食品中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的執法檢驗方法本方法規定了食品（含保健食品）中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的液相色譜-串聯質譜測定方法及液相色譜-串聯高分辨質譜確證方法。本方法適用于飲料、糖果、餅干及酒類等食品及保健食品的片劑、膠囊、軟膠囊等劑型中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的定性和定量測定。蜂蜜、蜜餞、丸劑、口服液、顆粒劑（沖劑）、粉劑、膏劑等其他類食品（含保健食品）經方法驗證后可參照本方法檢測。2原理試樣經甲醇超聲提取，過濾后，濾液供液相色譜-串聯質譜儀測定，外標法定量。3試劑與材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純；水為符合GB/T6682規定的一級水。3.1試劑3.1.1乙腈（CH3CN）：色譜純。3.1.2甲酸（HCOOH）：色譜純。3.1.3乙酸乙酯（CH3COOC2H5）。3.1.4甲醇（CH3OH）：色譜純。3.2試劑配制3.2.10.1％甲酸水溶液：準確量取甲酸（3.1.2）1mL，用水稀釋至1000mL，混勻。3.2.2甲醇水溶液（1+1）：將甲醇（3.1.4）與水等體積混合。3.3標準品伐地那非丙氧基羥乙基替代物（又名：伐地那非雜質31、丙氧苯基羥基伐地那非）標準品純度≥98%，或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。標準品中文名稱、英文名稱、CAS號及分子式等信息見附錄A。3.4標準溶液配制3.4.1標準儲備液的配制（200μg/mL）準確稱取伐地那非丙氧基羥乙基替代物標準品（3.3）10mg（精確至0.01mg用甲醇（3.1.4）溶解，轉移至50mL容量瓶中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，搖勻，配制成質量濃度為200μg/mL的標準儲備液。-18℃以下貯存，有效期3個月。3.4.2標準中間液的配制（1μg/mL）準確吸取標準儲備液（3.4.1）0.25mL于50mL容量瓶中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，搖勻，配制成質量濃度為1μg/mL的標準中間液。-18℃以下貯存，有效期1個月。3.4.3系列標準工作液的配制分別準確吸取20μL、50μL、100μL、200μL、500μL標準中間液（1μg/mL3.4.2置于一組10mL容量瓶中，用甲醇水溶液（1+13.2.2）定容，搖勻，配制成2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的系列標準工作液，或依儀器響應情況配制適當濃度的系列標準工作液，或根據需要采用空白基質提取液（5.1.4配制適當濃度的基質匹配標準工作液。現用現配。3.5材料3.5.1微孔濾膜：0.22μm，有機相。3.5.2離心管：50mL。3.5.3容量瓶：10mL、50mL。4儀器和設備4.1液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）。4.2液相色譜-串聯高分辨質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）。4.3分析天平：感量分別為0.001g和0.01mg。4.4離心機：轉速≥4000r/min。4.5超聲波清洗儀：功率≥500W，頻率≥37kHz。5分析步驟5.1試樣處理5.1.1固態或半固態試樣取固態試樣適量混勻，研細，或取半固態試樣適量混勻，稱取1g試樣（精確至0.001g）置于離心5min，上清液全部轉移至50mL容量瓶（3.5.3）中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，混勻。取（3.2.2）適當稀釋至標準曲線線性范圍內上機。5.1.2液態試樣取試樣適量搖勻，準確量取1g試樣（精確至0.001g）置于50mL具塞離心管（3.5.2）中，加入40mL甲醇（3.1.4），超聲提取15min，冷卻至室溫，轉移至50mL容量瓶（3.5.3）中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，混勻。取適量上清液經微孔濾膜（3.5.1）過濾，待測定。當樣品濃度過高時，根據實際濃度用甲醇水溶液（1+13.2.2）適當稀釋至標準曲線線性范圍內上機。5.1.3油脂基質試樣取試樣適量混勻，稱取1g試樣（精確至0.001g）置于50mL具塞離心管（3.5.2）中，加入5mL乙酸乙酯（3.1.3），振搖，使其分散，加入35mL甲醇（3.1.4），超聲提取15min，冷卻至室溫，4000r/min離心5min，上清液全部轉移至50mL容量瓶（3.5.3）中，用甲醇（3.1.4）定容至刻度，混勻。取適量上清液經微孔濾膜（3.5.1）過濾，待測。當樣品濃度過高時，根據實際濃度用甲醇水溶液（1+13.2.2）適當稀釋至標準曲線線性范圍內上機。5.1.4空白基質提取液稱取空白試樣適量，與試樣同法處理，制得空白基質提取液。5.2儀器參考條件5.2.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18色譜柱，50mm×2.1mm（內徑），1.8μm，或性能相當者；b）流動相：A相為0.1％甲酸水溶液（3.2.1），B相為乙腈（3.1.1），梯度洗脫條件見表1；表1液相色譜梯度洗脫條件注：在有共流出成分影響目標化合物檢測時，可參照食品補充檢驗方法BJS202405色譜條件設置流動相，使色c）流速：0.3mL/min；d）柱溫：30℃;e）進樣量：2μL。5.2.2質譜參考條件質譜參考條件如下：a）離子源：電噴霧離子源（ESI）；b）檢測方式：多反應監測（MRM）；c）掃描方式：正離子掃描；d）毛細管電壓：3500V；e）干燥氣溫度：300℃;f）干燥氣流速：7L/min；g）鞘氣流速：11L/min；h）鞘氣溫度：350℃;i）其他參考質譜參數見表2。表2其他參考質譜參數注：當采用不同質譜儀器時，儀器參數可能存在差異，測定前應將5.3標準曲線的制作將質量濃度為2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的系列標準工作液（3.4.3）分別注入液相色譜-串聯質譜儀中，測定相應的峰面積，以系列標準工作液中目標化合物的濃度為橫坐標，以定量離子色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。伐地那非丙氧基羥乙基替代物的液相色譜-質譜/質譜多反應監測色譜圖參見附錄B。5.4試樣溶液的測定5.4.1定性測定在相同試驗條件下，試樣中待測組分的保留時間與標準溶液中對應的保留時間偏差在±2.5%之內；且試樣中被測組分定性離子的相對豐度與濃度接近的標準溶液中對應的定性離子的相對豐度進行比較，偏差不超過表3規定的范圍，則可判定為試樣中存在對應的待測物。表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差>50>20～50>10～20根據需求，可使用高效液相色譜-串聯高分辨質譜儀對試樣溶液中的目標峰進行定性確證（儀器條件參見附錄C）測定試樣和濃度接近的伐地那非丙氧基羥乙基替代物標準工作液，記錄試樣和標準工作液中化合物的色譜峰保留時間及多級質譜圖，當試樣中檢出與標準品色譜峰保留時間一致的色譜峰，并且與標準品母離子精確分子量誤差不超過百萬分之五，主要碎片離子精確分子量誤差不超過百萬分之十，即可確證試樣中檢出相應化合物。5.4.2定量測定將試樣溶液注入液相色譜-串聯質譜儀中，得到相應的峰面積，根據標準曲線得到試樣溶液中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的濃度。用標準工作曲線對試樣進行定量，應使試樣溶液被測組分的響應值在儀器測定的線性范圍內，若被測物質含量超出標準曲線的測定范圍，則應重新處理試樣，適量減少稱樣量或適當稀釋試樣，使其上機濃度在線性范圍內再進行定量。如使用基質匹配標準工作曲線定量，應同時用同等稀釋倍數的空白基質提取液配制基質匹配標準工作液后測定。5.5空白試驗除不加試樣外，完全按照上述操作步驟進行。6結果計算試樣中被測組分含量按式（1）計算：式中：X——試樣中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c——試樣溶液中伐地那非丙氧基羥乙基替代物的質量濃度，單位為微克每升(μg/LV——試樣溶液的定容體積，單位為毫升（mLm——試樣取樣的質量，單位為克（g1000——換算系數；f——稀釋因子。以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留3位有效數字。7精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%。8其他當取樣量為1g，定容體積為50mL時，伐地那非丙氧基羥乙基替代物的檢出限為0.05mg/kg，定量限為0.10mg/kg。本方法在0.1mg/kg～1.0mg/kg添加濃度范圍內，回收率為80％～110％。空白試驗應無干擾。附錄A伐地那非丙氧基羥乙基替代物標準品的參考信息伐地那非丙氧基羥乙基替代物的中文名稱、英文名稱、CAS號、化學結構式、分子式和相對分子質量見表A.1。表A.1伐地那非丙氧基羥乙基替代物標準品的基本信息量物C24H34N6O5S伐地那非丙氧基羥乙基替代物標準溶液的液相色譜-質譜/質譜多反應監測色譜圖伐地那非丙氧基羥乙基替代物標準溶液（20μg/L）的液相色譜-質譜/質譜多反應監測色譜圖見圖B.1伐地那非丙氧基羥乙基替代物標準溶液（20μg/L）的液相色譜-質譜/質譜多反應監測色譜圖液相色譜-串聯高分辨質譜法儀器參考條件以及質譜圖液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18色譜柱，150mm×2.0mm（內徑），1.8μm，或性能相當者；b）流動相：A相為0.1％甲酸水溶液（3.2.1），B相為甲醇（3.1.4），梯度洗脫條件見表C.1。表C.1液相色譜梯度洗脫條件c）流速：0.2mL/min；d）柱溫：30℃;e）進樣量：5μL。質譜參考條件如下：a）離子源：電噴霧離子源（ESI）；b）掃描方式：正離子FullMS/dd-MS2模式；c）毛細管電壓：3500V；e）輔助氣流速：15arb；f）鞘氣流速：50arb。其他質譜參考條件見表C.2，色譜圖見圖C.1，二級質譜圖見圖C.2。表C.2化合物準分子離子、碰撞能量及主要碎