《藥品微生物檢驗技術》模塊二藥品安全性檢查項目一無菌檢查

任務一氯化鈉注射液無菌檢查-直接接種法

任務二喜炎平注射液無菌檢查-薄膜過濾法

目錄項目二無菌檢查任務一氯化鈉注射液無菌檢查-直接接種法

任務引入請思考氯化鈉注射液的主要作用是補充電解質，調節體內的水、電解質平衡。很多藥物需要溶解在氯化鈉注射液中，才能進行肌內注射或者靜脈注射，并直接進入血液循環。對氯化鈉注射液有什么要求呢？

現有一批氯化鈉注射液，需按照抽樣標準抽取一定數量并對這一批抽檢品是否無菌進行判斷。任務分析本任務以氯化鈉注射液作為研究對象，介紹氯化鈉注射液無菌檢查方法及操作，工作內容及要求見下表。

無菌檢查法的檢查對象是《中國藥典》２０２０年版要求無菌的藥品、生物制品、醫療器械、原料、輔料及其他品種。相關知識-無菌檢查法檢查對象

單向流空氣區域、工作臺面及受控環境應定期按醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現行國家標準進行潔凈度確認。檢查環境

無菌檢查可以確保藥品的質量，間接反映藥品生產企業的生產條件、工藝方法和管理水平，反映藥物不同產地、不同批次之間的質量差異。檢查意義本次任務所用的方法是直接接種法，即通過無菌操作技術將供試品直接接種至相應培養基上，給予供試品中細菌、真菌充分的營養物質與適宜的生長環境，使微生物從單個狀態培養成肉眼可見的菌群。相關知識-直接接種法

直接接種法硫乙醇酸鹽流體培養基主要用于厭氧菌的培養，也可用于需氧菌的培養；相關知識-檢查用培養基

胰酪大豆胨液體培養基用于真菌和需氧菌的培養。任務實施一、制訂工作計劃序號工作內容完成時間成員負責人1培養基制備

2培養基無菌檢查

3培養基靈敏度檢查

4方法適用性試驗5供試品接種6對照試驗7培養及觀察8結果判斷根據任務要求，制定合理工作進度計劃，并根據小組成員的特點進行分工。任務實施二、試驗前準備設備、器材、試劑規格數量用途無菌室

操作場所超凈工作臺

操作區域酒精燈

局部無菌環境75%乙醇

擦拭消毒氯化鈉注射液

供試品培養基

提供營養物質移液器

定量移取供試品試管、試管架

容器、支架培養箱

微生物培養菌種

靈敏度檢查、陽性對照任務實施三、試驗操作培養基的制備依據培養基培養及制備要求，按照計算用量-稱量-溶解-調pH值-分裝-滅菌完成。注意特殊物質的溶解方式及順序，注意分裝是培養基裝量的高度。

計算用量

稱量

溶解

調pH值

分裝

滅菌任務實施三、試驗操作培養基的無菌檢查制備好的培養基每批隨機取不少于５支（瓶），放至相應培養箱中培養１４天，觀察培養基狀態。如果培養基混濁，則表明培養基有菌，不能用；如果培養基澄清，則表明培養基無菌，符合培養基無菌檢查標準。任務實施三、試驗操作培養基的靈敏度檢查菌懸液制備培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過５代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為第０代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存和確認，以保證試驗菌株的生物學特性。任務實施三、試驗操作培養基的靈敏度檢查菌種培養基培養時間制備方式金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種其新鮮培養物至胰酪大豆胨液體培養基中或胰酪大豆胨瓊脂培養基上３０～３５℃培養１８～２４小時上述培養物用ｐＨ7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液或0.9％無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液生孢梭菌接種其新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中白色念珠菌接種其新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養基上２０～２５℃培養２～３天黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上２０～２５℃培養５～７天或直到獲得豐富的孢子加入適量含0.05％（ｍＬ／ｍＬ）聚山梨酯80的ｐＨ7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液將孢子洗脫。任務實施三、試驗操作培養基靈敏度檢查操作培養基名稱接種菌種試管數空白對照培養時間結果判斷硫乙醇酸鹽流體培養基（３０～３５℃培養）不大于１００ｃｆｕ的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌每種菌種各２支１支不接種菌種的硫乙醇酸鹽流體培養基接種細菌的培養基管培養時間不超過３天，接種真菌的培養基管培養時間不得超過５天空白對照管應無菌生長。若加菌的培養基管均生長良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。如果加菌培養基管有無菌生長的現象，則培養基的靈敏度檢查不符合規定，不能使用胰酪大豆胨液體培養基（２０～２５℃培養）不大于１００ｃｆｕ的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉每種菌種各２支１支不接種菌種的胰酪大豆胨液體培養基任務實施三、試驗操作方法適用性試驗方法適用性試驗的意義進行產品無菌檢查時，應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產品的無菌檢查。若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果，應重新進行方法適用性試驗。方法適用性試驗對每一試驗菌應逐一進行方法確認。任務實施三、試驗操作方法適用性試驗-操作培養基名稱接種菌種接種方法培養硫乙醇酸鹽流體培養基不大于１００ｃｆｕ的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌每種菌種各２管，其中１管接入每支培養基規定的供試品接種量，另１管作為對照置于３０～３５℃培養箱，其中生孢梭菌需置于厭氧培養箱中，培養時間不得超過５天胰酪大豆胨液體培養基不大于１００ｃｆｕ的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉置于２０～２５℃培養箱，培養時間不得超過５天結果判斷１與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，可照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查２如含供試品的任一容器中試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加培養基用量、使用中和劑或滅活劑等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗任務實施三、試驗操作供試品的取樣檢驗數量

檢驗數量指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量。除另有規定外，出廠產品及上市產品按《中國藥典》２０２０年版最少檢驗數量規定進行抽樣。檢驗量

檢驗量即一次試驗所用的供試品數量（ｇ、ｍＬ或ｃｍ２）。若每支（瓶）供試品的裝量按規定足夠接種兩種培養基，則應分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基。任務實施三、試驗操作供試品的取樣樣品的抽樣要求：

１）須采用無菌操作技術在具有無菌條件的特定區域中進行取樣，防止樣品受到微生物污染而出現假陽性的結果。２）應監測抽樣環境并記錄，同時記錄采樣時間。３）抽樣的任何消毒過程（如抽樣點的消毒）不能影響樣品中微生物的檢出。４）所抽樣品應有清晰標識，注明樣品名稱、批號、抽樣日期、采樣容器、抽樣人等信息。任務實施三、試驗操作供試品的處理與接種除生物制品外，一般樣品無菌檢查時兩種培養基接種的瓶或支數相等；生物制品無菌檢查時硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基接種的瓶或支數為２∶１。除另有規定外，每個容器中培養基接種的供試品體積不得大于培養基體積的10％，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少于15ｍＬ，胰酪大豆胨液體培養基每管裝量不少于10ｍＬ。任務實施三、試驗操作供試品的處理與接種氯化鈉注射液接種操作培養基供試品陽性對照陰性對照培養條件硫乙醇酸鹽流體培養基氯化鈉注射液分別接種與供試品等量的金黃色葡萄球菌（不大于100cfu）至培養基中未接種的培養基３０～３５℃培養１４天胰酪大豆胨液體培養基２０～２５℃培養１４天任務實施四、結果判斷結果觀察培養期間應定期觀察，并記錄是否有菌生長。若在加入供試品后或在培養過程中，培養基出現混濁，培養14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液不少于１ｍＬ轉種至同種新鮮培養基中，將原始培養物和新接種的培養基繼續培養不少于４天，觀察接種的同種新鮮培養基是否再出現混蝕；或取培養液（物）涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時做菌種鑒定。陽性對照管所接種菌應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則試驗無效。任務實施四、結果判斷結果觀察只有符合下列至少一個條件時，方可認為試驗無效：（１）無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求。（２）回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物污染的因素。（３）在陰性對照中觀察到微生物生長。（４）供試品管中生長的微生物經鑒定后，確證是無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。項目二無菌檢查任務二喜炎平注射液無菌檢查-薄膜過濾法

任務引入請思考喜炎平注射液是直接輸入靜脈的液體滅菌制劑，通常包裝于玻璃瓶、塑料瓶或軟袋中，使用時通過輸液器持續滴注輸入靜脈。喜炎平注射液成分中有穿心蓮內酯磺化物，穿心蓮內酯能清熱解毒、消炎止痛，具有一定抑菌作用。現有一批喜炎平注射液，需按照抽樣標準抽取一定數量并對這一批抽檢品是否無菌進行判斷。。任務分析（１）喜炎平注射液中可能存在的微生物包括細菌、真菌。硫乙醇酸鹽流體培養基主要用于厭氧菌的培養，也可用于需氧菌的培養；胰酪大豆胨液體培養基用于真菌和需氧菌的培養。（２）按照培養基配方完成培養基制備，對培養基進行無菌檢查、靈敏度檢查，確認培養基適用于該試驗后，該培養基才能被采用。任務分析直接接種法與薄膜過濾法優、缺點比較方法優點缺點直接接種法供試品用量較少，比較節約不能有效除去供試品中的抑菌成分，易出現假陰性結果薄膜過濾法操作環境相對封閉，可以有效減少外部環境的影響；能有效除去抑菌成分的影響，適用于含抑菌成分的供試品檢查消耗的供試品量較多任務分析（４）薄膜過濾法采用無菌操作技術將供試品通過集菌儀過濾后再加入相應培養基中培養、觀察，需要進行方法適用性試驗，以確認該方法適用于喜炎平注射液的無菌檢查。（５）按照《中國藥典》２０２０年版規定，確定喜炎平注射液的檢驗數量、檢驗量，保證供試品抽樣的客觀性，在無菌室中完成供試品檢查。放置相應培養箱培養，通過觀察培養基是混濁還是澄清來判斷供試品是否合格。

薄膜過濾法:一般采用封閉式薄膜過濾器,根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45μｍ，濾膜直徑約為50ｍｍ。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。采用無菌操作技術使供試液通過集菌儀，供試品中可能存在的微生物被截留收集在濾膜上，通過沖洗液沖洗濾膜除去供試品中的抑菌成分。把所需培養基通過進樣管道直接注入集菌培養器中，放置規定的培養箱中培養、觀察，以檢驗供試品是否無菌。相關知識-薄膜過濾法

薄膜過濾法全封閉預滅菌不易受污染相關知識-集菌儀的使用集菌儀的操作過程：（１）取出一次性培養器，確認包裝完好后在無菌室內打開無菌包裝。（２）將一次性培養器逐個插放在不銹鋼排液槽上。（３）將一次性培養器的彈性軟管裝入集菌儀的蠕動泵頭，要求定位準確，軟管走勢順暢。（４）將進樣針插入樣品中，啟動集菌儀，過濾集菌。若樣品中含有抑菌物質，應用適量緩沖液沖洗濾膜，方法與集菌過程相同。相關知識-集菌儀的使用（５）完成集菌后，開啟已滅菌的培養基，插入針頭。（６）摘下一次性培養器頂部空氣濾器開口的膠塞，套在一次性培養器的底口上，泵入相應的培養基。（７）用夾子夾閉與一次性培養器連接部的軟管，留出５～６ｃｍ，剪除其余部分，并將開口端插在空氣濾器的開口上。（８）將培養器置于培養箱中培養并觀察。相關知識-集菌儀的使用集菌儀使用注意事項（１）在集菌儀泵頭扣緊之前，嚴禁啟動開關，否則可能導致手部受傷。（２）若無菌室采用化學消毒劑消毒，應將儀器移至封閉罩內或搬出無菌室，以免損壞電子部件和儀器表面。（３）在進樣針插入瓶裝流體樣品前應先開機，然后倒置容器瓶，以保持進樣針上的過濾膜干燥，氣流暢通，正常進液。（４）若進液管內出現過多氣泡，應將泵速降低，并檢查進氣濾膜是否被浸泡，若不能進液，則檢查進樣針是否暢通。任務實施一、制訂工作計劃序號工作內容完成時間成員負責人1培養基制備

2培養基無菌檢查

3培養基靈敏度檢查

4方法適用性試驗5供試品集菌6對照試驗7培養及觀察8結果判斷根據任務要求，制定合理工作進度計劃，并根據小組成員的特點進行分工。任務實施二、試驗前準備設備、器材、試劑規格數量用途無菌室

操作場所超凈工作臺

操作區域酒精燈

局部無菌環境75%乙醇

擦拭消毒喜炎平注射液

供試品培養基

提供營養物質緩沖液

沖洗濾膜集菌儀

截留樣品中的微生物培養箱

微生物培養菌種

靈敏度檢查、陽性對照任務實施三、試驗操作培養基的制備依據培養基培養及制備要求，按照計算用量-稱量-溶解-調pH值-分裝-滅菌完成。注意特殊物質的溶解方式及順序，注意分裝是培養基裝量的高度。

計算用量

稱量

溶解

調pH值

分裝

滅菌任務實施三、試驗操作方法適用性試驗-操作培養基名稱接種菌種接種方法培養硫乙醇酸鹽流體培養基不大于１００ｃｆｕ的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌按供試品的無菌檢查要求，取每種培養基規定接種的供試品總量，采用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入不大于１００ｃｆｕ的試驗菌，過濾置于３０～３５℃培養箱，其中生孢梭菌