一、引言1.1WLM家族蛋白研究背景與意義蛋白質(zhì)作為生命活動的主要承擔(dān)者，參與了細胞內(nèi)幾乎所有的生理過程，從基礎(chǔ)的物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換，到復(fù)雜的信號傳導(dǎo)、基因表達調(diào)控等。在眾多蛋白質(zhì)家族中，WLM家族蛋白因其獨特的結(jié)構(gòu)和潛在的重要功能，逐漸成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的焦點之一。WLM家族蛋白屬于一類特殊的蛋白質(zhì)家族，其在生物體內(nèi)的分布較為廣泛，從簡單的單細胞生物到復(fù)雜的多細胞生物，都能發(fā)現(xiàn)WLM家族蛋白的蹤跡。這一廣泛的分布暗示著WLM家族蛋白在不同生物的生命活動中可能發(fā)揮著不可或缺的作用。在細胞內(nèi)，WLM家族蛋白參與了多種關(guān)鍵的生理過程。例如，在DNA損傷修復(fù)過程中，WLM家族蛋白扮演著重要角色。DNA作為遺傳信息的載體，其完整性對于細胞的正常功能和生物體的遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要。然而，DNA時刻面臨著各種內(nèi)源性和外源性因素的威脅，如細胞代謝過程中產(chǎn)生的活性氧、紫外線照射、化學(xué)誘變劑等，這些因素都可能導(dǎo)致DNA損傷。一旦DNA發(fā)生損傷，細胞必須啟動高效的修復(fù)機制來維持基因組的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，WLM家族蛋白能夠識別并結(jié)合受損的DNA部位，招募其他相關(guān)的修復(fù)因子，協(xié)同完成DNA損傷的修復(fù)過程，確保遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞。此外，WLM家族蛋白還與細胞周期調(diào)控密切相關(guān)。細胞周期是細胞生長、分裂和遺傳物質(zhì)傳遞的有序過程，受到嚴(yán)格的調(diào)控。WLM家族蛋白通過與細胞周期相關(guān)的蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細胞周期的進程，確保細胞在合適的時間進行分裂和增殖。當(dāng)細胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常時，可能導(dǎo)致細胞增殖失控，進而引發(fā)腫瘤等疾病。因此，WLM家族蛋白在細胞周期調(diào)控中的作用對于維持細胞的正常生理功能和預(yù)防疾病具有重要意義。在信號傳導(dǎo)通路中，WLM家族蛋白也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。信號傳導(dǎo)是細胞對外界刺激做出反應(yīng)的重要機制，涉及到一系列復(fù)雜的分子事件。WLM家族蛋白能夠感知細胞外的信號，并將其傳遞到細胞內(nèi)，激活相應(yīng)的信號通路，調(diào)節(jié)細胞的生理活動。例如，在細胞受到生長因子刺激時，WLM家族蛋白可能參與生長因子信號的傳導(dǎo)，促進細胞的生長和增殖。從進化的角度來看，WLM家族蛋白在不同物種中的高度保守性，進一步證明了其功能的重要性。在漫長的進化歷程中，許多基因和蛋白質(zhì)會發(fā)生變異和分化，以適應(yīng)不同物種的生存需求。然而，WLM家族蛋白卻在不同物種中保持了相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和功能，這表明其在生物進化過程中承擔(dān)著至關(guān)重要的角色，對于生物體的生存和繁衍具有不可替代的作用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對WLM家族蛋白的研究具有廣闊的應(yīng)用前景。許多人類疾病的發(fā)生發(fā)展都與WLM家族蛋白的功能異常密切相關(guān)。例如，某些癌癥的發(fā)生可能與WLM家族蛋白在DNA損傷修復(fù)或細胞周期調(diào)控中的功能缺陷有關(guān)。通過深入研究WLM家族蛋白的功能機制，我們可以揭示這些疾病的發(fā)病機理，為疾病的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供新的靶點和策略。在藥物研發(fā)方面，WLM家族蛋白可以作為潛在的藥物靶點，開發(fā)針對相關(guān)疾病的特異性藥物。通過調(diào)節(jié)WLM家族蛋白的活性，有望實現(xiàn)對疾病的有效治療，提高患者的生活質(zhì)量和生存率。WLM家族蛋白在生命科學(xué)領(lǐng)域中具有重要的研究價值，其在細胞生理過程中的關(guān)鍵作用以及與人類疾病的密切聯(lián)系，為我們深入理解生命現(xiàn)象和攻克重大疾病提供了新的視角和方向。通過進一步深入研究WLM家族蛋白的功能和機制，有望在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得更多的突破和進展，為人類的健康和福祉做出更大的貢獻。1.2WLM家族蛋白研究進展1.2.1發(fā)現(xiàn)歷程WLM家族蛋白的發(fā)現(xiàn)是一個逐步深入的過程。最初，研究人員在對真核生物的基因組進行測序和分析時，通過生物信息學(xué)手段，發(fā)現(xiàn)了一類具有相似序列特征的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)在不同物種中呈現(xiàn)出一定的保守性，暗示它們可能具有共同的起源和相似的生物學(xué)功能，從而引起了科研人員的關(guān)注。在釀酒酵母中，相關(guān)基因的敲除實驗顯示出細胞對特定DNA損傷劑的敏感性增加，這一現(xiàn)象促使研究人員進一步探究這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能。通過一系列的遺傳學(xué)和生物化學(xué)實驗，逐漸確定了這些蛋白質(zhì)在DNA損傷修復(fù)過程中的重要作用，進而將其歸為一個新的蛋白質(zhì)家族——WLM家族蛋白。隨著研究的深入，在其他物種如裂殖酵母、哺乳動物等中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了WLM家族蛋白的同源物，表明該家族蛋白在進化上具有高度的保守性，并且在不同生物體內(nèi)可能發(fā)揮著相似的生物學(xué)功能。1.2.2底物特異性與活性調(diào)控WLM家族蛋白具有獨特的底物特異性。研究表明，其主要作用底物與DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)（DPC）相關(guān)。DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)是一種較為復(fù)雜的DNA損傷形式，它會阻礙DNA的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程，對細胞的生存和基因組穩(wěn)定性構(gòu)成嚴(yán)重威脅。WLM家族蛋白能夠特異性地識別并結(jié)合這些交聯(lián)的底物，通過其自身的蛋白酶活性，切割交聯(lián)部位的蛋白質(zhì)，從而解除DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，使DNA損傷得以修復(fù)。WLM家族蛋白的活性受到多種因素的精細調(diào)控。在蛋白質(zhì)翻譯后修飾方面，磷酸化是一種常見的調(diào)控方式。細胞內(nèi)的一些蛋白激酶可以催化WLM家族蛋白特定氨基酸殘基的磷酸化，改變其蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進而影響其與底物的結(jié)合能力以及酶活性。當(dāng)細胞受到DNA損傷刺激時，特定的蛋白激酶被激活，使WLM家族蛋白發(fā)生磷酸化，增強其在DNA損傷修復(fù)過程中的活性。與其他蛋白質(zhì)的相互作用也對WLM家族蛋白的活性調(diào)控至關(guān)重要。例如，WLM家族蛋白與Cdc48/p97蛋白存在緊密的相互作用。Cdc48/p97是一種具有ATP酶活性的分子伴侶，它能夠協(xié)助WLM家族蛋白對底物進行解折疊和轉(zhuǎn)運，促進DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的修復(fù)過程。WLM家族蛋白還可能與一些輔助因子相互作用，這些輔助因子可以調(diào)節(jié)其底物特異性、定位以及活性，確保WLM家族蛋白在合適的時間和位置發(fā)揮功能。1.2.3晶體結(jié)構(gòu)解析晶體結(jié)構(gòu)解析技術(shù)為深入理解WLM家族蛋白的功能機制提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過X射線晶體學(xué)、核磁共振等技術(shù)，科研人員成功解析了部分WLM家族蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。從解析的晶體結(jié)構(gòu)中可以看出，WLM家族蛋白具有獨特的結(jié)構(gòu)特征。其核心結(jié)構(gòu)域通常包含一個保守的蛋白酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負責(zé)底物的識別和切割，其三維結(jié)構(gòu)中的活性位點具有特定的氨基酸殘基排列，決定了其對特定底物的催化活性。WLM家族蛋白還包含一些輔助結(jié)構(gòu)域，如與其他蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域的存在使得WLM家族蛋白能夠與Cdc48/p97等蛋白相互作用，形成功能復(fù)合物，共同參與DNA損傷修復(fù)等生理過程。通過對晶體結(jié)構(gòu)的分析，研究人員可以清晰地了解WLM家族蛋白與底物、其他相互作用蛋白之間的結(jié)合模式和作用位點，為進一步揭示其功能機制提供了直觀的依據(jù)。這有助于解釋為什么WLM家族蛋白能夠特異性地識別和作用于DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)底物，以及其與其他蛋白相互作用如何協(xié)同完成DNA損傷修復(fù)過程。二、WLM家族蛋白參與DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)2.1DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷概述2.1.1損傷來源與分類DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷是一種較為復(fù)雜且具有潛在危害的DNA損傷形式，其來源廣泛，涵蓋了內(nèi)源性和外源性兩大方面的多種因素。內(nèi)源性因素主要源于細胞自身的代謝過程。細胞在正常的生理活動中會產(chǎn)生一些具有高反應(yīng)活性的物質(zhì)，如活性氧（ROS），它是細胞有氧代謝的副產(chǎn)物，包括超氧陰離子（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）和羥基自由基（·OH）等。這些活性氧能夠攻擊DNA和與之結(jié)合的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的形成。在細胞呼吸過程中，線粒體作為能量代謝的主要場所，會產(chǎn)生大量的活性氧，當(dāng)細胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)不足以清除這些活性氧時，它們就可能與周圍的生物大分子發(fā)生反應(yīng)，造成DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷。一些內(nèi)源性的醛類物質(zhì)，如乙醛和甲醛，也是導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的重要因素。乙醛主要是通過攝入的酒精的氧化降解產(chǎn)生，而甲醛則是一種普通的一碳（1C）代謝產(chǎn)物，可通過各種體內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)生成，包括組蛋白和核酸的酶促去甲基化。這些醛類物質(zhì)具有較高的反應(yīng)活性，能夠與DNA和蛋白質(zhì)分子中的氨基等基團發(fā)生反應(yīng)，形成共價交聯(lián)。外源性因素種類繁多，其中物理因素方面，紫外線（UV）和電離輻射是常見的誘因。紫外線照射能夠使DNA分子中的嘧啶堿基形成嘧啶二聚體，這種結(jié)構(gòu)變化會影響DNA與蛋白質(zhì)的正常相互作用，進而可能導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。不同波長的紫外線對DNA的損傷作用有所差異，例如，UVB（280-320nm）和UVC（200-280nm）能夠直接被DNA吸收，引發(fā)一系列光化學(xué)反應(yīng)，增加DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的風(fēng)險。電離輻射，如X射線和γ射線，具有較高的能量，能夠直接作用于DNA和蛋白質(zhì)分子，使其發(fā)生電離和激發(fā)，產(chǎn)生自由基，進而引發(fā)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷。電離輻射還可以通過間接作用，使細胞內(nèi)的水分子電離產(chǎn)生羥基自由基等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)進一步攻擊DNA和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致交聯(lián)的形成。化學(xué)因素在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷中也扮演著重要角色。許多化學(xué)物質(zhì)都具有潛在的致交聯(lián)能力，例如，一些烷化劑，如氮芥、環(huán)磷酰胺等，它們能夠與DNA和蛋白質(zhì)分子中的親核基團發(fā)生烷基化反應(yīng)，形成共價鍵，從而導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。這些烷化劑在腫瘤化療中被廣泛應(yīng)用，但同時也會對正常細胞造成損傷，引發(fā)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等不良反應(yīng)。一些重金屬離子，如鉛、汞、鎘等，也能夠與DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合，干擾它們的正常結(jié)構(gòu)和功能，促進DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的發(fā)生。環(huán)境中的有機污染物，如多環(huán)芳烴、農(nóng)藥等，也被證實具有誘導(dǎo)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷的能力。多環(huán)芳烴是一類廣泛存在于環(huán)境中的有機污染物，常見于汽車尾氣、工業(yè)廢氣和煙草煙霧中，其代表物質(zhì)苯并芘進入人體后，經(jīng)過代謝活化會形成具有高反應(yīng)活性的中間體，這些中間體能夠與DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生共價結(jié)合，導(dǎo)致交聯(lián)損傷。根據(jù)形成機制和化學(xué)性質(zhì)，DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷可以分為酶特異性DNA-蛋白質(zhì)共價結(jié)合體和非酶促DPCs兩類。酶特異性DNA-蛋白質(zhì)共價結(jié)合體是多種核酶（例如拓撲異構(gòu)酶、酪氨酸DNA磷酸二酯酶I(tyrosyl-DNAphosphodiesteraseI,orTDP1)、DNA和RNA聚合酶以及HMCES等）的正常酶催化中間體，但在酶功能失調(diào)、內(nèi)源性DNA損傷暴露或其特異性抑制劑處理下可能被捕獲形成牢固且不可逆的交聯(lián)。拓撲異構(gòu)酶在調(diào)節(jié)DNA的拓撲結(jié)構(gòu)過程中，會與DNA形成短暫的共價結(jié)合中間體，當(dāng)遇到某些干擾因素時，這種中間體會被穩(wěn)定下來，形成DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，阻礙DNA的正常代謝過程。非酶促DPCs則由內(nèi)源性反應(yīng)性代謝物或外源性因子引發(fā)的蛋白質(zhì)與DNA附近的交聯(lián)所致，環(huán)境以及人體自身產(chǎn)生的包括甲醛和乙醛在內(nèi)活性醛類是非酶促DPCs的重要誘導(dǎo)劑之一。2.1.2損傷危害DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷對細胞的正常生理功能和遺傳穩(wěn)定性具有多方面的嚴(yán)重危害。從細胞正常生理功能角度來看，DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)會對DNA的復(fù)制過程產(chǎn)生顯著的阻礙作用。在DNA復(fù)制過程中，DNA聚合酶需要沿著DNA模板鏈進行移動，以合成新的DNA鏈。然而，當(dāng)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)存在時，交聯(lián)的蛋白質(zhì)會像一個物理屏障一樣，阻擋DNA聚合酶的前進，使復(fù)制叉的移動受阻。這會導(dǎo)致DNA復(fù)制無法順利進行，延長復(fù)制時間，甚至可能使復(fù)制過程完全停滯。如果細胞不能及時解決這種復(fù)制障礙，就會引發(fā)一系列的連鎖反應(yīng)，影響細胞的正常增殖和分裂。DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)還會干擾DNA的轉(zhuǎn)錄過程。轉(zhuǎn)錄是遺傳信息從DNA傳遞到RNA的關(guān)鍵步驟，需要RNA聚合酶與DNA模板結(jié)合并進行轉(zhuǎn)錄。交聯(lián)的蛋白質(zhì)會改變DNA的局部結(jié)構(gòu)，使RNA聚合酶難以識別啟動子區(qū)域，或者在轉(zhuǎn)錄過程中遇到交聯(lián)部位時無法繼續(xù)前進，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄效率降低甚至完全終止。這將影響細胞內(nèi)各種RNA的合成，包括信使RNA（mRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）和核糖體RNA（rRNA）等，進而影響蛋白質(zhì)的合成和細胞的正常功能。DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷對細胞的遺傳穩(wěn)定性構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。當(dāng)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷未能得到及時和準(zhǔn)確的修復(fù)時，細胞在進行有絲分裂或減數(shù)分裂過程中，染色體的分離可能會出現(xiàn)異常。由于交聯(lián)的存在，DNA雙鏈之間的正常結(jié)構(gòu)被破壞，在染色體分離時，可能會導(dǎo)致染色體斷裂、缺失或重排等染色體畸變。這些染色體畸變會使細胞的基因組發(fā)生改變，遺傳信息的傳遞出現(xiàn)錯誤，增加細胞發(fā)生癌變的風(fēng)險。許多研究表明，DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等。在這些癌癥中，DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷可能導(dǎo)致原癌基因的激活或抑癌基因的失活，從而引發(fā)細胞的異常增殖和分化，最終形成腫瘤。DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷還可能導(dǎo)致基因突變。在DNA復(fù)制或修復(fù)過程中，為了繞過交聯(lián)部位，細胞可能會采用一些易錯的修復(fù)機制，如跨損傷合成（TLS）。在跨損傷合成過程中，DNA聚合酶會以較低的保真度合成DNA，這就增加了堿基錯配的概率，從而導(dǎo)致基因突變的發(fā)生。這些基因突變可能會影響細胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進一步破壞細胞的正常生理平衡，引發(fā)各種疾病。DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷還可能對細胞的凋亡和衰老過程產(chǎn)生影響。當(dāng)細胞受到嚴(yán)重的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷時，會激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，促使細胞發(fā)生凋亡，以避免損傷的DNA傳遞給子代細胞。如果細胞的凋亡機制出現(xiàn)異常，不能及時清除受損細胞，這些細胞可能會進入衰老狀態(tài)，導(dǎo)致細胞功能逐漸衰退，影響組織和器官的正常功能。在神經(jīng)系統(tǒng)中，DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷的積累可能與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)，如阿爾茨海默病和帕金森病等，這些疾病的發(fā)生可能與神經(jīng)元細胞中DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷導(dǎo)致的細胞凋亡和衰老異常有關(guān)。2.2DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)途徑細胞在長期的進化過程中，形成了一套復(fù)雜而精細的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)機制，以應(yīng)對這種高毒性的DNA損傷，維持基因組的穩(wěn)定性和細胞的正常生理功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷的修復(fù)主要涉及泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)、金屬蛋白酶依賴的修復(fù)途徑以及其他一些相關(guān)的修復(fù)機制。泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細胞檢測到DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷時，首先會啟動一系列的信號傳導(dǎo)通路，招募相關(guān)的修復(fù)因子到損傷部位。其中，泛素連接酶會被激活，它能夠識別交聯(lián)的蛋白質(zhì)，并將泛素分子連接到這些蛋白質(zhì)上。泛素是一種由76個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，它可以通過與靶蛋白的賴氨酸殘基形成共價鍵，對靶蛋白進行修飾。在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)中，多個泛素分子會依次連接到交聯(lián)蛋白質(zhì)上，形成多聚泛素鏈。這些多聚泛素鏈就像一個“標(biāo)簽”，能夠被蛋白酶體識別。蛋白酶體是一種大型的蛋白質(zhì)復(fù)合物，它具有多種蛋白酶活性，能夠特異性地識別并降解被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)。在這個過程中，交聯(lián)的蛋白質(zhì)被蛋白酶體逐步降解，從而解除DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，使DNA損傷得以修復(fù)。金屬蛋白酶依賴的修復(fù)途徑也是DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)的關(guān)鍵機制之一。在真核生物中，酵母的Wss1蛋白和后生動物的SPRTN蛋白是參與這一修復(fù)途徑的重要金屬蛋白酶。Wss1蛋白是一種在酵母中發(fā)現(xiàn)的金屬蛋白酶，它能夠特異性地識別并切割DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)部位的蛋白質(zhì)。Wss1蛋白的結(jié)構(gòu)中包含一個保守的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有特定的氨基酸殘基，能夠與金屬離子（如鋅離子）結(jié)合，形成活性中心，從而發(fā)揮蛋白酶活性。當(dāng)Wss1蛋白識別到DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)底物時，它會利用其蛋白酶活性，將交聯(lián)的蛋白質(zhì)切割成較小的片段，使DNA能夠從交聯(lián)中解脫出來。在這個過程中，Wss1蛋白與Cdc48/p97蛋白相互作用密切。Cdc48/p97蛋白是一種具有ATP酶活性的分子伴侶，它能夠協(xié)助Wss1蛋白對底物進行解折疊和轉(zhuǎn)運，促進DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的修復(fù)過程。Cdc48/p97蛋白通過水解ATP獲得能量，利用其機械力將交聯(lián)的蛋白質(zhì)從DNA上解離下來，并將其轉(zhuǎn)運到蛋白酶體中進行進一步的降解。SPRTN蛋白在后生動物的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)中起著核心作用。SPRTN蛋白同樣具有金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地切割與DNA交聯(lián)的蛋白質(zhì)。研究表明，SPRTN蛋白的突變會導(dǎo)致細胞對DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷的敏感性增加，基因組穩(wěn)定性下降。在DNA復(fù)制過程中，當(dāng)復(fù)制叉遇到DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)時，SPRTN蛋白會被招募到損傷部位。它首先通過與其他輔助因子的相互作用，識別交聯(lián)的蛋白質(zhì)，然后利用其蛋白酶活性將交聯(lián)的蛋白質(zhì)降解為小肽段，使DNA復(fù)制能夠繼續(xù)進行。SPRTN蛋白還參與了細胞周期的調(diào)控，當(dāng)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷嚴(yán)重時，它會激活細胞周期檢查點，使細胞周期停滯，以便有足夠的時間進行DNA損傷修復(fù)。如果損傷無法修復(fù)，細胞可能會啟動凋亡程序，以避免損傷的DNA傳遞給子代細胞。除了上述兩種主要的修復(fù)途徑外，細胞內(nèi)還存在其他一些參與DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)的機制。堿基切除修復(fù)（BER）途徑可能在某些情況下參與DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷的修復(fù)。當(dāng)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)導(dǎo)致DNA堿基損傷時，堿基切除修復(fù)途徑會被激活。首先，DNA糖苷酶會識別并切除受損的堿基，形成一個無堿基位點（AP位點）。然后，AP內(nèi)切酶會在AP位點處切斷DNA鏈，產(chǎn)生一個缺口。接著，DNA聚合酶會填補這個缺口，DNA連接酶再將斷裂的DNA鏈連接起來，完成修復(fù)過程。在這個過程中，雖然主要是針對堿基損傷進行修復(fù)，但也可能間接對DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷的修復(fù)起到一定的輔助作用，例如通過修復(fù)DNA鏈上的損傷，為其他修復(fù)機制提供更好的修復(fù)條件。核苷酸切除修復(fù)（NER）途徑也可能與DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)相關(guān)。核苷酸切除修復(fù)主要用于修復(fù)DNA上的各種損傷，包括紫外線誘導(dǎo)的嘧啶二聚體、化學(xué)物質(zhì)引起的加合物等。在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷中，如果交聯(lián)導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的改變，影響了DNA的正常功能，核苷酸切除修復(fù)途徑可能會被招募來修復(fù)這種損傷。NER途徑首先通過一系列的蛋白質(zhì)復(fù)合物識別損傷部位，然后在損傷部位兩側(cè)切開DNA鏈，切除包含損傷的寡核苷酸片段。最后，以互補鏈為模板，由DNA聚合酶合成新的DNA片段，DNA連接酶將新合成的片段與原DNA鏈連接起來。雖然目前對于NER途徑在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)中的具體作用機制還不完全清楚，但研究表明，NER途徑中的一些關(guān)鍵蛋白在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)過程中表達上調(diào)，暗示著它可能在這一修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。2.3DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷的定量檢測準(zhǔn)確檢測和定量分析DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷對于深入理解其生物學(xué)效應(yīng)以及相關(guān)疾病的發(fā)病機制至關(guān)重要。目前，已經(jīng)發(fā)展出多種檢測方法，每種方法都有其獨特的原理、優(yōu)勢和局限性。傳統(tǒng)的檢測方法中，SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）結(jié)合銀染或免疫印跡技術(shù)是較為常用的手段。其原理是利用SDS使蛋白質(zhì)變性并帶上負電荷，在聚丙烯酰胺凝膠的電場中，蛋白質(zhì)根據(jù)其分子量大小進行分離。對于DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)樣品，交聯(lián)復(fù)合物會以特定的條帶形式出現(xiàn)在凝膠上，通過與標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)志物對比，可以初步判斷交聯(lián)復(fù)合物的大小和含量。結(jié)合銀染或免疫印跡技術(shù)，能夠提高檢測的靈敏度和特異性。銀染可以使蛋白質(zhì)條帶呈現(xiàn)出黑色或棕色，增強條帶的可見性；免疫印跡則是利用特異性抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，通過顯色反應(yīng)來檢測交聯(lián)蛋白質(zhì)的存在和含量。這種方法的優(yōu)點是操作相對簡單，不需要特殊的儀器設(shè)備，能夠直觀地觀察到交聯(lián)復(fù)合物的存在和相對含量。然而，它的局限性也很明顯，檢測靈敏度相對較低，對于低水平的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷可能無法準(zhǔn)確檢測。該方法只能提供半定量的結(jié)果，難以精確測定交聯(lián)損傷的程度。基于熒光標(biāo)記的檢測方法近年來得到了廣泛應(yīng)用。其中，熒光原位雜交（FISH）技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記的抗體是一種常用的策略。FISH技術(shù)利用熒光標(biāo)記的核酸探針與細胞內(nèi)的DNA進行雜交，從而確定特定DNA序列的位置和分布。在檢測DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)時，先使用熒光標(biāo)記的抗體識別交聯(lián)的蛋白質(zhì)，然后通過FISH技術(shù)定位與之交聯(lián)的DNA。通過熒光顯微鏡觀察，可以直觀地看到DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)在細胞內(nèi)的位置和分布情況。利用熒光強度分析軟件，還可以對交聯(lián)的程度進行定量分析。這種方法的優(yōu)點是具有較高的靈敏度和特異性，能夠在細胞水平上對DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)進行精確定位和定量分析。它可以同時檢測多個樣本，適用于高通量研究。其缺點是實驗操作較為復(fù)雜，需要專業(yè)的熒光顯微鏡和圖像分析軟件。熒光標(biāo)記的抗體和核酸探針成本較高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。質(zhì)譜技術(shù)也逐漸成為檢測DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷的重要手段。質(zhì)譜技術(shù)能夠精確測定分子的質(zhì)量，通過對交聯(lián)復(fù)合物進行質(zhì)譜分析，可以確定交聯(lián)蛋白質(zhì)的種類、修飾位點以及交聯(lián)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在檢測DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)時，首先將交聯(lián)復(fù)合物進行酶解或化學(xué)裂解，得到小分子的肽段和DNA片段。然后利用質(zhì)譜儀對這些小分子進行分析，通過質(zhì)譜圖中的質(zhì)荷比信息，可以推斷出交聯(lián)復(fù)合物的組成和結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)點是具有極高的靈敏度和分辨率，能夠準(zhǔn)確鑒定交聯(lián)蛋白質(zhì)和DNA的修飾情況。它可以提供詳細的分子結(jié)構(gòu)信息，有助于深入了解DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的形成機制。然而，質(zhì)譜技術(shù)需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，實驗成本較高。樣品制備過程復(fù)雜，對樣品的純度和量要求較高，限制了其在一些常規(guī)實驗室中的應(yīng)用。單細胞凝膠電泳（彗星實驗）也是一種檢測DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷的有效方法。該方法的原理是將單細胞懸浮液與低熔點瓊脂糖混合后鋪在載玻片上，形成單細胞凝膠。然后將凝膠浸泡在裂解液中，使細胞膜和核膜破裂，釋放出DNA。在堿性條件下，DNA雙鏈解螺旋，形成帶負電荷的DNA斷片。在電場作用下，這些DNA斷片會向陽極遷移，形成類似彗星的形狀。通過熒光染料染色，在熒光顯微鏡下可以觀察到彗星的形態(tài)。當(dāng)存在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)時，交聯(lián)的蛋白質(zhì)會阻礙DNA的遷移，使彗星的尾長和尾矩減小。通過測量彗星的尾長、尾矩等參數(shù)，可以定量評估DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的程度。彗星實驗的優(yōu)點是能夠在單細胞水平上檢測DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷，反映細胞群體中個體細胞的損傷情況。實驗操作相對簡單，不需要昂貴的儀器設(shè)備。它的缺點是檢測結(jié)果易受多種因素的影響，如細胞的類型、處理條件、實驗操作等。對于交聯(lián)程度較低的樣品，檢測的準(zhǔn)確性可能受到影響。2.4SPRTN與疾病的關(guān)系SPRTN作為后生動物中參與DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)的關(guān)鍵蛋白酶，其功能異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，深入研究SPRTN與疾病的關(guān)系，對于揭示疾病的發(fā)病機制和開發(fā)有效的治療策略具有重要意義。Ruijs-Aalfs綜合征（RJALS）是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，其主要特征包括節(jié)段性早衰和早發(fā)性肝細胞癌。研究表明，SPRTN基因的突變是導(dǎo)致Ruijs-Aalfs綜合征的主要原因。在患者體內(nèi)，SPRTN基因發(fā)生突變，導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能異常。這種異常使得SPRTN蛋白無法正常發(fā)揮其在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)中的作用，導(dǎo)致DNA損傷不斷積累，基因組穩(wěn)定性下降。隨著時間的推移，這些損傷會逐漸影響細胞的正常功能，引發(fā)細胞的衰老和癌變。在肝臟組織中，由于DNA損傷的積累，肝細胞的增殖和分化失控，最終導(dǎo)致早發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生。患者還會出現(xiàn)皮膚松弛、脂肪減少、骨骼發(fā)育異常等節(jié)段性早衰的癥狀，這可能與全身細胞中DNA損傷修復(fù)障礙導(dǎo)致的細胞功能衰退有關(guān)。除了Ruijs-Aalfs綜合征，SPRTN功能異常還與其他多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，部分乳腺癌患者的腫瘤組織中SPRTN的表達水平出現(xiàn)異常。SPRTN表達的改變可能影響了乳腺癌細胞對DNA損傷的修復(fù)能力，使癌細胞更容易積累DNA損傷，從而增加了癌細胞的基因組不穩(wěn)定性和突變頻率。這種基因組的不穩(wěn)定性會促進癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，使得乳腺癌的病情更加惡化。在肺癌的研究中也觀察到類似的現(xiàn)象，SPRTN功能異常與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能通過影響DNA損傷修復(fù)和細胞周期調(diào)控等過程，促進肺癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化。SPRTN與神經(jīng)退行性疾病之間也存在潛在的聯(lián)系。神經(jīng)細胞對DNA損傷非常敏感，因為它們具有高度分化的特性，一旦受損很難進行自我修復(fù)和再生。當(dāng)SPRTN功能異常時，神經(jīng)細胞內(nèi)的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷無法得到及時有效的修復(fù)，導(dǎo)致DNA損傷逐漸積累。這些損傷會影響神經(jīng)細胞的正常生理功能，如神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放、神經(jīng)元之間的信號傳遞等。隨著DNA損傷的不斷積累，神經(jīng)細胞可能會逐漸死亡，引發(fā)神經(jīng)退行性疾病。在阿爾茨海默病的研究中發(fā)現(xiàn)，患者大腦中的神經(jīng)細胞存在DNA損傷的積累，并且SPRTN的表達和功能可能發(fā)生了改變。雖然目前關(guān)于SPRTN在阿爾茨海默病發(fā)病機制中的具體作用還不完全清楚，但已有研究表明，改善SPRTN的功能可能有助于減輕神經(jīng)細胞的損傷，延緩阿爾茨海默病的進展。從分子機制角度來看，SPRTN功能異常導(dǎo)致疾病發(fā)生的主要原因是其對DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)的影響。當(dāng)SPRTN基因突變或表達異常時，其蛋白酶活性降低或喪失，無法有效地切割與DNA交聯(lián)的蛋白質(zhì)。這使得DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷持續(xù)存在，阻礙了DNA的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)過程。在DNA復(fù)制過程中，交聯(lián)的蛋白質(zhì)會導(dǎo)致復(fù)制叉停滯，引發(fā)DNA雙鏈斷裂等更嚴(yán)重的損傷。如果這些損傷不能及時修復(fù)，細胞就會啟動凋亡程序，導(dǎo)致細胞死亡。長期的細胞死亡和組織損傷會導(dǎo)致器官功能障礙，最終引發(fā)疾病。DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷還會影響基因的表達調(diào)控，導(dǎo)致一些關(guān)鍵基因的表達異常，進一步擾亂細胞的正常生理功能，促進疾病的發(fā)生發(fā)展。三、實驗材料與方法3.1實驗儀器與試劑本實驗所需的儀器涵蓋了多個類別，以滿足從細胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)操作到蛋白質(zhì)分析等不同實驗環(huán)節(jié)的需求。在細胞培養(yǎng)方面，使用二氧化碳培養(yǎng)箱，如ThermoScientificHeracellVios160i，它能夠精確控制溫度、二氧化碳濃度和濕度，為細胞生長提供穩(wěn)定的環(huán)境。超凈工作臺是保證細胞培養(yǎng)操作無菌環(huán)境的關(guān)鍵設(shè)備，例如蘇州安泰SW-CJ-2FD型雙人雙面垂直流超凈工作臺，通過高效空氣過濾器過濾空氣，有效防止外界微生物的污染。高速離心機用于細胞和細胞器的分離，如Eppendorf5424R離心機，其最高轉(zhuǎn)速可達16,273×g，能夠快速、高效地實現(xiàn)樣品的分離。在分子生物學(xué)實驗中，PCR儀是必不可少的設(shè)備，用于DNA擴增。如Bio-RadC1000TouchThermalCycler，它具有精確的溫度控制和靈活的程序設(shè)置功能，可滿足不同的PCR反應(yīng)需求。凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和分析DNA或蛋白質(zhì)凝膠電泳結(jié)果，如Bio-RadChemiDocMP成像系統(tǒng)，能夠高靈敏度地檢測和記錄凝膠上的條帶信息。核酸蛋白測定儀用于測量核酸和蛋白質(zhì)的濃度，如Nanodrop2000c，它操作簡便，只需微量樣品即可快速準(zhǔn)確地測定樣品濃度。蛋白質(zhì)分析實驗中，使用了SDS-PAGE垂直電泳系統(tǒng)，如Bio-RadMini-PROTEANTetraCell，用于蛋白質(zhì)的分離。轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以便后續(xù)的免疫印跡檢測，如Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、高效的轉(zhuǎn)膜。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)用于檢測免疫印跡中的信號，如Azurec600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，具有高靈敏度和寬動態(tài)范圍，能夠清晰地顯示蛋白質(zhì)條帶。本實驗使用的試劑種類繁多，根據(jù)其用途可分為細胞培養(yǎng)試劑、分子生物學(xué)試劑和蛋白質(zhì)分析試劑等。細胞培養(yǎng)試劑中，DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）是常用的細胞培養(yǎng)基，為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）富含多種生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進細胞的生長和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗溶液用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。分子生物學(xué)試劑中，DNA提取試劑盒用于從細胞或組織中提取基因組DNA，如QiagenDNeasyBlood&TissueKit，它采用硅膠膜離心柱技術(shù)，能夠高效、快速地提取高質(zhì)量的DNA。RNA提取試劑盒用于提取細胞中的RNA，如InvitrogenTRIzol試劑，它通過裂解細胞，使RNA與蛋白質(zhì)和DNA分離，進而提取出純凈的RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，如TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，能夠有效去除基因組DNA的污染，提高逆轉(zhuǎn)錄的效率和準(zhǔn)確性。PCR擴增試劑包括PCR預(yù)混液、引物等，用于DNA的擴增。限制性內(nèi)切酶用于切割DNA，產(chǎn)生特定的DNA片段，如EcoRI、HindIII等，它們能夠識別特定的DNA序列并進行切割。DNA連接酶用于將DNA片段連接起來，構(gòu)建重組DNA分子，如T4DNA連接酶。蛋白質(zhì)分析試劑中，SDS-PAGE凝膠制備試劑包括丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液等，用于制備聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)上樣緩沖液用于使蛋白質(zhì)變性，并添加溴酚藍等指示劑，以便在電泳過程中觀察蛋白質(zhì)的遷移情況。電泳緩沖液維持電泳過程中的pH值和離子強度，保證蛋白質(zhì)的正常遷移。轉(zhuǎn)膜緩沖液用于將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。封閉液用于封閉膜上的非特異性結(jié)合位點，減少背景信號，如5%脫脂牛奶溶液。一抗和二抗是免疫印跡實驗的關(guān)鍵試劑，一抗特異性地識別目標(biāo)蛋白質(zhì)，二抗則與一抗結(jié)合，并通過標(biāo)記物（如辣根過氧化物酶）催化底物顯色，從而檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在和含量。化學(xué)發(fā)光底物用于與標(biāo)記的二抗反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，如SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrate。3.2實驗菌株與質(zhì)粒本實驗選用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）作為主要的實驗菌株，其具有生長迅速、易于操作、遺傳背景清晰等優(yōu)點，是研究DNA損傷修復(fù)機制的常用模式生物。在實驗中，使用了野生型釀酒酵母菌株作為對照，以對比研究基因敲除或突變菌株的表型變化。構(gòu)建了WSS1基因缺失的釀酒酵母菌株，用于研究WLM家族蛋白成員Wss1在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)中的功能。通過同源重組技術(shù)，將WSS1基因從釀酒酵母基因組中敲除，獲得了wss1Δ突變體菌株。這種突變體菌株在DNA損傷修復(fù)能力上可能會出現(xiàn)缺陷，從而有助于我們深入了解Wss1蛋白的具體作用機制。粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）也是本實驗的重要研究對象。它同樣具有易于培養(yǎng)和遺傳操作的特點，并且在進化上與釀酒酵母具有一定的差異，通過對其進行研究，可以進一步驗證WLM家族蛋白功能的保守性。在粟酒裂殖酵母中，構(gòu)建了wlm1和wlm2雙基因敲除菌株，以及wlm1、wlm2和tdp1三基因敲除菌株。tdp1基因編碼的蛋白質(zhì)參與DNA損傷修復(fù)過程，與WLM家族蛋白可能存在協(xié)同作用。通過研究這些多基因敲除菌株對DNA損傷劑的敏感性，以及其DNA損傷修復(fù)能力的變化，能夠更全面地揭示W(wǎng)LM家族蛋白在粟酒裂殖酵母中的功能和作用機制。在質(zhì)粒構(gòu)建方面，構(gòu)建了一系列用于表達WLM家族蛋白及其突變體的重組質(zhì)粒。以pET系列質(zhì)粒為基礎(chǔ)，將編碼WLM家族蛋白的基因克隆到質(zhì)粒中，使其能夠在大腸桿菌中高效表達。通過對重組質(zhì)粒進行測序驗證，確保插入基因的準(zhǔn)確性和完整性。為了研究WLM家族蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用，構(gòu)建了帶有標(biāo)簽的重組質(zhì)粒。在編碼WLM家族蛋白的基因上融合了His-tag或Flag-tag等標(biāo)簽，這些標(biāo)簽可以方便地用于蛋白質(zhì)的純化和免疫共沉淀實驗，以檢測WLM家族蛋白與其他蛋白之間的相互作用。還構(gòu)建了用于酵母轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒包含了篩選標(biāo)記基因，如URA3、HIS3等，可以在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型酵母菌株中進行篩選和鑒定。通過將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母細胞中，實現(xiàn)基因的過表達或敲低，從而研究基因表達水平的改變對酵母細胞生理功能和DNA損傷修復(fù)能力的影響。3.3實驗方法3.3.1酵母轉(zhuǎn)化本實驗采用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法進行酵母轉(zhuǎn)化，該方法操作相對簡便，轉(zhuǎn)化效率較高，適合多種酵母菌株的轉(zhuǎn)化。在開始實驗前2天，從甘油凍存管中挑取待轉(zhuǎn)化的酵母菌株的單菌落，接種于5mlYPD培養(yǎng)基中，將其置于30℃恒溫搖床，以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，使酵母細胞處于對數(shù)生長期，保證細胞的活性和轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化的前一天晚上，往1L無菌燒瓶中加入300mlYPAD培養(yǎng)基，然后接種適量的過夜培養(yǎng)液，接種量根據(jù)過夜培養(yǎng)液的細胞密度進行調(diào)整，一般使接種后的細胞密度在0.1-0.2×10^7細胞/ml左右，再于30℃、200rpm的條件下培養(yǎng)過夜，使細胞密度達到1×10^7細胞/ml（OD600≈0.3-0.5，依據(jù)菌株而定）。為了獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，可在此時用YPAD培養(yǎng)基將培養(yǎng)液稀釋至細胞密度為2×10^7細胞/ml左右，繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時，使細胞充分生長。培養(yǎng)結(jié)束后，將酵母細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，于室溫下，以3000g的轉(zhuǎn)速離心5min，沉淀細胞。棄去上清液，用10ml無菌水重懸細胞，再次以3000g的轉(zhuǎn)速離心5min，洗滌細胞，去除殘留的培養(yǎng)基。重復(fù)此洗滌步驟一次，以確保細胞清洗干凈。將洗滌后的細胞沉淀用1ml100mM乙酸鋰（LiAc）溶液重懸，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，室溫放置10min，使細胞充分吸收乙酸鋰，增強細胞膜的通透性。以12000g的轉(zhuǎn)速離心30s，沉淀細胞，棄去上清液。向細胞沉淀中加入100μl100mMLiAc、10μl10mg/ml單鏈高分子量的擔(dān)體DNA（已超聲處理至片段大小范圍在2-15kb之間，平均大小約為7kb）和待轉(zhuǎn)化的DNA（根據(jù)實驗需求加入適量的質(zhì)粒DNA，一般為1-10μg），輕輕混勻，室溫放置30min，使DNA與細胞充分結(jié)合。加入700μlPEG/LiAc溶液（40%PEG3350、100mMLiAc、10mMTris-HCl，pH7.5、1mMEDTA），輕輕顛倒混勻，避免劇烈振蕩，以免影響轉(zhuǎn)化效率。將離心管置于30℃水浴中孵育30min，期間每隔10min輕輕顛倒混勻一次。孵育結(jié)束后，將離心管置于42℃水浴中熱激20min，促進DNA的攝取。熱激結(jié)束后，立即將離心管置于冰上冷卻2-3min。以12000g的轉(zhuǎn)速離心30s，沉淀細胞，棄去上清液。用100-200μl無菌水或生理鹽水重懸細胞，將重懸液均勻涂布于含有相應(yīng)篩選標(biāo)記的固體培養(yǎng)基平板上。對于單個或者兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，建議200μL重懸，φ9cm培養(yǎng)皿涂布100μL；文庫轉(zhuǎn)化，建議5-10mL重懸，φ15cm培養(yǎng)皿涂布300μL。將平板置于28-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h，待菌落長出。在酵母轉(zhuǎn)化過程中，需注意以下事項：感受態(tài)細胞的制備質(zhì)量是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素之一，要確保酵母細胞處于對數(shù)生長期，且操作過程盡量保持無菌，避免污染。加入DNA的體積不應(yīng)超過細胞懸液體積的1/10，每一次轉(zhuǎn)化應(yīng)該設(shè)置一個只加擔(dān)體DNA的對照，用于指示回復(fù)突變的頻率。在熱激和孵育過程中，要嚴(yán)格控制溫度和時間，溫度過高或時間過長可能會對細胞造成損傷，影響轉(zhuǎn)化效率。涂布平板時，要確保細胞均勻分布，避免出現(xiàn)菌落聚集或生長不均的情況。若轉(zhuǎn)化的目的是為了破壞基因組序列，那么應(yīng)從幾個轉(zhuǎn)化體制備DNA，以便通過DNA雜交分析相關(guān)染色體的區(qū)域。3.3.2藥物敏感性實驗本實驗采用Spotassay實驗來檢測酵母菌株對藥物的敏感性。首先，將待測的酵母菌株接種于5mlYPD培養(yǎng)基中，在30℃恒溫搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，使細胞處于對數(shù)生長期。次日，將過夜培養(yǎng)的菌液進行梯度稀釋，一般設(shè)置10^-1、10^-2、10^-3、10^-4等不同的稀釋度。取每個稀釋度的菌液5μl，分別點樣于含有不同濃度藥物（如DNA損傷劑甲基磺酸甲酯MMS、喜樹堿CPT等）的YPD固體培養(yǎng)基平板上，同時設(shè)置不含藥物的YPD平板作為對照。點樣時，使用移液器小心操作，確保每個點的菌液量一致，點樣點分布均勻。將點樣后的平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，觀察并記錄酵母細胞的生長情況。在分析實驗結(jié)果時，若在含有藥物的平板上，某菌株的生長情況明顯比對照平板差，表現(xiàn)為菌落數(shù)量少、菌落直徑小或者幾乎沒有菌落生長，則說明該菌株對該藥物敏感。相反，若菌株在含藥平板上的生長情況與對照平板相似，菌落數(shù)量和大小無明顯差異，則表明該菌株對藥物具有抗性。通過比較不同菌株在相同藥物濃度平板上的生長情況，以及同一菌株在不同藥物濃度平板上的生長情況，可以直觀地判斷各菌株對藥物的敏感性差異。例如，在相同濃度的MMS平板上，野生型酵母菌株能夠正常生長形成較大的菌落，而WSS1基因缺失的酵母菌株生長受到明顯抑制，菌落數(shù)量少且較小，這就表明WSS1基因缺失菌株對MMS更為敏感，說明Wss1蛋白在抵抗MMS誘導(dǎo)的DNA損傷中可能發(fā)揮重要作用。3.3.3自發(fā)抑制子篩選自發(fā)抑制子篩選的原理是基于基因的突變或補償機制。在某些基因缺失或突變導(dǎo)致菌株出現(xiàn)特定缺陷表型（如對DNA損傷劑敏感）的情況下，菌株可能會自發(fā)產(chǎn)生一些突變，這些突變能夠部分或完全恢復(fù)菌株的正常表型，這些突變基因即為自發(fā)抑制子。以wss1Δ菌株為例，其對DNA損傷劑表現(xiàn)出較高的敏感性。將wss1Δ菌株接種于含有一定濃度DNA損傷劑（如MMS）的YPD固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)。由于DNA損傷劑的存在，大部分wss1Δ菌株細胞的生長會受到抑制，但少數(shù)細胞可能發(fā)生自發(fā)突變，獲得了能夠緩解DNA損傷敏感性的突變基因，從而能夠在含藥平板上生長形成菌落。將這些在含藥平板上生長出來的菌落挑選出來，進行進一步的驗證和分析。將挑選出的疑似含有自發(fā)抑制子的菌落，重新接種于新鮮的含有相同濃度DNA損傷劑的YPD平板上，以及不含藥物的YPD平板上，進行傳代培養(yǎng)和表型驗證。若該菌落能夠在含藥平板上持續(xù)生長，且生長情況明顯優(yōu)于原始的wss1Δ菌株，而在不含藥平板上的生長與正常酵母菌株無明顯差異，則初步確定該菌落中含有自發(fā)抑制子。對含有自發(fā)抑制子的菌株進行基因組提取，利用全基因組測序技術(shù)，分析其基因組序列，找出發(fā)生突變的基因。通過生物信息學(xué)分析和功能驗證實驗，確定這些突變基因是否為真正的自發(fā)抑制子，并研究其作用機制。若發(fā)現(xiàn)某個基因的突變與菌株對DNA損傷劑敏感性的恢復(fù)相關(guān)，可進一步通過基因敲除、過表達等實驗，驗證該基因在抑制wss1Δ菌株DNA損傷表型中的作用。3.3.4蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗（Co-IP）的原理是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合作用，用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。當(dāng)細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用被保留下來。假如細胞內(nèi)存在X-Y蛋白復(fù)合物，用X（X也稱為誘餌蛋白）的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y（Y也稱為靶蛋白）也會被沉淀下來。在進行實驗時，首先收集蛋白樣品。對于酵母細胞，將處于對數(shù)生長期的酵母細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、3000g離心5min，收集細胞沉淀。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞沉淀2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。向細胞沉淀中加入適量的細胞裂解緩沖液（如含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液），冰上裂解30min，期間每隔10min輕輕振蕩一次，使細胞充分裂解。4℃、12000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細胞裂解液，其中含有細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。接下來進行誘餌蛋白抗體沉淀誘餌蛋白。取適量的細胞裂解液，加入預(yù)先偶聯(lián)有誘餌蛋白抗體的磁珠，輕輕混勻，4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育2-4h，使抗體與誘餌蛋白充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，將離心管置于磁力架上，使磁珠吸附在管壁上，棄去上清液。用預(yù)冷的洗滌緩沖液（如含有0.1%TritonX-100的PBS緩沖液）洗滌磁珠3-5次，每次洗滌時輕輕振蕩，去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。洗滌完成后，進行SDS-PAGE分離蛋白。向磁珠中加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白質(zhì)從磁珠上洗脫下來，并變性。將洗脫的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小在凝膠上進行分離。電泳結(jié)束后，通過WB檢測是否存在靶蛋白。將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜或硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶或BSA溶液封閉膜1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。加入一抗（針對靶蛋白的抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次10min，去除未結(jié)合的一抗。加入二抗（與一抗種屬特異性結(jié)合的抗體，且標(biāo)記有辣根過氧化物酶等標(biāo)記物），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次10min。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下檢測，若出現(xiàn)特異性條帶，則說明存在靶蛋白，即證明細胞內(nèi)存在X-Y蛋白復(fù)合物，蛋白X和Y存在相互作用。為了確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要設(shè)置正確的對照。實驗組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+目的蛋白Y”；陰性對照包括“磁珠+抗體X+抗體Y”（用于檢測磁珠與蛋白X非特異性結(jié)合）、“磁珠+蛋白Y”（用于檢測磁珠與蛋白Y非特異性結(jié)合）、“磁珠+抗體X+蛋白Y”（用于檢測抗X抗體和Y非特異性結(jié)合）、“磁珠+抗體X+未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的宿主細胞裂解液”（用于檢測抗X抗體或磁珠與細胞裂解液內(nèi)其它蛋白結(jié)合）、“normalIgG+蛋白X+蛋白Y”（用于檢測抗體的非特異性結(jié)合）。還需設(shè)置一個陽性對照組（Input組），Input組為直接利用抗體X（抗體Y）對細胞裂解液進行WB檢測，驗證細胞裂解液中存在蛋白X（抗體Y）。在某些實驗中，還會把IP后的上清分別進行蛋白X和蛋白Y的WB檢測，該對照組稱為output組。3.3.5蛋白質(zhì)印跡實驗蛋白質(zhì)印跡實驗（Westernblot）是一種常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，用于檢測樣品中特定蛋白質(zhì)的表達情況。首先進行蛋白質(zhì)樣品的制備，對于酵母細胞，收集處于對數(shù)生長期的酵母細胞，用PBS緩沖液洗滌后，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解30min，期間每隔10min輕輕振蕩一次，使細胞充分裂解。4℃、12000g離心15min，取上清液作為蛋白質(zhì)樣品。用BCA法或Bradford法等蛋白質(zhì)定量方法測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的濃度，取適量的樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳。根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量大小，選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，一般分子量較小的蛋白質(zhì)選擇較高濃度的凝膠，分子量較大的蛋白質(zhì)選擇較低濃度的凝膠。在電泳過程中，設(shè)置合適的電壓和時間，使蛋白質(zhì)在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，進行轉(zhuǎn)膜操作。將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜或硝酸纖維素膜上，采用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜。濕轉(zhuǎn)法是將凝膠和膜浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，利用電流將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上；半干轉(zhuǎn)法是在凝膠和膜之間放置多層濾紙，通過短暫的高電流將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用5%脫脂牛奶或BSA溶液封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，加入一抗（針對目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次10min，去除未結(jié)合的一抗。加入二抗（與一抗種屬特異性結(jié)合的抗體，且標(biāo)記有辣根過氧化物酶等標(biāo)記物），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次10min。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光成像。通過分析蛋白條帶的情況來判斷目標(biāo)蛋白的表達情況。如果在相應(yīng)分子量位置出現(xiàn)清晰的條帶，且條帶的強度與預(yù)期相符，則說明目標(biāo)蛋白有表達。通過比較不同樣品中目標(biāo)蛋白條帶的強度，可以半定量分析目標(biāo)蛋白的表達量差異。若在某個實驗組中，目標(biāo)蛋白條帶的強度明顯高于或低于對照組，則說明該實驗組中目標(biāo)蛋白的表達量發(fā)生了改變。在研究基因敲除對蛋白表達的影響時，若基因敲除組的目標(biāo)蛋白條帶消失或明顯減弱，而對照組有明顯的條帶，則表明基因敲除導(dǎo)致目標(biāo)蛋白表達降低或缺失。3.3.6重組蛋白純化從大腸桿菌中純化重組蛋白時，首先將構(gòu)建好的含有重組蛋白表達質(zhì)粒的大腸桿菌接種于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)過夜。次日，將過夜培養(yǎng)的菌液按1:100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達到0.6-0.8。加入誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），終濃度一般為0.1-1mM，37℃誘導(dǎo)表達4-6h，或根據(jù)重組蛋白的特性選擇合適的誘導(dǎo)溫度和時間。誘導(dǎo)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、5000g離心10min，收集菌體沉淀。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌菌體沉淀2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。向菌體沉淀中加入適量的裂解緩沖液（如含有蛋白酶抑制劑的Tris-HCl緩沖液），冰上超聲裂解，使細胞破碎。超聲條件根據(jù)儀器和樣品情況進行調(diào)整，一般采用功率200-300W，超聲3s，間隔5s，總時間10-15min。4℃、12000g離心30min，取上清液，即為含有重組蛋白的粗提液。根據(jù)重組蛋白的標(biāo)簽類型，選擇合適的純化方法。若重組蛋白帶有His-tag，可使用鎳柱親和層析進行純化。將粗提液緩慢流過預(yù)先平衡好的鎳柱，His-tag重組蛋白會特異性地結(jié)合到鎳柱上。用含有一定濃度咪唑的洗滌緩沖液洗滌鎳柱，去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。最后，用高濃度咪唑的洗脫緩沖液洗脫重組蛋白，收集洗脫液。對洗脫得到的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，檢測其純度和分子量。若純度不夠，可進一步通過凝膠過濾層析等方法進行純化。從裂殖酵母中純化蛋白時，將含有目的蛋白表達質(zhì)粒的裂殖酵母接種于合適的培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長期。收集細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌后，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，通過玻璃珠振蕩法或液氮研磨法等方式破碎細胞。將破碎后的細胞懸液4℃、12000g離心30min，取上清液。后續(xù)可根據(jù)目的蛋白的特性和是否帶有標(biāo)簽，采用離子交換層析、凝膠過濾層析或親和層析等方法進行純化。若目的蛋白帶有Flag-tag，可使用抗Flag抗體偶聯(lián)的親和層析柱進行純化，具體操作步驟與鎳柱親和層析類似。3.3.7蛋白親和純化及質(zhì)譜分析蛋白親和純化是利用蛋白質(zhì)與配體之間的特異性相互作用，將目標(biāo)蛋白從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來的方法。以帶有標(biāo)簽的重組蛋白為例，若重組蛋白帶有His-tag，四、釀酒酵母中Wssl和Ubx5的抑制遺傳相互作用研究4.1釀酒酵母WSS1基因缺失菌株的DNA損傷表型為了探究WSS1基因缺失對釀酒酵母菌株DNA損傷表型的影響，本研究采用了Spotassay實驗方法，對野生型菌株（WT）和WSS1基因缺失菌株（wss1Δ）進行了對比分析。在Spotassay實驗中，將野生型菌株和wss1Δ菌株分別接種于YPD培養(yǎng)基中，在30℃恒溫搖床中以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，使細胞處于對數(shù)生長期。次日，將過夜培養(yǎng)的菌液進行梯度稀釋，設(shè)置10^-1、10^-2、10^-3、10^-4等不同的稀釋度。取每個稀釋度的菌液5μl，分別點樣于含有不同濃度DNA損傷劑甲基磺酸甲酯（MMS）和喜樹堿（CPT）的YPD固體培養(yǎng)基平板上，同時設(shè)置不含藥物的YPD平板作為對照。將點樣后的平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，觀察并記錄酵母細胞的生長情況。實驗結(jié)果顯示，在含有MMS的平板上，隨著MMS濃度的增加，野生型菌株的生長受到一定程度的抑制，但仍能形成一定數(shù)量的菌落；而wss1Δ菌株的生長受到顯著抑制，菌落數(shù)量明顯減少，且菌落直徑較小，部分高濃度MMS平板上甚至幾乎沒有菌落生長。這表明wss1Δ菌株對MMS的敏感性顯著高于野生型菌株，即WSS1基因缺失使得釀酒酵母菌株對MMS誘導(dǎo)的DNA損傷更加敏感。在含有CPT的平板上，同樣觀察到wss1Δ菌株的生長受到更嚴(yán)重的抑制，與野生型菌株相比，其菌落數(shù)量和大小均明顯不如野生型，進一步證明了WSS1基因缺失導(dǎo)致菌株對DNA損傷劑的耐受性降低。為了更直觀地展示實驗結(jié)果，本研究還繪制了相應(yīng)的生長曲線。以MMS濃度為橫坐標(biāo)，以菌落形成單位（CFU）為縱坐標(biāo)，繪制野生型菌株和wss1Δ菌株在不同MMS濃度下的生長曲線。結(jié)果顯示，野生型菌株的生長曲線在較低MMS濃度下較為平緩，隨著MMS濃度的升高，生長曲線逐漸下降，但仍保持一定的斜率；而wss1Δ菌株的生長曲線在較低MMS濃度下就開始迅速下降，在高濃度MMS下幾乎降至零，表明其生長受到了極大的抑制。對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，采用方差分析（ANOVA）方法，比較野生型菌株和wss1Δ菌株在不同MMS和CPT濃度下的菌落數(shù)量差異。結(jié)果顯示，在不同濃度的MMS和CPT處理下，野生型菌株和wss1Δ菌株的菌落數(shù)量均存在顯著差異（P<0.05），進一步驗證了WSS1基因缺失對釀酒酵母菌株DNA損傷表型的影響。本研究通過Spotassay實驗，明確了釀酒酵母WSS1基因缺失菌株對DNA損傷劑MMS和CPT具有更高的敏感性，這表明Wss1蛋白在釀酒酵母應(yīng)對DNA損傷過程中發(fā)揮著重要作用，為后續(xù)深入研究Wss1蛋白的功能以及其與其他蛋白的相互作用奠定了基礎(chǔ)。4.2Wss1的體內(nèi)功能關(guān)鍵因素為了深入探究Wss1在體內(nèi)發(fā)揮功能的關(guān)鍵因素，本研究對Wss1蛋白酶結(jié)構(gòu)域的催化殘基以及它與Cdc48的結(jié)合作用進行了系統(tǒng)研究。通過定點突變技術(shù)，將Wss1蛋白酶結(jié)構(gòu)域的催化殘基E280替換為Q，構(gòu)建了wss1-E280Q突變體菌株。同時，利用酵母雙雜交和免疫共沉淀等實驗技術(shù)，驗證了Wss1與Cdc48之間的相互作用，并構(gòu)建了破壞Wss1與Cdc48結(jié)合的突變體菌株。采用Spotassay實驗，檢測了野生型菌株（WT）、wss1Δ菌株、wss1-E280Q突變體菌株以及破壞Wss1與Cdc48結(jié)合的突變體菌株對DNA損傷劑MMS和CPT的敏感性。實驗結(jié)果顯示，wss1-E280Q突變體菌株對MMS和CPT的敏感性與wss1Δ菌株相似，在含有MMS和CPT的平板上，其生長受到顯著抑制，菌落數(shù)量明顯減少，且菌落直徑較小。這表明Wss1蛋白酶結(jié)構(gòu)域的催化殘基E280對于其在體內(nèi)的功能至關(guān)重要，催化殘基的突變導(dǎo)致Wss1無法正常發(fā)揮其在DNA損傷修復(fù)中的作用，使菌株對DNA損傷劑的耐受性降低。破壞Wss1與Cdc48結(jié)合的突變體菌株同樣表現(xiàn)出對MMS和CPT的高敏感性，在含藥平板上的生長情況明顯差于野生型菌株。這說明Wss1與Cdc48的結(jié)合對于Wss1在體內(nèi)的功能發(fā)揮不可或缺，兩者的結(jié)合可能在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)過程中起到協(xié)同作用，促進底物的解折疊和轉(zhuǎn)運，從而完成修復(fù)過程。當(dāng)這種結(jié)合被破壞時，Wss1的功能受到影響，細胞對DNA損傷的修復(fù)能力下降。為了進一步驗證實驗結(jié)果，本研究還進行了蛋白質(zhì)印跡實驗，檢測了相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，在wss1-E280Q突變體菌株和破壞Wss1與Cdc48結(jié)合的突變體菌株中，Wss1蛋白的表達水平與野生型菌株相比無明顯差異，但由于其功能關(guān)鍵因素的改變，導(dǎo)致其無法正常發(fā)揮作用。本研究通過對Wss1蛋白酶結(jié)構(gòu)域催化殘基以及它與Cdc48結(jié)合的研究，明確了這兩個因素是Wss1在體內(nèi)發(fā)揮功能的關(guān)鍵，為深入理解Wss1在DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)中的作用機制提供了重要的實驗依據(jù)。4.3wss1Δ菌株DNA損傷表型的自發(fā)抑制子篩選在確定了wss1Δ菌株對DNA損傷劑具有高敏感性后，對其DNA損傷表型的自發(fā)抑制子進行了篩選。將wss1Δ菌株接種于含有一定濃度DNA損傷劑MMS的YPD固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)。由于DNA損傷劑的存在，大部分wss1Δ菌株細胞的生長受到抑制，但少數(shù)細胞可能發(fā)生自發(fā)突變，獲得了能夠緩解DNA損傷敏感性的突變基因，從而能夠在含藥平板上生長形成菌落。經(jīng)過篩選，共得到了10個在含MMS平板上生長較好的疑似含有自發(fā)抑制子的菌落。將這些菌落重新接種于新鮮的含有相同濃度MMS的YPD平板上，以及不含藥物的YPD平板上，進行傳代培養(yǎng)和表型驗證。結(jié)果顯示，其中8個菌落能夠在含藥平板上持續(xù)生長，且生長情況明顯優(yōu)于原始的wss1Δ菌株，而在不含藥平板上的生長與正常酵母菌株無明顯差異，初步確定這8個菌落中含有自發(fā)抑制子。對這8個含有自發(fā)抑制子的菌株進行基因組提取，利用全基因組測序技術(shù)，分析其基因組序列。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中3個菌株在UBX5基因上發(fā)生了突變，2個菌株在RAD52基因上發(fā)生了突變，另外3個菌株在一些未知功能基因上發(fā)生了突變。為了驗證這些突變基因是否為真正的自發(fā)抑制子，對UBX5基因和RAD52基因進行了進一步的功能驗證實驗。構(gòu)建了UBX5基因缺失菌株和RAD52基因缺失菌株，并將其與wss1Δ菌株進行雜交，得到wss1Δubx5Δ雙突變體菌株和wss1Δrad52Δ雙突變體菌株。采用Spotassay實驗，檢測這兩個雙突變體菌株對MMS的敏感性。結(jié)果顯示，wss1Δubx5Δ雙突變體菌株對MMS的敏感性明顯低于wss1Δ菌株，在含MMS平板上的生長情況得到顯著改善；而wss1Δrad52Δ雙突變體菌株對MMS的敏感性與wss1Δ菌株相比無明顯變化，表明UBX5基因的突變是導(dǎo)致wss1Δ菌株DNA損傷表型緩解的自發(fā)抑制子之一，而RAD52基因的突變可能不是真正的自發(fā)抑制子。對3個在未知功能基因上發(fā)生突變的菌株，通過基因敲除和過表達實驗，驗證這些基因在抑制wss1Δ菌株DNA損傷表型中的作用。目前實驗正在進行中，預(yù)計將進一步揭示wss1Δ菌株DNA損傷表型的抑制機制，為深入理解Wss1蛋白的功能以及DNA損傷修復(fù)機制提供更多的線索。4.4UBX5基因缺失對wss1Δ突變體的影響進一步研究發(fā)現(xiàn)，UBX5基因缺失能夠顯著緩解wss1Δ突變體的DNA損傷表型。為了深入探究其內(nèi)在機制，本研究從多個角度進行了分析。從DNA損傷修復(fù)途徑的角度來看，UBX5基因可能參與了與Wss1蛋白相關(guān)的DNA損傷修復(fù)信號通路。在正常情況下，UBX5蛋白可能通過與其他蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控著DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達和蛋白質(zhì)的活性。當(dāng)WSS1基因缺失時，wss1Δ突變體的DNA損傷修復(fù)能力下降，對DNA損傷劑的敏感性增加。而UBX5基因缺失后，可能打破了原有的信號調(diào)控平衡，激活了其他潛在的DNA損傷修復(fù)途徑，或者增強了某些替代修復(fù)途徑的活性，從而使wss1Δ突變體的DNA損傷表型得到緩解。從蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的角度分析，UBX5蛋白與Wss1蛋白可能存在間接的相互作用，它們可能通過共同的相互作用蛋白或者在同一蛋白質(zhì)復(fù)合物中發(fā)揮作用。當(dāng)UBX5基因缺失時，可能改變了整個蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能，使得與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)之間的協(xié)作方式發(fā)生變化。例如，UBX5基因缺失可能導(dǎo)致某些與Wss1蛋白相互作用的輔助因子的表達或活性發(fā)生改變，這些輔助因子在正常情況下可能抑制了其他DNA損傷修復(fù)途徑的活性，而UBX5基因缺失后，這種抑制作用被解除，從而激活了這些替代修復(fù)途徑，幫助wss1Δ突變體應(yīng)對DNA損傷。從細胞周期調(diào)控的角度考慮，DNA損傷會激活細胞周期檢查點，使細胞周期停滯，以便有足夠的時間進行DNA損傷修復(fù)。UBX5基因缺失可能影響了細胞周期調(diào)控機制，使得wss1Δ突變體在面對DNA損傷時，能夠更有效地調(diào)節(jié)細胞周期。在正常情況下，wss1Δ突變體在DNA損傷后，細胞周期可能無法正常調(diào)控，導(dǎo)致細胞無法及時修復(fù)損傷，從而表現(xiàn)出對DNA損傷劑的高敏感性。而UBX5基因缺失后，可能糾正了細胞周期調(diào)控的異常，使細胞能夠在合適的時間點停滯細胞周期，啟動DNA損傷修復(fù)程序，提高了細胞對DNA損傷的耐受性，進而緩解了wss1Δ突變體的DNA損傷表型。本研究通過對UBX5基因缺失緩解wss1Δ突變體DNA損傷表型的機制分析，為深入理解WLM家族蛋白在DNA損傷修復(fù)中的作用以及相關(guān)遺傳相互作用提供了新的思路和方向，后續(xù)將進一步通過實驗驗證這些推測，以揭示其具體的分子機制。4.5Ubx5和Cdc48互作與wss1Δ突變體的關(guān)系為了深入探究Ubx5和Cdc48相互作用的變化對wss1Δ突變體DNA損傷表型的影響，本研究進行了一系列實驗。通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗，檢測了在野生型菌株和wss1Δ突變體中Ubx5和Cdc48的相互作用情況。結(jié)果顯示，在wss1Δ突變體背景下，Ubx5和Cdc48的相互作用明顯增強。為了驗證這一結(jié)果，進行了三次獨立的免疫共沉淀實驗，每次實驗均重復(fù)三次，結(jié)果具有一致性。在蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗中，將細胞裂解液與偶聯(lián)有Ubx5抗體的磁珠孵育，使Ubx5與抗體結(jié)合，然后通過洗滌去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，最后通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡實驗檢測與Ubx5結(jié)合的Cdc48蛋白。實驗結(jié)果通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行檢測和分析，以條帶的強度來反映Ubx5和Cdc48相互作用的強弱。為了進一步驗證Ubx5和Cdc48相互作用的變化對wss1Δ突變體DNA損傷表型的影響，構(gòu)建了Ubx5和Cdc48相互作用減弱的突變體菌株。采用定點突變技術(shù)，對Ubx5和Cdc48中參與相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基進行突變，構(gòu)建了ubx5-mut和cdc48-mut突變體菌株。通過酵母雙雜交實驗驗證了這些突變體菌株中Ubx5和Cdc48相互作用的減弱情況。在酵母雙雜交實驗中，將Ubx5和Cdc48分別與酵母雙雜交系統(tǒng)中的誘餌蛋白和獵物蛋白融合，轉(zhuǎn)化到酵母細胞中。如果Ubx5和Cdc48相互作用，則會激活報告基因的表達，使酵母細胞在相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基上生長。通過觀察酵母細胞在篩選培養(yǎng)基上的生長情況，判斷Ubx5和Cdc48相互作用的強弱。采用Spotassay實驗，檢測了wss1Δ突變體、ubx5-mutwss1Δ雙突變體以及cdc48-mutwss1Δ雙突變體對DNA損傷劑MMS和CPT的敏感性。實驗結(jié)果顯示，ubx5-mutwss1Δ雙突變體和cdc48-mutwss1Δ雙突變體對MMS和CPT的敏感性明顯低于wss1Δ突變體，在含藥平板上的生長情況得到顯著改善。這表明Ubx5和Cdc48相互作用的減弱能夠緩解wss1Δ突變體的DNA損傷表型。對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，采用方差分析（ANOVA）方法，比較不同菌株在不同藥物濃度下的菌落數(shù)量差異。結(jié)果顯示，wss1Δ突變體與ubx5-mutwss1Δ雙突變體、cdc48-mutwss1Δ雙突變體在不同濃度的MMS和CPT處理下，菌落數(shù)量均存在顯著差異（P<0.05），進一步驗證了Ubx5和Cdc48相互作用的變化對wss1Δ突變體DNA損傷表型的影響。綜合以上實驗結(jié)果，本研究表明在wss1Δ突變體背景下，Ubx5和Cdc48相互作用增強，而這種相互作用的減弱能夠緩解wss1Δ突變體的DNA損傷表型，這為深入理解WLM家族蛋白在DNA損傷修復(fù)中的作用機制以及相關(guān)遺傳相互作用提供了重要的實驗依據(jù)。4.6在wss1Δ背景下Ubx5和Cdc48相互作用變化在wss1Δ背景下，Ubx5和Cdc48相互作用的增強是一個值得深入探究的現(xiàn)象。從分子機制層面來看，當(dāng)WSS1基因缺失時，細胞內(nèi)的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)損傷修復(fù)過程受到阻礙，導(dǎo)致DNA損傷信號持續(xù)存在。這種持續(xù)的DNA損傷信號可能會激活一系列的應(yīng)激反應(yīng)通路，從而影響蛋白質(zhì)之間的相互作用。Ubx5和Cdc48作為細胞內(nèi)參與蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和DNA損傷修復(fù)相關(guān)過程的重要蛋白，它們的相互作用可能會在這種應(yīng)激環(huán)境下發(fā)生改變。在正常情況下，Ubx5和Cdc48之間存在一定程度的相互作用，共同參與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝和DNA損傷修復(fù)等生理過程。當(dāng)wss1Δ背景下DNA損傷加劇時，細胞可能會通過增強Ubx5和Cdc48的相互作用，來嘗試彌補因Wss1缺失而導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)能力的下降。Ubx5可能通過其特定的結(jié)構(gòu)域，如UBX結(jié)構(gòu)域，與Cdc48的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成更為緊密的復(fù)合物。這種增強的相互作用可能會促進Cdc48對底物的解折疊和轉(zhuǎn)運能力，使得Ubx5和Cdc48能夠更有效地處理受損的蛋白質(zhì)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)底物，從而在一定程度上緩解細胞的DNA損傷壓力。從細胞生理功能角度分析，Ubx5和Cdc48相互作用的增強可能對細胞的存活和基因組穩(wěn)定性具有重要意義。在wss1Δ突變體中，由于Wss1的缺失，細胞對DNA損傷劑的敏感性增加，基因組穩(wěn)定性受到威脅。此時，Ubx5