%2.7

10%2.0

100%1.3

本表引自GB/T27404-2008的附錄F.2。

5

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附錄B

（資料性）

與參比方法一致性評價(jià)

先采用F檢驗(yàn)，考察酶聯(lián)免疫試劑盒與已知的國際或國家認(rèn)可的參考方法所取得的兩組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)

偏差是否一致；若一致，再采用配對T檢驗(yàn)，考察兩組數(shù)據(jù)的平均值是否存在顯著性差異，若不存在顯

著性差異，說明兩種方法測定結(jié)構(gòu)具有較好的一致性。

B.1F檢驗(yàn)

按照公式B.1進(jìn)行F檢驗(yàn)，考察兩組檢測數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差是否一致，若一致按B.2執(zhí)行；若不一致，

則兩組檢測結(jié)果不一致。

?2

F=大·················(B.1)

?2

小

式中：

S大—兩組數(shù)據(jù)中標(biāo)準(zhǔn)偏差大的數(shù)值；

S小—兩組數(shù)據(jù)中標(biāo)準(zhǔn)偏差小的數(shù)值；

B.2T檢驗(yàn)

按照公式B.2進(jìn)行T檢驗(yàn)，

|???|??

t=12√12·································································(B.2)

??1+?2

式中：

x1—第1組測定結(jié)果的平均值；

x2—第2組測定結(jié)果的平均值；

s—兩組等精度測定結(jié)果的合并實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差；

n1—第1組測定的平行測定次數(shù)；

n2—第2組測定的平行測定次數(shù)。

其中，兩組等精度測定結(jié)果的合并實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s按公式B.3計(jì)算：

(??1)?2+(??1)?2

s=√1122······························································(B.3)

?1+?2?2

式中：

s1—第1組測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

s2—第2組測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

6

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附錄C

（資料性）

回收率偏差范圍

濃度水平范圍回收率范圍

mg/kg%

>10095-105

1-10090-110

0.1-180-110

<0.160-120

本表引自GB/T27404-2008的附錄F.1。

7

ICS點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)

CCS點(diǎn)擊此處添加CCS號(hào)

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—XXXX

`

酶聯(lián)免疫試劑盒檢測通則

Guidelinesforenzymeimmunoassayskittest

(點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí))

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

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酶聯(lián)免疫試劑盒檢測通則

1范圍

本文件描述了酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測一般要求和檢測過程。

本文件適用于酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T4889數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋正態(tài)分布均值和方差的估計(jì)與檢驗(yàn)

GB/T27404實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4一般要求

產(chǎn)品

酶聯(lián)免疫試劑盒應(yīng)附產(chǎn)品說明書，或等同的指導(dǎo)性文件。

實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室的生物安全管理應(yīng)符合GB19489中的相應(yīng)要求。

檢測人員

檢測人員應(yīng)熟悉相關(guān)法律法規(guī)、檢測方法原理，掌握質(zhì)量檢測操作規(guī)范、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量管理和實(shí)

驗(yàn)安全等專業(yè)知識(shí)和技能。

檢測指標(biāo)

標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、靈敏度、精密度、正確度和特異性。

5檢測過程

檢測樣品的選擇及制備

1

GB/TXXXXX—XXXX

5.1.1陰性樣品與待分析樣品應(yīng)來源于同一物種，并具有相似的結(jié)構(gòu)特性，包括不含有或方法學(xué)未能

檢出目標(biāo)分析物的樣品，以及含有或添加其他與目標(biāo)分析物結(jié)果類似物質(zhì)（易產(chǎn)生交叉反應(yīng)）的樣品，

按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的步驟進(jìn)行前處理。

5.1.2陽性樣品是指含有目標(biāo)分析物的待測樣品，按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的步驟進(jìn)行前處理。

5.1.3陰性樣品和陽性樣品應(yīng)具有基質(zhì)符合性，以及與實(shí)際樣品所含除目標(biāo)分析物外其他成分的相似

性，重點(diǎn)考慮典型樣品基質(zhì)或相似基質(zhì)，綜合考慮蛋白、脂肪、水分、糖分、高聚物或多聚體物質(zhì)、色

澤、酸堿性等影響檢測的組分進(jìn)行區(qū)分選擇。

5.1.4對于多種目標(biāo)分析物的檢測，盡可