33012023-02-28發布I 3 3 4 6 8本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定1三葉青種質資源鑒定技術規程SSR標記法hemsleyanumDielsetGilg）不同種質資源鑒定的原理、儀器設備及試劑、溶液配制、操作程序及判定方法。本文件適用于三葉青種質資源SSR指紋數據采集及種質GB/T6682—2008分析實驗室用水規格和在核酸合成反應時，作為多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的一小段單鏈脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid，DNA具有所用SSR位點上不同等位變異的品種。參照種質資源用于輔助確定送檢樣品的等位變異，校正ChainReaction，PCR）擴增及電泳方2e)高速冷凍離心機(最大離心力不小于20000g);f)電子天平(精度為千分之一);5.3所用試劑i)DNA標準分子量標記(marker);3選取三葉青幼嫩葉片，每份樣品檢測5張葉片的混合樣，并設置三4e)重復b)～d),共35個循環；g)4℃保存。7.4PCR產物檢測7.4.1.1凝膠準備凝膠制備應按照如下步驟進行：a)將垂直夾心式電泳裝置的玻璃板與膠皮套裝在一起，取微波爐煮沸后的1%瓊脂糖封膠液約5mL封住玻璃板底部的縫隙，制成鑄膠槽；合液，超純水14.8mL,搖勻后加入200μL10%過硫酸銨和12μL四甲基二乙胺(TEMED),攪拌混勻后注滿鑄膠槽，隨即插好樣孔梳，于室溫下靜置直至凝膠完全聚合后使用。去掉封口的瓊脂糖膠，將膠板固定于垂直電泳槽中，在電泳槽中加滿1×TBE緩沖液，小心抽出樣孔梳，用移液器吸取TBE緩沖液沖洗每個點樣孔2次，然后向加樣孔中點入1.5μLPCR反應產物；同時，在一側加樣孔中加入DNA標準分子量標記(marker)。按樣品向正極遷移接通電源，以5V/cm(正負極間距離)恒壓電泳約2.5h。電泳完畢后關閉電源，取下玻璃板。小心分開兩塊玻璃板，取下聚丙烯酰胺凝膠，用蒸餾水沖洗凝膠30s~60s,放入染色液中，輕搖5min~10min進行染色；然后將凝膠從染色液中取出，用蒸餾水快速漂洗2次，每次30s~60s,放入顯影液中，輕搖至顯色出清晰帶紋，取出凝膠用蒸餾水沖洗2遍，瀝干后掃描或拍攝成像。7.5數據處理應根據擴增產物的電泳圖譜，在相同遷移位置處，有電泳條帶記為“1”,無條帶記為“0”,生成矩陣。以此來實現電泳帶型的數據化，并鑒定參試材料。8判定方法按照由帶型數據賦予的數字化指紋，可單獨或聯合使用的標記鑒定材料材料的異同，具體如下：a)當樣品間差異位點數≥2,判定為“不同”;b)當樣品間差異位點數=1,判定為“高度相似”;5c)當樣品間差異位點數=0，判定為極近似或相同。6A.1DNA提取溶液的配制移至1000mL容量瓶中，用超純水定容至1000mL，在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20mA.1.3三氯甲烷-異戊醇（24:1）A.1.475%乙醇溶液A.3聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制至1000mL容量瓶中，用超純水定容至1A.3.25×TBE緩沖液二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液，加入800mL超純水溶解，調整pH為8.0，轉移至1000mL容量瓶中，用量取5×TBE緩沖液200mL于1000mL容量瓶中，用超純水定容至1000A.3.440%丙烯酰胺溶液分別稱取丙烯酰胺190.0g和甲叉雙丙烯酰胺10.0g于500mL燒杯中，加7A.4銀染溶液的配制量取100mL冰醋酸于1000mL容量瓶中，加超純水定容至1A.4.2染色液