1第四章衛生微生物研究和檢測的方法

2衛生微生物檢測的特點及基本原則衛生指示微生物衛生微生物研究和檢測的方法衛生微生物研究和檢測方法的前景

3第一節衛生微生物檢測的特點及基本原則41.衛生微生物檢驗與醫學微生物檢驗的區別與特點?2.樣品的采集原則？3.影響采樣代表性的因素有哪些？4.怎樣使采樣具有針對性？5.樣品采集后為什么要盡快送檢？6.怎樣保護樣品中的待檢微生物？7.樣品中抑菌物質去除方法有哪些？8.樣品的處理策略（目的）與方法9.怎樣濃縮樣品中的微生物？10.環境中的微生物數量低，怎樣提高檢出率？

5衛生微生物檢測的特點

1．檢測的對象多病原微生物+非致病和條件致病微生物特別是能反映環境、食品、健康相關產品等樣品衛生質量的衛生指示微生物。62．檢測的范圍廣，標本的來源不僅局限于人體，也來源于空氣、水、食品等環境。73．檢測的方法更敏感，以檢測環境標本中數量很低的致病微生物。問題：你知道哪些方法？你認為什么方法更敏感？84．定量測定和分型檢測，以探明感染性疾病的傳染源、傳播途徑、流行情況等。9衛生微生物檢測的基本原則

采集、保存、運送、檢測10總原則生物安全代表性/針對性防污染防殺菌細標記11生物安全防人員感染：個人防護（？）防標本和環境的污染：無菌操作、恰當處理污染廢棄物裴曉方

xxpei@12注意采樣的代表性影響采樣代表性的因素包括:采樣量采樣部位采樣時間采樣的隨機性和均勻性以及按批號抽樣

13注意采樣的針對性樣品種類恰當時間采樣量14避免采樣時外界微生物對樣品的新污染：所有采樣用具、容器需嚴格滅菌，并以無菌操作采樣。15避免采樣時對微生物的殺滅作用和引入新的抑菌物質：如容器是否有消毒劑的殘留，或使用剛燒灼未冷卻的采樣工具。裴曉方

xxpei@16注意對樣品的詳細標記：樣品名稱編號采樣時間采樣者檢測項目2025/1/5裴曉方

xxpei@17樣品的運送原則

盡快送檢采集的樣品，應在規定的時間內（一般不超過3~4小時）送到實驗室，盡快送檢。

一方面可減少待測微生物的死亡。

另一方面可防止微生物的繁殖對計數結果的影響2025/1/5裴曉方

xxpei@18保護待檢微生物溫度調節加入保護劑去除其他不利于待測微生物生存的因素2025/1/5裴曉方

xxpei@19pH蛋白質抑制劑抑制非目的微生物滲透壓氣體2025/1/5裴曉方

xxpei@20遵循完善的樣品交接制度

送往實驗室的樣品，必須附有樣品送檢單，實驗室收到樣品應按送檢單逐項核對，檢查樣品是否符合檢驗要求，確證無誤方可簽收待檢。2025/1/5裴曉方

xxpei@21實驗室檢驗原則

2025/1/5裴曉方

xxpei@22相應的硬件條件和設備具有合格的檢驗人員標準/公認的檢驗方法實驗室質量控制環境實驗室環境不應影響檢驗結果的準確性工作區與辦公區分開工作面積應滿足檢驗工作的需要溫度、濕度、照度、噪聲和潔凈度等應符合工作要求整體布局應采用單方向工作流程，避免交叉污染一般樣品檢驗：潔凈區（超凈工作臺或潔凈實驗室）病原微生物分離鑒定：BSL-22025/1/5裴曉方

xxpei@24

應有檢測不同病原菌的相應的條件和設備微生物按其是否致病、致病力強弱、危害人體的嚴重性、傳染性的大小、當地人群的免疫水平、有無免疫制劑和特效治療藥物等可分成不同的危害等級。在不同生物安全級別實驗室進行2025/1/5裴曉方

xxpei@25實驗室生物安全與管理很重視?2025/1/5裴曉方

xxpei@26病毒滅活不徹底引發實驗室感染

2004北京、安徽發生非典疫情原因調查結果。調查組認為，本起疫情來自中國疾控制中心實驗室內感染，而引起實驗室感染的環節，是腹瀉病毒室工作人員進行實驗時，對SARS病毒滅活不徹底。

2025/1/5裴曉方

xxpei@27實驗室生物安全與管理生物危害非工作人員嚴禁入內2025/1/5裴曉方

xxpei@28實驗室生物危害在微生物和生物醫學實驗室研究過程中生物因子（病原微生物）對人、環境、生態和社會造成的危害和污染。2025/1/5裴曉方

xxpei@29實驗室生物安全為了避免微生物和醫學實驗室中在進行各種有危害或有潛在危害的生物因子活動過程中，可能對人、環境和社會造成的危害或潛在危害，而采取的防護措施（硬件）和管理措施（軟件），達到對人、環境和社會的安全防護目的2025/1/5裴曉方

xxpei@30微生物實驗室生物安全主要考慮實驗室生物安全防護，即實驗室工作人員所處理的實驗對象含有致病的微生物及其毒素時，通過在實驗室設計建造、使用個體防護設施、嚴格遵從標準化的工作及操作程序和規程等方面采取綜合措施，確保實驗室工作人員不受實驗對象的感染，確保周圍環境不受實驗對象的污染。2025/1/5裴曉方

xxpei@31實驗室生物安全級別2025/1/5裴曉方

xxpei@32感染性微生物的危險度等級分類危害等級I(低個體危害，低群體危害)不會導致健康工作者和動物致病的細菌、真菌、病毒和寄生蟲等生物因子。危害等級Ⅱ(中等個體危害，有限群體危害)能引起人或動物發病，但一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環境不會引起嚴重危害的病原體。實驗室感染不導致嚴重疾病，具備有效治療和預防措施，并且傳播風險有限。2025/1/5裴曉方

xxpei@33感染性微生物的危險度等級分類危害等級III

(高個體危害，低群體危害)能引起人類或動物嚴重疾病，或造成嚴重經濟損失，但通常不能因偶然接觸而在個體間傳播，或能使用抗生素、抗寄生蟲藥治療的病原體。危害等級Ⅳ

(高個體危害，高群體危害)能引起人類或動物非常嚴重的疾病，一般不能治愈，容易直接或間接或因偶然接觸在人與人，或動物與人，或人與動物，或動物與動物間傳播的病原體。2025/1/5裴曉方

xxpei@34實驗室可以分為基礎實驗室——

一級生物安全水平（BSL-1)基礎實驗室——

二級生物安全水平（BSL-2)防護實驗室——

三級生物安全水平（BSL-3)最高防護實驗室——

四級生物安全水平（BSL-4)根據操作不同危險度等級微生物所需的實驗室設計特點、建筑構造、防護設施、儀器、操作以及操作程序來決定實驗室的生物安全水平。2025/1/5裴曉方

xxpei@35傳染病分類——傳染病防治法甲類傳染病是指：鼠疫、霍亂。（2）乙類傳染病是指：傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、登革熱、炭疽、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯氏菌病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾。（25）2025/1/5裴曉方

xxpei@36傳染病分類——傳染病防治法丙類傳染病是指：流行性感冒、流行性腮腺炎、風疹、急性出血性結膜炎、麻風病、流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、包蟲病、絲蟲病，除霍亂、細菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病、手足口病。（11）對乙類傳染病中傳染性非典型肺炎、炭疽中的肺炭疽和人感染高致病性禽流感，采取本法所稱甲類傳染病的預防、控制措施。2025/1/5裴曉方

xxpei@37傳染病分類——根據病原微生物的傳染性、感染后對個體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類：第一類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物非常嚴重疾病的微生物，以及我國尚未發現或者已經宣布消滅的微生物。第二類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物嚴重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。

病原微生物實驗室

生物安全管理條例2025/1/5裴曉方

xxpei@38傳染病分類——第三類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環境不構成嚴重危害，傳播風險有限，實驗室感染后很少引起嚴重疾病，并且具備有效治療和預防措施的微生物。第四類病原微生物，是指在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。第一類、第二類病原微生物統稱為高致病性病原微生物。

病原微生物實驗室

生物安全管理條例人員-食品微生物檢驗具有微生物專業背景和相應資質掌握生物安全知識和消毒知識，能夠理解并正確實施檢驗（防止人為污染樣品、保護環境、自身安全）顏色視覺障礙涉及到辨色的實驗2025/1/5裴曉方

xxpei@40具有合格的檢驗人員

必須經常接受專業技術培訓，

掌握檢驗項目的基本原理及技術方法

技術質量考核：可用幾種基本技術作考核評價的指標。①細菌計數：可使用分散性和穩定性好的枯草菌CMCC（B）63501株制作芽孢懸液。請幾名被試人員用直徑9cm~10cm的普通營養瓊脂平板，作表面涂沫接種計數，重復作5次，求平均數和標準差，以標準差小，和顯微鏡直接計數折算值接近的為佳。②生化試驗重現性：用銅綠色假單胞菌CMCC（B）1012株，。③模擬樣品檢出考核：選合適的基質如奶粉，加入指標菌，如普通變形桿菌CMCC（B）49001株。考核前先作預備試驗。指定檢驗方法，確定檢出最小菌數。然后用最小菌數的5倍量、10倍量加入模擬基質中，進行檢出試驗，從盲檢結果的正誤進行評定。

2025/1/5裴曉方

xxpei@41采用標準/公認的檢驗方法進行檢測凡有國家標準、部頒標準或行業檢查方法的均按標準方法檢驗。沒有國家或部頒標準，按上級疾病預防控制中心的要求，參照共同協定的方法檢驗

2025/1/5裴曉方

xxpei@42加強實驗室質量控制儀器設備的質控：

培養基、試劑的質量控制：

消毒滅菌效果的控制：

建立良好的實驗記錄制度：

建立良好的核查、校對制度

報告與核查制度2025/1/5裴曉方

xxpei@43根據衛生檢驗的特點采取特殊措施做好應對突發事件的準備如果一個樣品需做多種分析，檢測微生物優先樣品處理：均質化、乳化后再行稀釋；抑菌物質去除；目的菌濃縮

(樣品的處理策略（目的）與方法?)微生物的復蘇

2025/1/5裴曉方

xxpei@44避免微生物實驗室感染

氣溶膠避免微生物污染操作環境作好培養廢棄物、用具和樣品等的處理作好個人防護

2025/1/5裴曉方

xxpei@45第二節衛生指示微生物

2025/1/5裴曉方

xxpei@46

指示微生物indicatormicroorganism是在常規衛生監測中，用以指示樣品衛生狀況及安全性的（非致病）微生物（或細菌）。2025/1/5裴曉方

xxpei@47分為四種類型

①菌落總數（細菌、霉菌和酵母菌數）②大腸菌群、糞鏈球菌、產氣莢膜梭菌③其它指示菌：特定菌、某些致病菌④病毒（包括噬菌體）

2025/1/5裴曉方

xxpei@48選擇指示微生物的總原則數量大易于檢出檢驗方法簡單、經濟、方便有一定的代表性，其數量變化能反映樣品衛生狀況及安全性

2025/1/5裴曉方

xxpei@49衛生微生物檢驗中最重要的指示微生物大腸菌群指示糞便污染2025/1/5裴曉方

xxpei@50作為糞便污染指示菌的條件有哪些？①大量存在于人及溫血動物腸道，未被糞便污染的樣品中無此種菌存在；②在外環境中的抵抗力，包括對消毒劑的抵抗力與腸道致病菌大致相似或稍強；③在外環境中不繁殖，存活時間與腸道致病菌大致相似或稍長；④檢驗方法簡便，易于定量計數。2025/1/5裴曉方

xxpei@51為什么常常通過檢測指示微生物反映樣品衛生安全性？

①致病微生物種類多，檢測方法各異，對樣品的衛生安全性作出評價時，不可能分別檢測各種微生物；②致病微生物的數量少，而檢測方法的靈敏度不高；或者受到檢測量的限制，可能導致假陰性結果③分離、鑒定致病微生物需時長，不能滿足實際工作的需要

④分離、鑒定致病微生物費用高，而且對人員的技術要求也相對較高2025/1/5裴曉方

xxpei@52與人類健康密切的樣品，如直接進口的食品、飲用水，除檢測衛生指示微生物外，還要求直接檢測某些致病菌如：沙門菌志賀菌金黃色葡萄球菌2025/1/5裴曉方

xxpei@53常用的指示微生物

2025/1/5裴曉方

xxpei@54菌落總數AerobicPlateCount

概念：菌落總數是指被檢樣品的單位重量(g)、容積(ml)、表面積(cm2)或體積(m3)內，所含有的能在某種培養基上經一定條件、一定時間培養后長出的菌落數量。以菌落形成單位數（colonyformingunit，cfu）表示。2025/1/5裴曉方

xxpei@55種類：菌落總數包括細菌菌落總數、霉菌菌落總數和酵母菌菌落總數。衛生學意義：用于判定檢樣被微生物污染的程度或動態觀察，也是某些樣品的衛生限量標準。測定方法：常用標準平板計數法(standardplate-countingmethod)和表面涂布法（SpatulaMethod

）

2025/1/5裴曉方

xxpei@56標準平板計數法(standardplate-countingmethod)又稱為傾注平板計數法Atwhattemperatureshouldpourplatesbedispensed?Desiredtemperatureis45±1°C.生長在固體培養基上，來源于一個?細胞，肉眼可見的細胞群體。2025/1/5裴曉方

xxpei@58菌落計算方法（1）菌落計數方法做平板菌落計數時，可用肉眼觀查，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數。（2）菌落計數的報告①平板菌落數的選擇選取菌落數在30～300之間的平板作為菌落總數測定標準。一個稀釋度使用兩個平板，應采用兩個平板平均數，其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數。平皿內如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界線），若僅有一條鏈，可視為一個菌落數；如果有不同來源的幾條鏈，則應將每條鏈作為一個菌落計。②稀釋度的選擇應選擇平均菌落數在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之。若有兩上稀釋度，其生長的菌落數均在30～300之間，則視兩者之比如何來決定。若其比值小于或等于2，應報告其平均數；若大于2則報告其中較小的數字。若所有稀釋度平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告之。

若所有稀釋度的平均菌落數均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。③菌落數的報告菌落數在100以內時，按其實有數報告，大于100時，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，以四舍五入方法計算。為了縮短數字后面的零數，也可用10的指數來表示。2025/1/5裴曉方

xxpei@64表面涂布法（SpatulaMethod

）傾注平板計數法表面涂布法2025/1/5裴曉方

xxpei@65標準平板計數法表面涂布法不透明培養基-+菌落生長處瓊脂表面+瓊脂內瓊脂表面加樣量1ml0.1ml樣分散方式混勻涂布2025/1/5裴曉方

xxpei@66糞便污染指示菌

大腸菌群（coliformgroup）：是一群能在35~37

C、24小時內發酵乳糖產酸產氣的、需氧或兼性厭氧的、革蘭陰性的無芽胞桿菌。是存在于人和溫血動物腸道中的一大群菌。2025/1/5裴曉方

xxpei@67主要包括：四個屬的菌埃希氏菌屬(Escherichae)克雷伯氏菌屬(Klebsiella)腸桿菌屬(Enterobacter)枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）2025/1/5裴曉方

xxpei@68根據生長溫度的差異，將能在37

C生長的稱為總大腸菌群，而在44.5

C仍能生長的大腸菌群稱為耐熱大腸菌群(thermo-tolerantcoliformgroup)或糞大腸菌群（faecal

coliform

Fc），耐熱大腸菌群的主要成員是埃希氏菌屬的菌。2025/1/5裴曉方

xxpei@69大腸桿菌（Escherichae

coli）：普遍存在于人和動物的腸道內（新鮮糞便中每克可達109CFU），近年來隨著測定新方法的發現和建立，大腸桿菌作為糞便污染的指示菌的應用越來越多。利用大腸桿菌產生的葡萄糖苷酸酶，分解吲哚葡萄糖苷酸，產生有色物質，而使大腸桿菌菌落顯色，對大腸桿菌數進行測定。2025/1/5裴曉方

xxpei@70作為糞便污染的指示菌，大腸桿菌檢出的意義最大，其次是耐熱大腸菌群，總大腸菌群的檢出意義略差一些。GB/T4789.3-2008大腸菌群MPN計數初發酵復發酵大腸菌群月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯發酵結果初發酵陽性陽性陽性陰性復發酵煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯接種樣本陰性陽性大腸菌群煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯發酵結果08版大腸菌群MPN計數較03版的優勢有：⑴08版操作更簡單，適合批量檢測⑵08版檢出的概率大

乳糖發酵培養基基本上不具備修復已損傷的細胞的作用，而月桂基硫酸鹽胰蛋白胨則可以。⑶08版減少了人為的誤差

03版需要挑選菌落，受人主觀的影響很大，沒有挑對或挑取的不夠多都會導致假陰性結果，而08版采取增菌液接種，會減少假陰性。GB/T4789.3-2008新增大腸菌群平板計數平板計數證實試驗典型菌落：紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環，菌落直徑為0.5mm或更大大腸菌群在結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）上的生長情況GB/T4789.3-2008新增大腸菌群PetrifilmTM測試片法準備PetrifilmTM測試片接種1ml樣本液緩慢蓋上上層膜用壓板輕壓培養基樣本接種結果紅色有氣泡的菌落確認為大腸菌群大腸桿菌MPN計數初發酵復發酵伊紅美藍平板分離培養營養瓊脂斜面或平板培養生化試驗大腸桿菌VRB-MUG平板計數法檢驗時用已知MUG陽性菌株（如大腸桿菌ATCC25922）和產氣腸桿菌（如ATCC13048）做陽性和陰性對照大腸桿菌PetrifilmTM測試片計數法與大腸菌群PetrifilmTM測試片計數法方法一致結果判讀大腸桿菌大腸菌群藍色帶氣泡的菌落紅色帶氣泡的菌落2025/1/5裴曉方

xxpei@82糞鏈球菌

（fecalStrptococcusFs）

2025/1/5裴曉方

xxpei@83產氣莢膜梭菌

（Clostirdia）是一類能還原亞硫酸鹽為硫化物、厭氧生長的、革蘭陽性梭狀芽胞桿菌。是人和動物，特別是食草動物腸道內的常住菌，數量少于大腸桿菌，每克糞便約為105~106。由于該菌能形成芽孢，對含氯消毒劑及外界不良環境有較強的抵抗力，在外環境中存活時間較長。所以若樣品中產氣莢膜梭菌被大量檢出而大腸菌群數量很少時，則表示樣品曾受過糞便污染，即有陳舊性污染。常被作為水或土壤衛生細菌學檢驗中的指標菌。2025/1/5裴曉方

xxpei@84其它指示微生物

（1）不得檢出的致病菌（2）腸道病毒的指標微生物1）大腸桿菌噬菌體f2(coliphage)2）脊髓灰質炎病毒(poliovirus)減毒疫苗株I2025/1/5裴曉方

xxpei@85第三節衛生微生物研究和檢測的方法2025/1/5裴曉方

xxpei@86衛生微生物樣品特點：

目的菌數量低

細菌受損

雜菌多數量低——濃縮細菌受損——復蘇雜菌多——選擇性增菌和分離2025/1/5裴曉方

xxpei@87（一）樣品處理1．樣品混勻：2．樣品濃縮：2025/1/5裴曉方

xxpei@88（一）樣品處理1．樣品混勻：液體樣品常通過電動、手搖或敲打震蕩，使之混勻；固體樣品需通過置滅菌乳缽內研磨均勻，或于高速組織搗碎機或勻漿器中在少量液體存在下，搗碎混勻后再取樣，或使用商品化的均質器混合待檢樣品。2025/1/5裴曉方

xxpei@892．樣品濃縮：常用的樣品濃縮方式有沉淀法過濾法吸附法2025/1/5裴曉方

xxpei@90（1）沉淀法：細菌可通過普通離心機離心沉淀而濃縮，或者通過差速離心，去除雜質，收集菌體，達到濃縮的目的。病毒濃縮需采用高速或超速離心機。2025/1/5裴曉方

xxpei@912025/1/5裴曉方

xxpei@922025/1/5裴曉方

xxpei@932025/1/5裴曉方

xxpei@94（2）過濾法：是將樣品在負壓或正壓作用下，通過孔徑為0.45μm的濾膜，細菌被阻留在膜上，而達到濃縮的目的。樣品中的病毒可通過膜的靜電吸附濃縮。過濾法不但可濃縮微生物，還可消除樣品中的抑制劑對后續培養的影響。2025/1/5裴曉方