細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡第十三章細(xì)胞凋亡與衰老●細(xì)胞凋亡(Apoptosis)●細(xì)胞衰老(cellularaging或cellsenescence)細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡機(jī)體結(jié)構(gòu)細(xì)胞增殖細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)染色體（DNA與蛋白質(zhì)的相互作用）衰老細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡一、細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義PRIZED

Branna,

Horvitz,andSulstonsharePhysiologyorMedicineNobel（2002）

“fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath”1090–131=959(cells)細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡

1.概念細(xì)胞凋亡的概念最早是由病理學(xué)家Kerr于1972年正式提出的。細(xì)胞凋亡是一種具有特征形態(tài)和生化改變的細(xì)胞凋亡過程，這些改變是一系列基因活動(dòng)引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。又被稱為“細(xì)胞程序性死亡”（programmedcelldeath,PCD）細(xì)胞凋亡具有利他性。細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡2.研究歷史（階段劃分）（1）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究：1972年前，建立和形成細(xì)胞凋亡的概念（2）細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)研究：DNA的特征性降解、蛋白質(zhì)與RNA的合成、Ca2+濃度的變化、細(xì)胞凋亡的酶學(xué)研究（3）細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)研究：80年代后期，主要研究細(xì)胞凋亡過程中相關(guān)的基因以及細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)等細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡（1）

胚胎發(fā)育（2）

清除抗原激活的淋巴細(xì)胞（3）

清除癌變的細(xì)胞（4）

清除病毒感染的細(xì)胞（5）

防止炎癥的產(chǎn)生（6）

細(xì)胞新陳更新的需要3.細(xì)胞調(diào)亡的生物學(xué)意義細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡

蝌蚪尾的消失細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡

脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡發(fā)育過程中手和足的成形過程細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡（1）

AIDS：HIV誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡（2）自身免疫疾病：激活的淋巴細(xì)胞凋亡缺陷（3）癌癥：凋亡缺陷（4）老年癡呆/中風(fēng)：過多神經(jīng)細(xì)胞凋亡

4、細(xì)胞凋亡與疾病細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征壞死細(xì)胞(necrosis)凋亡細(xì)胞(apoptosis)細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡1.細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死特征Apoptosisnecrosis誘導(dǎo)因素生理及弱刺激強(qiáng)烈刺激細(xì)胞數(shù)量單個(gè)細(xì)胞丟失成群細(xì)胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失染色質(zhì)凝聚成半月狀稀疏成網(wǎng)狀細(xì)胞核早期固縮斷裂晚期破碎細(xì)胞器無明顯變化腫脹、破損細(xì)胞內(nèi)溶物無釋放釋放細(xì)胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機(jī)降解能量需求依賴ATP不依賴ATP大分子合成一般需要不需要后果不引起炎癥引起炎癥意義生理死亡方式病理死亡方式細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡2.細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡

左，正常胸腺細(xì)胞；右，凋亡胸腺細(xì)胞（注意凋亡小體）細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡3.細(xì)胞凋亡的生化特征細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對(duì)照7．Marker

（自趙允、翟中和）細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡4.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子包括射線（紫外線，

射線等）較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑、激素、細(xì)胞生長因子、腫瘤壞死因子

（TNF

）、抗Fas/Apo-1/CD95抗體等細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡5.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)形態(tài)學(xué)技術(shù)瓊脂糖電泳技術(shù)DNA片段原位標(biāo)記法ELISACaspase-3活性的檢測(cè)磷脂酰絲氨酸外翻分析細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡形態(tài)學(xué)技術(shù)1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。

貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2）染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割

成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。DNA片段原位標(biāo)記法細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡ELISA細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡Caspase-3活性的檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡磷脂酰絲氨酸外翻分析細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理●線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1。一只四齡(L4)的線蟲(A.C.elegans)幼蟲。可以看見紅色的細(xì)胞核、藍(lán)色的DNA與綠色的上皮細(xì)胞邊緣。本照片由麻省理工Horvitz實(shí)驗(yàn)室提供細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡1.

Caspase家族與凋亡◆Caspase家族

Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡◆caspase超家族成員及其相應(yīng)底物細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡

◆

Caspase活化Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或自身活化。Caspase8Pro-Caspase3ActiveCaspase3Pro-Caspase7ActiveCaspase7A．通過激活的Caspase-Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡

B．

通過誘導(dǎo)的“近域效應(yīng)”（Proximity）

凋亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

DDFADDPro-Caspase8FasFasFas-LActiveCaspase8Apoptosis細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡

D、

通過與調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合線粒體依賴的細(xì)胞凋亡

C、通過去除抑制因子：IAPCaspaseSmacIAPCaspaseSmacActive+CaspaseCascadeApoptosisDeathSignalsBADmitochondriaCytochromecApaf1Pro-Caspase9ActiveCaspase9細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡◆胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑

當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號(hào)分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部Procaspase相互活化并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡。下游Caspases活化后，作用于底物，裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬。細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡2.Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；

Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；

Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個(gè)保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3。細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡BCL-2家族成員細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡Bcl-2、線粒體與細(xì)胞凋亡◆當(dāng)Caspase8活化后，它一方面作用Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2個(gè)片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端片段被運(yùn)送到線粒體，與Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細(xì)胞凋亡.細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡線粒體途徑及其信號(hào)傳遞（1）γ射線或神經(jīng)酰胺等

→破壞線粒體內(nèi)電子傳遞和能量代謝

→細(xì)胞凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡

→細(xì)胞凋亡（2）釋放Cas活化因子UX、Bax表達(dá)↑→細(xì)胞色素C釋放cytochromeC與凋亡促進(jìn)因子結(jié)合→Apaf-1分子構(gòu)象改變

→結(jié)合pro-Cas-9→Cas-9活化→水解pro-Cas-3→Cas-3活化→細(xì)胞凋亡→呼吸鏈中斷、ATP↓、氧自由基↑細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡釋放DPF（deathpromotingfactor）

→激活pro-Cas-9

→激活Cas-3

*直接釋放pro-Cas-3

→參與細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)釋放氧自由基

*呼吸鏈將電子向分子氧傳遞

→產(chǎn)生氧自由基

→細(xì)胞不可逆損傷→凋亡（3）線粒體膜滲透性改變

→線粒體內(nèi)高滲狀態(tài)

→細(xì)胞骨架蛋白受壓→凋亡細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡MitochondrionApoptoticStimuli(UVandg-irradiation;chemodrugs)Procaspase-9IAPProcaspase-3Caspase-3Caspase-8Procaspase-8Deathligand(Fas;Trail)DeathreceptortBidSmac/DiabloApoptosisCaspase-9細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡Anoverviewofthedeath-receptorpathwayandthemitochodrialpathway細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡二、細(xì)胞衰老(cellularaging或cellsenescence)什么是衰老？衰老又稱老化，通常指生物發(fā)育成熟后，在正常情況下隨著年齡的增加，機(jī)能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性下降，結(jié)構(gòu)中心組分退行性，趨向死亡的不可逆現(xiàn)象。衰老發(fā)生在生物界的整體水平、種群水平、個(gè)體水平、細(xì)胞水平及分子水平等不同層次。細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡●Hayflick界限(HayflickLimitation）●細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞衰老的分子機(jī)理細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡1.

Hayflick界限(HayflickLimitation）●概念：細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限.◆癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞.◆細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān).◆物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系.細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡細(xì)胞來源人胚肺成纖維細(xì)胞中年人成纖維細(xì)胞老年人成纖維細(xì)胞可增殖代數(shù)40-60202-4不同年齡來源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù)細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡2.細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個(gè)體發(fā)育的早期也會(huì)發(fā)生●正常情況下終生保持分裂的細(xì)胞，其分裂能力是否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降？它們會(huì)不會(huì)衰老？

◆衰老動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長

◆衰老個(gè)體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老◆骨髓干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)說明隨著年齡的增加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡3.衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞核的變化:體積增大，核膜內(nèi)折、染色質(zhì)固縮化●內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化:衰老動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核周胞質(zhì)中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了●線粒體的變化 ◆通常，細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨年齡減少，而其體積則隨年齡增大細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡3.衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●致密體的生成●膜系統(tǒng)的變化

◆衰老的細(xì)胞，其膜流動(dòng)性降低、韌性減小

◆衰老細(xì)胞間間隙連接及膜內(nèi)顆粒的分布也發(fā)生變化細(xì)胞生物學(xué)第13章細(xì)胞衰老與凋亡4.細(xì)胞衰老的分子機(jī)理●氧化性損傷學(xué)說－－－差錯(cuò)學(xué)