ICS03.080.99CCSX00血清中20種類固醇激素的測定Determinationof20steroidhormonesinserum——HighperformanceliquidchromatographytandemmasssIT/SATA077—2024前言 2規范性引用文件 3術語和定義 4原理 25試劑與材料 26儀器和設備 27分析步驟 38結果計算 49靈敏度、精密度 4附錄A（資料性）20種類固醇激素標準品信息、保留時間及內標物 5附錄B（資料性）20種類固醇激素及內標物定量定性離子對及去簇電壓、碰撞能量 6附錄C（資料性）20種類固醇激素及11種內標物多反應監測（MRM）質量色譜圖 8附錄D（資料性）20種類固醇激素的檢出限、定量限 參考文獻 T/SATA077—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由深圳市計量質量檢測研究院提出。本文件由深圳市分析測試協會歸口。本文件起草單位：深圳市計量質量檢測研究院、深圳市寶安區公共衛生服務中心、深圳深檢集團醫學檢驗實驗室、深圳市農產品質量安全檢驗檢測中心、深圳市龍崗中心醫院、四川大學、南方科技大學醫院、深圳市人民醫院、廣州中醫藥大學深圳醫院（福田）、深圳市龍崗婦幼保健院、深圳恒生醫院。本文件主要起草人：李子櫻、陳欣、劉愛平、谷素英、肖偉敏、孫亮、楊國武、孫麗萍、劉成文、曾懿、王力弘、趙云霞、張玉鑫、陳佳平、王奇、羅敏、于建渤、李博、李小峰、李永新、袁小澎、趙洪悅、紀昕、于波海、周珍文、張光輝。1T/SATA077—2024血清中20種類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯質譜法本文件規定了血清中20種類固醇激素（褪黑素、脫氫表雄酮、雄烯二酮、睪酮、雙氫睪酮、孕烯醇酮、孕酮、17α-羥孕酮、21α-羥基孕酮、11-脫氧皮質醇、21-脫氧皮質醇、皮質酮、可的松、氫化可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17α-羥基孕烯醇酮、醛固酮、硫酸脫氫表雄酮）的液相色譜-串聯質譜測定方法。本文件適用于血清中20種類固醇激素的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T32465-2015化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求WS/T478-2024血清25-羥基維生素D2和D3的檢測同位素稀釋液相色譜串聯質譜法WS/T225-2024臨床化學檢驗血液標本的采集與處理WS/T661靜脈血液標本采集指南WS/T408-2024定量檢驗程序分析性能驗證指南3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1內標internalstandard在定量分析時，加入到樣品中作為參比物的已知量的化合物純品。3.2檢出限limitofdetection檢測方法在規定的實驗條件下所能檢出分析物的最低濃度。3.3定量限limitofquantification在滿足實驗室對準確性和精密度要求的前提下，檢測方法在規定的實驗條件下所能準確定量檢測分析物的最低可測量濃度或量。3.4線性linearity在給定的測量范圍內，使測定結果與樣品中分析物的量直接成比例的能力。此處的測定結果指最終的分析結果，而非儀器輸岀的原始信號。3.5線性范圍linearrange使實驗系統的最終分析結果為可接受的線性的濃度范圍，此時非線性誤差應低于允許誤差。3.6基質效應matrixeffect2T/SATA077—2024標本中除分析物之外的樣品性質對分析物測定結果的影響。4原理試樣以乙酸乙酯溶液作為萃取劑，通過液液萃取的原理將血清中的類固醇激素富集至萃取劑中，得到血清中分離和純化的類固醇激素，用高效液相色譜-串聯質譜測定，通過建立的標準品標準曲線與各自內標峰面積比計算血清中20種類固醇激素的濃度。5試劑與材料除另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。5.1試劑5.1.1甲醇（CH4O）：質譜純。5.1.2乙酸乙酯（C4H8O2）：質譜純。5.1.3乙酸銨（CH3COONH4）：分析純。5.2試劑配制5.2.10.1mol/L乙酸銨溶液：準確稱取1.000g乙酸銨，加入130mL水溶解備用。5.2.21mmol/L乙酸銨溶液：準確移取0.1mol/L乙酸銨溶液（5.2.1）1mL，至100mL容量瓶，用水定容至刻度備用。5.2.31mmol/L乙酸銨-甲醇溶液：用1mmol/L乙酸銨溶液（5.2.2）和甲醇（5.1.1）按6：4體積比混合備用。5.3標準品類固醇標準物質及穩定同位素內標物，純度大于或等于95%或有證標準物質，20種類固醇激素中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量等詳見附錄A。5.4標準溶液配制5.4.1外標標準儲備液（500μg/mL）：分別準確稱取50.0mg（精確至0.0001g）各標準品，用甲醇溶解并轉移至100mL容量瓶中，定容至刻度，配制成濃度為500μg/mL標準儲備液，于-20℃避光保存，可穩定6個月。5.4.2外標混合標準中間液（10.0μg/mL)：準確移取500μL各類固醇激素標準儲備液（5.4.1）于25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。于-20℃避光保存，可穩定3個月。5.4.3內標混合標準儲備液（5.00μg/mL)：分別移取500μL各內標單標標準溶液（100μg/mL）至10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度（若購買的內標為固體標準品，則需先配制成濃度為100μg/mL的內標單標溶液）。于-20℃避光保存，可穩定2個月。5.4.4外標混合標準工作液（1.00μg/mL準確移取500μL外標混合標準中間液（5.4.2）至5mL容量瓶中，用1mmol/L乙酸銨-甲醇溶液（5.2.3）定容至刻度。臨用前配制。5.4.5內標混合標準工作液（200ng/mL）：準確移取200μL內標混合標準儲備液（5.4.3）至5mL容量瓶中，用1mmol/L乙酸銨-甲醇溶液（5.2.3）定容至刻度。臨用前配制。6儀器和設備6.1液相色譜-串聯質譜儀：配置電噴霧電離源。6.2分析天平：感量0.000lg。6.3渦旋混合器。6.4離心機：轉速不低于10000r/min。6.5冷凍抽干機。3T/SATA077—20247分析步驟7.1樣品前處理準確移取100μL血清樣本，加入10.0μL200ng/mL內標混合標準工作液（5.4.5加入1.2mL乙酸乙酯溶液（5.1.2），渦旋提取（2500rpm，10min），冰上孵育10min，離心（18000rpm，4℃,10min），取上清液進行冷凍抽干，用100μL1mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇溶液（v/v=6：4）復溶，離心（18000rpm，4℃,10min），取上清液于樣品瓶中，用于LC-MS/MS檢測分析。7.2儀器參考條件7.2.1液相條件a)色譜柱：C18液相色譜柱（2.7μm2.1×100mm），或相當者；b)流動相：1mmol/L乙酸銨水溶液（流動相A）和甲醇溶液（流動相B）；c)流速：0.3mL/min；e)進樣量：5μL；f)洗脫梯度見表1。表1超高效液相色譜洗脫梯度參考條件7.2.2質譜條件a)離子源：電噴霧離子源(ESI)；b)檢測方式：多反應監測(MRM)；c)掃描方式：正離子模式、負離子模式；d)電噴霧電壓：1.75kV(+)/3.00kV(-)；e)離子源溫度：600℃;f)霧化氣：7.0Bar；g)去溶劑氣流量：1000L/hr；h)錐孔反吹氣流量：150L/hr；i)監測離子對和定量離子對等信息詳見附錄B；20種類固醇激素及11種內標物的多反應監測（MRM）質量色譜圖詳見附錄C。注：對于不同質譜儀器，儀器參數可能存在差異，測定前應將質譜參數優化到最佳。7.3標準曲線的制作內標混合標準工作液（5.4.5）配制混合標準溶液工作曲線：0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、4T/SATA077—202450.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL。標準系列工作溶液中各內標的濃度為20ng/mL。不同物質根據實際情況采用不同范圍的標準曲線。將標準系列工作液由低濃度到高濃度依次進樣，以待測類固醇激素與對應同位素內標的峰面積比值為縱坐標，以標準系列工作液濃度（ng/mL）為橫坐標，分別繪制20種類固醇激素的標準曲線。7.4定性和定量7.4.1保留時間被測試樣中目標色譜峰與相應標準色譜峰的保留時間相比較，相對誤差應在±2.5%之內。7.4.2離子豐度比按照高效液相色譜-串聯質譜條件測定試樣和標準工作溶液，記錄試樣和標準溶液中各化合物的色譜保留時間，以相對于最強離子豐度的百分比作為定性離子對的相對豐度，記錄濃度相當的試樣與標準工作溶液中相應成分的相對離子豐度，定性時離子豐度比的最大允許偏差見表2。表2定性時離子豐度比的最大允許偏差7.4.3試樣溶液的測定將處理完畢的試樣（7.1）按儀器參考條件（7.2）進行測定，得到相應的樣品溶液的色譜峰面積。根據標準曲線得到待測液中組分的濃度，平行測定次數不少于兩次。8結果計算將液相色譜-質譜測得濃度代入下式計算含量：式中：X——試樣中各待測物的含量，單位為納克每毫升（ng/mL）；c——從標準曲線中讀出的供試品溶液中各待測物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mLV1——樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；V2——取樣體積，單位為毫升（mLK——稀釋倍數。結果保留三位有效數字。9靈敏度、精密度9.1靈敏度各類固醇激素的檢出限及定量限見附錄D。9.2精密度依據已發布的行業標準等規范性文件，對方法的精密度進行驗證，定量檢測下限濃度附近低值CV＜20％,其余濃度CV＜15％。5T/SATA077—2024（資料性）20種類固醇激素標準品信息、保留時間及內標物20種類固醇激素標準品信息及內標物見表A.1。表A.120種類固醇激素標準品信息、保留時間及內標物1CHNO2CHO3CHO4CHO5DehydroepiandrosteronesulfCHOS6CHO7CHO8CHO9CHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHO6T/SATA077—2024（資料性）20種類固醇激素及內標物定量定性離子對及去簇電壓、碰撞能量20種類固醇激素及內標物定量定性離子對及去簇電壓、碰撞能量見表B.1。表B.120種類固醇激素及內標物定量定性離子對及去簇電壓、碰撞能量1234567897T/SATA077—2024注：帶為定量離子。8T/SATA077—2024（資料性）20種類固醇激素及11種內標物多反應監測（MRM）質量色譜圖9T/SATA077—2024圖C.120種類固醇激素及11種內標物多反應監測（MRM）質量色譜圖T/SATA077—2024（資料性）20種類固醇激素的檢出限、定量限20種類固醇激素的檢出限、定量限見表D.1。表D.120種類固醇激素的檢出限、定量限12234567892DehydroepiandrosteronesuT/SATA077—2024參考文獻[1]KarashimaS,OsakaI.Rapidityandprecisionofsteroidhormonemeasurement[J].Journalofclinicalmedicine,2022,11(4):956.[2]TaylorDR,GhataoreL,CouchmanL,etal.A13-steroidserumpanelbasedonLC-MS/MS:useindetectionofadrenocorticalcarcinoma[J].Clinicalchemistry,2017,63(12):1836-1846.[3]JiaY,LiuX,XuL,etal.Liquidchromatography-tandemmassspectrometrym