25病毒感染的檢查方法與防治原則第25章病毒感染的檢查方法與防治原則講授陳利玉25病毒感染的檢查方法與防治原則內容第一節病毒感染的診斷(檢查方法）第二節病毒感染的特異性預防(自學）第三節病毒感染的治療（自學）25病毒感染的檢查方法與防治原則第一節病毒感染的診斷（Diagnosisofviralinfection）?標本采集與送檢原則?病毒感染的檢查方法25病毒感染的檢查方法與防治原則一、標本采集與送檢原則?按疾病種類與病程采取不同標本?在發病早期與用藥之前采取標本?無菌操作，有菌標本用“雙抗”（青、鏈霉素）或

“三抗”（青、鏈霉素+兩性霉素B）處理?

冷藏速送，病變組織用50％甘油保存?血清學檢測：IgM—單份血清,IgG—雙份血清25病毒感染的檢查方法與防治原則二、檢查方法?病毒的形態學檢查?病毒的血清學檢查?病毒的分子生物學檢查?病毒的分離培養與鑒定25病毒感染的檢查方法與防治原則1.病毒形態學檢查電子顯微鏡：可觀察各種病毒的形態但設備貴、操作復雜，應用受限光學顯微鏡：可觀察大病毒（痘病毒）和包涵體對一般病毒檢測意義不大25病毒感染的檢查方法與防治原則呼腸病毒感染回腸上皮細胞電鏡照片Electronmicrographs25病毒感染的檢查方法與防治原則InclusionbodyCytomegaliccell

thatcontainsadense,"owl'seye,"acidophilicintranuclearinclusionbody

Negrybody25病毒感染的檢查方法與防治原則2.病毒血清學檢查?已知抗原—測抗體（診斷）?已知抗體—測抗原（鑒定病毒屬、種、型、亞型）25病毒感染的檢查方法與防治原則(1)中和試驗(Neutralizationtest)(2)血凝抑制試驗(Hemagglutinationinhibitiontest)(3)免疫標記法(FIA、EIA、RIA)⑷

蛋白印跡(Westernblot)2.病毒血清學檢查方法：25病毒感染的檢查方法與防治原則Immunofluorescensetest25病毒感染的檢查方法與防治原則ImmunofluorescensetestPositiveimmunofluorescencetestforrabiesvirusantigen.(Source:CDC)25病毒感染的檢查方法與防治原則HEL細胞中CMVIE1蛋白的表達Enzymeimmunoassay(EIA)25病毒感染的檢查方法與防治原則ELISAColouredwellsindicatereactivity25病毒感染的檢查方法與防治原則AIDS的確診試驗Westernblot25病毒感染的檢查方法與防治原則3.病毒分子生物學檢查

可用于檢測常規培養系統不能培養的病毒

可用于檢測少量標本或含少量病毒的標本

可用于抗體產生前或不能產生抗體的免疫缺陷患者檢測

可對病毒進行定量檢測，有助于療效監測

可對病毒進行基因分型

靈敏度高、特異性好、快速、簡捷優點：25病毒感染的檢查方法與防治原則3.病毒分子生物學檢查

核酸電泳(nucleicacidelectrophoresis)

核酸雜交(nucleicacidhybridization)

核酸擴增(PCR）

基因芯片(genechip)

基因測序(genesequence)方法：4.病毒的分離培養與鑒定:?

病毒的分離培養?

病毒的鑒定?

病毒數量及感染性測定25病毒感染的檢查方法與防治原則病毒的分離培養方法：

動物接種

雞胚培養

細胞培養:25病毒感染的檢查方法與防治原則⑴

動物接種(animalinoculation)動物：鼠、兔、猴、黑猩猩等優點：結果易觀察，可建立動物模型缺點：有飼養條件要求，費用高、動物體內常帶有潛伏病毒。目前已很少應用。25病毒感染的檢查方法與防治原則⑵

雞胚培養(embryonatedeggculture)受精卵孵育10-12天雞胚接種病毒孵育2-7天收獲相應的材料進行鑒定25病毒感染的檢查方法與防治原則雞胚接種部位：尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種25病毒感染的檢查方法與防治原則優點：易管理不帶微生物成本較低缺點：操作程序復雜目前用雞胚培養的病毒主要是流感病毒⑵

雞胚培養(embryonatedeggculture)25病毒感染的檢查方法與防治原則(3)細胞培養(cellculture)根據細胞生長的方式分:

單層細胞培養（monolayercellculture）

懸浮細胞培養（suspendedcellculture）25病毒感染的檢查方法與防治原則根據細胞來源、染色體特征及傳代次數分:

原代培養細胞

二倍體細胞株

傳代細胞系或株(3)細胞培養(cellculture)25病毒感染的檢查方法與防治原則①原代培養細胞（primaryculturalcells)組織組織塊分散的單個細胞單層細胞

剪碎蛋白酶(原代細胞)單層細胞(次代細胞)傳代培養培養基25病毒感染的檢查方法與防治原則①原代培養細胞（primaryculturalcells)epithelialcells25病毒感染的檢查方法與防治原則特點:?對多種病毒敏感?生長能力有限,獲取成本高?可攜帶潛伏病毒應用:?病毒分離與鑒定?病毒學實驗研究?不能用于制備疫苗①原代培養細胞（primaryculturalcells)25病毒感染的檢查方法與防治原則體外分裂50~100代仍保持二倍染色體數目的單型細胞特點:?對多種病毒敏感?不帶異種蛋白(人源性)?

不帶病毒,無致瘤潛能應用:?病毒分離與鑒定?病毒學實驗研究?

制備疫苗②二倍體細胞株(diploidcellstrain)fibroblasticcells25病毒感染的檢查方法與防治原則③傳代細胞系(continuouscellline)特點:?對多種病毒敏感性高?繁殖能力強,傳代時間長?有致癌危險(來源于癌細胞或突變的二倍體細胞株)應用:?病毒分離與鑒定?病毒學實驗研究?不能用于制備疫苗能在體外無限傳代的細胞系。如HeLa,Hep-2epithelioidcells25病毒感染的檢查方法與防治原則4.病毒的分離培養與鑒定:?

病毒的分離培養?

病毒的鑒定?

病毒數量及感染性測定25病毒感染的檢查方法與防治原則病毒鑒定：

病毒在細胞中增殖的指標

病毒形態學鑒定

病毒抗原鑒定

病毒基因鑒定25病毒感染的檢查方法與防治原則⑴

細胞病變效應(cytopathiceffect,CPE)

病毒在敏感細胞內增殖引起的光鏡下可見的細胞病理改變。

25病毒感染的檢查方法與防治原則①CPE：病毒感染細胞發生形態改變25病毒感染的檢查方法與防治原則SyncytiumformationincellculturecausedbyRSV(top),andmeaslesvirus(bottom).

②CPE：病毒感染細胞與鄰近細胞融合25病毒感染的檢查方法與防治原則③CPE：形成包涵體（inclusionbody）25病毒感染的檢查方法與防治原則Syncytialformationcausedbymumpsvirusandhaemadsorptionoferythrocytesontothesurfaceofthecellsheet.⑵

紅細胞吸附（hemadsorption,HAd）受染細胞膜表面血凝素（HA）＋RBC表面HA受體25病毒感染的檢查方法與防治原則⑶干擾現象（interference）風疹病毒＋人胚腎細胞病毒增殖，CPE（－）埃可病毒＋人胚腎細胞病毒增殖，CPE（＋）＋人胚腎細胞風疹病毒？埃可病毒CPE(-)——埃可病毒(-)

風疹病毒(+)CPE(+)——埃可病毒(+)

風疹病毒(-)

25病毒感染的檢查方法與防治原則4.病毒的分離培養與鑒定:?

病毒的分離培養?

病毒的鑒定?

病毒數量及感染性測定25病毒感染的檢查方法與防治原則

病毒數量及感染性測定：蝕(空)斑形成試驗50%組織細胞感染量病毒總量(活病毒+死病毒)：感染性病毒量:血凝試驗25病毒感染的檢查方法與防治原則蝕(空)斑形成試驗（plaqueassay）

原理：適當濃度的感染性病毒在覆蓋瓊脂的細胞層上產生可見和可數的局部病灶稱為蝕斑。一個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒增殖而形成的，由蝕斑的數目可以計算出原始標本中感染性病毒的含量。PLAQUEASSAYPLAQUEASSAYPLAQUEASSAYPLAQUEASSAYPLAQUEASSAYPLAQUEASSAY

分別為10-1、10-2、10-3倍稀釋度的HCMV病毒液感染的HEL細胞蝕(空)斑形成試驗（plaqueassay）

25病毒感染的檢查方法與防治原則用途：?測定感染性病毒量

單位:PFU(plaqueformingunit)/ml

由一個感染性病毒顆粒增殖而形成的一個空斑稱為空斑形成單位。?分純病毒蝕(空)斑形成試驗（plaqueassay）

25病毒感染的檢查方法與防治原則50%組織細胞感染量

(50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)概念:

測定病毒感染細胞后引起50%細胞病變或死亡的最小病毒量。方法:一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋，分別接種細胞，經一定時間后觀察CPE、血細胞吸附等指標，以能使50%細胞感染的病毒的最高稀釋度作為終點。最后用統計方法計算出50%組織細胞感染量。用途:

測定感染性病毒的量和毒力

分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀釋度的HCMV感染的HEL細胞50%組織細胞感染量(TCID50)25病毒感染的檢查方法與防治原則香港大學專家：患者鼻咽標本→Vero細胞培養→CPE→EM觀察：冠狀病毒隨后加拿大和美國CDC等SARS國際協作組的多個實驗室也培養出了冠狀病毒利用‘免疫熒光法’將分離病毒與SARS患者血清進行血清學檢測，反應呈陽性從冠狀病毒基因組的保守區設計引物，采用RT-PCR方法從培養上清中擴增出了冠狀病毒基因→測序→經Genbank數據庫同源性比對，發現同源性為64%左右SARS冠狀病毒的分離和鑒定25病毒感染的檢查方法與防治原則加拿大專家完成了全基因組測序→發現與已知人和動物的冠狀病毒的同源性差異較大→確定為一種新的冠狀病毒。荷蘭的病毒學家：用這種冠狀病毒感染猴子→出現了與SARS病人相同的臨床表現和病理特征→再次從動物學實驗證實引起SARS的病原體是這種冠狀病毒WHO將其命名為SARS冠狀病毒SARS冠狀病毒的分離和鑒定電鏡免疫熒光免疫印跡分子生物學技術核酸