食品中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的執(zhí)法檢驗(yàn)方法本方法規(guī)定了食品（含保健食品）中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法及液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜確證方法。本方法適用于飲料、糖果、餅干及酒類等食品及保健食品的片劑、膠囊、軟膠囊等劑型中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的定性和定量測定。蜂蜜、蜜餞、丸劑、口服液、顆粒劑（沖劑）、粉劑、膏劑等其他類食品（含保健食品）經(jīng)方法驗(yàn)證后可參照本方法檢測。2原理試樣經(jīng)甲醇超聲提取，過濾后，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法定量。3試劑與材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純；水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。3.1試劑3.1.1乙腈（CH3CN）：色譜純。3.1.2甲酸（HCOOH）：色譜純。3.1.3乙酸乙酯（CH3COOC2H5）。3.1.4甲醇（CH3OH）：色譜純。3.2試劑配制3.2.10.1％甲酸水溶液：準(zhǔn)確量取甲酸（3.1.2）1mL，用水稀釋至1000mL，混勻。3.2.2甲醇水溶液（1+1）：將甲醇（3.1.4）與水等體積混合。3.3標(biāo)準(zhǔn)品伐地那非丙氧基羥乙基替代物（又名：伐地那非雜質(zhì)31、丙氧苯基羥基伐地那非）標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)品中文名稱、英文名稱、CAS號及分子式等信息見附錄A。3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制（200μg/mL）準(zhǔn)確稱取伐地那非丙氧基羥乙基替代物標(biāo)準(zhǔn)品（3.3）10mg（精確至0.01mg用甲醇（3.1.4）溶解，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-18℃以下貯存，有效期3個月。3.4.2標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制（1μg/mL）準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液（3.4.1）0.25mL于50mL容量瓶中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。-18℃以下貯存，有效期1個月。3.4.3系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制分別準(zhǔn)確吸取20μL、50μL、100μL、200μL、500μL標(biāo)準(zhǔn)中間液（1μg/mL3.4.2置于一組10mL容量瓶中，用甲醇水溶液（1+13.2.2）定容，搖勻，配制成2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，或依儀器響應(yīng)情況配制適當(dāng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，或根據(jù)需要采用空白基質(zhì)提取液（5.1.4配制適當(dāng)濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。現(xiàn)用現(xiàn)配。3.5材料3.5.1微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)相。3.5.2離心管：50mL。3.5.3容量瓶：10mL、50mL。4儀器和設(shè)備4.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）。4.2液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）。4.3分析天平：感量分別為0.001g和0.01mg。4.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000r/min。4.5超聲波清洗儀：功率≥500W，頻率≥37kHz。5分析步驟5.1試樣處理5.1.1固態(tài)或半固態(tài)試樣取固態(tài)試樣適量混勻，研細(xì)，或取半固態(tài)試樣適量混勻，稱取1g試樣（精確至0.001g）置于離心5min，上清液全部轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶（3.5.3）中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，混勻。取（3.2.2）適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)上機(jī)。5.1.2液態(tài)試樣取試樣適量搖勻，準(zhǔn)確量取1g試樣（精確至0.001g）置于50mL具塞離心管（3.5.2）中，加入40mL甲醇（3.1.4），超聲提取15min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶（3.5.3）中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，混勻。取適量上清液經(jīng)微孔濾膜（3.5.1）過濾，待測定。當(dāng)樣品濃度過高時，根據(jù)實(shí)際濃度用甲醇水溶液（1+13.2.2）適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)上機(jī)。5.1.3油脂基質(zhì)試樣取試樣適量混勻，稱取1g試樣（精確至0.001g）置于50mL具塞離心管（3.5.2）中，加入5mL乙酸乙酯（3.1.3），振搖，使其分散，加入35mL甲醇（3.1.4），超聲提取15min，冷卻至室溫，4000r/min離心5min，上清液全部轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶（3.5.3）中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，混勻。取適量上清液經(jīng)微孔濾膜（3.5.1）過濾，待測。當(dāng)樣品濃度過高時，根據(jù)實(shí)際濃度用甲醇水溶液（1+13.2.2）適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)上機(jī)。5.1.4空白基質(zhì)提取液稱取空白試樣適量，與試樣同法處理，制得空白基質(zhì)提取液。5.2儀器參考條件5.2.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18色譜柱，50mm×2.1mm（內(nèi)徑），1.8μm，或性能相當(dāng)者；b）流動相：A相為0.1％甲酸水溶液（3.2.1），B相為乙腈（3.1.1），梯度洗脫條件見表1；表1液相色譜梯度洗脫條件注：在有共流出成分影響目標(biāo)化合物檢測時，可參照食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS202405色譜條件設(shè)置流動相，使色c）流速：0.3mL/min；d）柱溫：30℃;e）進(jìn)樣量：2μL。5.2.2質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：a）離子源：電噴霧離子源（ESI）；b）檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；c）掃描方式：正離子掃描；d）毛細(xì)管電壓：3500V；e）干燥氣溫度：300℃;f）干燥氣流速：7L/min；g）鞘氣流速：11L/min；h）鞘氣溫度：350℃;i）其他參考質(zhì)譜參數(shù)見表2。表2其他參考質(zhì)譜參數(shù)注：當(dāng)采用不同質(zhì)譜儀器時，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將質(zhì)量濃度為2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.4.3）分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，以系列標(biāo)準(zhǔn)工作液中目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。伐地那非丙氧基羥乙基替代物的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖參見附錄B。5.4試樣溶液的測定5.4.1定性測定在相同試驗(yàn)條件下，試樣中待測組分的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)；且試樣中被測組分定性離子的相對豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的定性離子的相對豐度進(jìn)行比較，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在對應(yīng)的待測物。表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差>50>20～50>10～20根據(jù)需求，可使用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀對試樣溶液中的目標(biāo)峰進(jìn)行定性確證（儀器條件參見附錄C）測定試樣和濃度接近的伐地那非丙氧基羥乙基替代物標(biāo)準(zhǔn)工作液，記錄試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作液中化合物的色譜峰保留時間及多級質(zhì)譜圖，當(dāng)試樣中檢出與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時間一致的色譜峰，并且與標(biāo)準(zhǔn)品母離子精確分子量誤差不超過百萬分之五，主要碎片離子精確分子量誤差不超過百萬分之十，即可確證試樣中檢出相應(yīng)化合物。5.4.2定量測定將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到相應(yīng)的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的濃度。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對試樣進(jìn)行定量，應(yīng)使試樣溶液被測組分的響應(yīng)值在儀器測定的線性范圍內(nèi)，若被測物質(zhì)含量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定范圍，則應(yīng)重新處理試樣，適量減少稱樣量或適當(dāng)稀釋試樣，使其上機(jī)濃度在線性范圍內(nèi)再進(jìn)行定量。如使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量，應(yīng)同時用同等稀釋倍數(shù)的空白基質(zhì)提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液后測定。5.5空白試驗(yàn)除不加試樣外，完全按照上述操作步驟進(jìn)行。6結(jié)果計(jì)算試樣中被測組分含量按式（1）計(jì)算：式中：X——試樣中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c——試樣溶液中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/LV——試樣溶液的定容體積，單位為毫升（mLm——試樣取樣的質(zhì)量，單位為克（g1000——換算系數(shù)；f——稀釋因子。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。7精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。8其他當(dāng)取樣量為1g，定容體積為50mL時，伐地那非丙氧基羥乙基替代物的檢出限為0.05mg/kg，定量限為0.10mg/kg。本方法在0.1mg/kg～1.0mg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為80％～110％。空白試驗(yàn)應(yīng)無干擾。附錄A伐地那非丙氧基羥乙基替代物標(biāo)準(zhǔn)品的參考信息伐地那非丙氧基羥乙基替代物的中文名稱、英文名稱、CAS號、化學(xué)結(jié)構(gòu)式、分子式和相對分子質(zhì)量見表A.1。表A.1伐地那非丙氧基羥乙基替代物標(biāo)準(zhǔn)品的基本信息量物C24H34N6O5S伐地那非丙氧基羥乙基替代物標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖伐地那非丙氧基羥乙基替代物標(biāo)準(zhǔn)溶液（20μg/L）的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖B.1伐地那非丙氧基羥乙基替代物標(biāo)準(zhǔn)溶液（20μg/L）的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法儀器參考條件以及質(zhì)譜圖液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18色譜柱，150mm×2.0mm（內(nèi)徑），1.8μm，或性能相當(dāng)者；b）流動相：A相為0.1％甲酸水溶液（3.2.1），B相為甲醇（3.1.4），梯度洗脫條件見表C.1。表C.1液相色譜梯度洗脫條件c）流速：0.2mL/min；d）柱溫：30℃;e）進(jìn)樣量：5μL。質(zhì)譜參考條件如下：a）離子源：電噴霧離子源（ESI）；b）掃描方式：正離子FullMS/dd-MS2模式；c）毛細(xì)管電壓：3500V；e）輔助氣流速：15arb；f）鞘氣流速：50arb。其他質(zhì)譜參考條件見表C.2，色譜圖見圖C.1，二級質(zhì)譜圖見圖C.2。表C.2化合物準(zhǔn)分子離子、碰撞能量及主要碎