一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒實驗解決方案原理NO（NitricOxide，NO）廣泛分布于生物體內神經、循環、呼吸、消化、泌尿生殖等系統中，特別是神經組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內的信息物質，發揮信號傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。NO易被氧化成亞硝酸鹽和硝酸鹽，因此，通常要測定亞硝酸鹽和硝酸鹽的總量來推算出總的一氧化氮的量。CheKine?一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒（微量法），采用改進的格里斯法將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽后，即可準確測定NO的生成量。格里斯分析的機理概括為重氮類之間的偶氮耦合，重氮類是由磺胺和NO2-和N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽產生的，產生與NO代謝物成正比的比色（540nm）產物。自備耗材·酶標儀或可見光分光光度計（能測540nm處的吸光值）·恒溫培養箱·96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭·去離子水、PBS(pH7.4)·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備NaNO2Standard(1M):使用前平衡到室溫；實驗過程中避光放置；分裝避光保存于-20℃。GriessReagentI：即用型；使用前平衡到室溫；實驗過程中避光放置；4℃避光保存。GriessReagentⅡ：即用型；使用前平衡到室溫；實驗過程中避光放置；4℃避光保存。VCl3Reagent：即用型；使用前平衡到室溫；實驗過程中避光放置；4℃避光保存。ZnSO4：即用型；使用前平衡到室溫；實驗過程中避光放置；4℃避光保存。標準曲線設置：取10μLNaNO2Standard(1M)用990μLPBS(pH7.4)稀釋至10mMNaNO2Standard儲備液Ⅰ。取10μL10mM的NaNO2Standard儲備液Ⅰ用990μLPBS(pH7.4)稀釋至100μMNaNO2Standard儲備液Ⅱ。用100μMStandard儲備液Ⅱ按下表所示，進行下一步稀釋：序號100μMStandard儲備液Ⅱ(μL)PBS(pH7.4)(μL)濃度(μM)Std.12000100Std.210010050Std.34016020Std.42018010Std.5101905Std.641962Std.721981Blank02000注意：標準品現配現用；稀釋后的標準溶液不穩定，必須在4小時內使用。樣本制備動植物組織或細胞樣本：稱取約0.1g組織樣本或收集500萬個細胞，加入1mLPBS(pH7.4)，冰浴勻漿，14,000rpm，4℃離心10min，取上清液待測。血漿，血清和尿液（和其他生物體液）：直接將樣品加入96孔板或微量玻璃比色皿。需要進行去蛋白的樣品包括血清、血漿、全血、含有FBS的細胞培養基、組織或細胞裂解物。尿液和唾液不需要脫蛋白。脫蛋白處理：將150μL樣品與8μLZnSO4混合在1.5mLEP管中，旋渦，然后14,000rpm，4℃離心10min。將100μL的上清液轉移到干凈的EP管中。注意：建議您使用新鮮樣品，如果不立即實驗，樣品可在-80℃保存一個月。如果樣品需要脫蛋白，則每種標準品應制備150μL，并同樣用硫酸鋅處理，避免結果計算中需要使用稀釋因子?？寡趸瘎┖陀H核劑（例如β-巰基乙醇、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇和半胱氨酸）可能會干擾檢測。在樣品制備過程中避免使用這些化合物。實驗步驟酶標儀或可見光分光光度計預熱30min以上，調節波長到540nm，可見光分光光度計用去離子水調零。工作液的配制：每孔需要200μL工作液，為避免損失，按204μL每孔體系配制：吸取104μLVCl3Reagent，50μLGriessReagentⅠ和50μLGriessReagentⅡ。工作液需現配現用。將100μL稀釋的標準品和樣品添加到單獨標記的EP管中（建議樣品至少重復測量2次）。然后在每個樣品和標準管中加入200μL工作液，混合均勻。將反應體系在37℃下孵育30min。對反應管進行短暫離心以去除不溶物，并將每個反應體系中分別取250μL液體轉移到96孔板或微量玻璃比色皿中。在540nm處讀取A值，分別標記為ABlank,AStandard和ASample。所有A值減去空白孔A值，計算ΔAStandard=AStandard-ABlank,ΔASample=ASample-ABlank。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本A值>1.0，則說明樣本NO含量太高，需用PBS（pH7.4）適當稀釋（計算公式中乘以相應稀釋倍數）。如果樣本的ΔASample低于0.005，可提高樣本量。結果計算以標準液濃度為x軸，ΔAStandard為y軸，繪制標準曲線。將ΔASample帶入方程得到x值（μM）即NO含量。換算：1mg/dLNO相當于333μM，0.001%或10ppm。結果展示典型標準曲線：以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。ΔA540ΔA540[NO](μM)Figure1.96孔板分析的NO標準曲線相關產品CatalogNo.ProductNameKTB1010CheKine?輔酶ⅡNADP(H)含量檢測試劑盒（微量法）KTB1020CheKine?輔酶ⅠNAD(H)含量檢測試劑盒