基因工程原理及實驗技術

PrinciplesAndExperimentalTechnicsinGeneEngineering基因工程原理及實驗技術教材和參考書教材：簡明基因工程與應用吳建平主編，2005，科學出版社主要參考書：1.基因工程張惠展編著,華東理工大學出版社,20052.基因工程孫明主編,高等教育出版社,20063.基因工程原理吳乃虎編著，科學出版社,(第二版),19984.基因工程

彭銀祥,主編,20075.基因工程技術鐘衛鴻主編,化學工業出版社,2007基因工程原理及實驗技術第一章基因工程的概論第一節基因工程的概念

一、基因工程的基本概念

狹義基因工程

廣義基因工程基因工程原理及實驗技術狹義基因工程

狹義的基因工程(geneengineering):

從狹義上講，基因工程是指將一種或多種生物體(供體)的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另—種生物體(受體)內．使之按照人們的意愿遺傳并表達出新的性狀。因此，供體、受休、載體稱為基因工程的三大要素。基因工程原理及實驗技術狹義基因工程

狹義的基因工程:就是重組DNA技術（recombinantDNAtechniques）1）重組DNA技術

（recombinantDNAtechniques)2）分子克隆（molecularcloning)3）基因克隆（genecloning)4）遺傳操作(geneticmanipulation）5）遺傳工程(geneticengineering)6）基因工程(geneengineering)基因工程原理及實驗技術廣義基因工程廣義的基因工程：是指DNA重組技術的產業化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是外源基因重組、克隆、表達的設計與構建(即狹義的基因工程)；下游技術則涉及含有重組外源基因的生物細胞(基因工程菌或細胞)的大規模培養以及外源基因的表達、產物的分離、純化過程。因此，廣義的基因工程概念更傾向于工程學的范疇。

基因工程原理及實驗技術基因工程原理及實驗技術廣義的基因工程是一個高度統一的整體。上游DNA重組的設計必須以簡化下游操作工藝和裝備為指導思想。而下游過程則是上游基因重組藍圖的體現與保證。這是基因工程產業化的基本原則。基因工程原理及實驗技術狹義的基因工程

重組DNA技術

廣義的基因工程

重組DNA技術細胞工程染色體工程細胞器工程基因工程原理及實驗技術二、基因工程的基本過程

基因工程:兩大部分組成

基因工程的整個過程由工程菌(細胞)的設計構建和基因產物的生產兩大部分組成

工程菌(細胞)的設計構建:實驗室里進行，其單元操作過程如下:(1)從供體細胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內切酶分別將外源DNA(包括外源基因或目的基因)和載體分子切開(簡稱“切”)；基因工程原理及實驗技術

(2)用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子上形成DNA重組分子(簡稱“接”)；

(3)借助于細胞轉化手段將DNA重組分子導入受體細胞中(簡稱“轉”)；(4)短時間培養轉化細胞、以擴增DNA重組分子或使其整合到受體細胞的基因組中(簡稱“增”)；(5)篩選和鑒定轉化細胞，獲得使外源基因高效穩定表達的基因工程菌或細胞(簡稱“檢”)；基因工程的上游操作過程；可簡化為：切、接、轉、增、檢。

基因工程原理及實驗技術三．基因工程的基本原理

基因工程的主體戰略思想是外源基因的穩定高效表達為目的．其基本原理可從以下四個方面考慮。（1)利用載體DNA在受體細胞中獨立于染色體DNA而自主復制的特性，將外源基因與載體分子重組，通過載體分子的擴增提高外源基因在受體細胞中的劑量．借此提高其宏觀表達水平。這里涉及到DNA分子高拷貝復制以及穩定遺傳的分子遺傳學原理。基因工程原理及實驗技術

(2)篩選、修飾和重組啟動子、增強子、操作子、終止子等基因的轉錄調控元件，并將這些元件與外源基因精細拼接．通過強化外源基因的轉錄提高其表達水平。

(3)選擇、修飾和重組核糖體結合位點及密碼子等mRNA的翻譯調控元件。強化受體細胞中蛋白質的生物合成過程。

上述(2)和(3)兩點均涉及到基因表達調控的分子生物學原理。基因工程原理及實驗技術(4)基因工程菌(細胞)是現代生物工程中的微型生物反應器，在強化并維持其最佳生產效能的基礎上，從工程菌(細胞)大規模培養的工程和工藝角度切入，合理控制微型生物反應器的增殖速度和最終數量，也是提高外源基因表達產物產量的主要環節，這里涉及的是生物化學工程的基本理論體系。因此．分子遺傳學、分子生物學以及生物化學是基因工程原理的三大基石。基因工程原理及實驗技術.四、生物工程等概念生物工程：直接或間接利用生物體的機能生產物質的技術。包括發酵技術、基因重組、細胞融合、細胞大量培養、生物反應器等技術。生物技術：是在細胞水平上，特別是在分子水平上對生物體遺傳性實現巨大的接近定向改造的一套內容繁多和復雜的技術。包括基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程等。基因工程原理及實驗技術現代科技革命高新技術生物技術基因工程基因克隆基因工程原理及實驗技術第二節

基因工程的發展歷史基因工程的發展歷史概括為三個階段

基因工程的誕生

基因工程的成熟基因工程的騰飛基因工程原理及實驗技術一、基因工程的誕生

基因工程是一項新興的工程技術，它的誕生需要理論和技術上的支持理論上的三大發現技術上的三大發明基因工程原理及實驗技術證明了生物的遺傳物質是DNA（基因工程的先導）DNA的雙螺旋結構和半保留復制機理遺傳信息的傳遞方式（中心法則）1.理論上的三大發現基因工程原理及實驗技術

證明了生物的遺傳物質是DNA（基因工程的先導）：1944年首先用體外的轉化實驗證明基因的化學本質就是DNA分子的是加拿大生物化學家艾弗里O.T.Avery（1877-1955）。他和他的合作者C．M．MacLeod及M．McCarty在紐約進行細菌轉化的研究。

1)遺傳物質是DNA基因工程原理及實驗技術

體外的轉化實驗證明基因就是DNA分子基因工程原理及實驗技術2).DNA的雙螺旋結構和半保留復制機理

DNA雙螺旋結構的發現Watson（沃森）andCrick（克里克）（1953）

美國遺傳學家Watson(J.Watson)和英國生物學家克里克(F.Crick)

1953年4月25日DNA的雙螺旋結構假說（不到1000字的短文）《核酸的分子結構——脫氧核糖核酸的一個結構模型》在（自然）雜志上發表。1個月后在（自然）雜志上又發表了遺傳物質的復制機理。1962年與M.H.F.Wilkins共獲諾貝爾生理學獎。DNA半保留復制機理的證明－Meselson-Stahl實驗(1958)DNA復制模式的破解M.Meselson(MatthewMeselson,西爾遜)andF.W.Stahl(FranklinStahl,斯塔爾)(1958)1958年來西爾遜（Meselson）和斯塔爾（Stahl）首次在分子水平上成功地證明了DNA的半保守復制（semiconservativereplication）利用氮標記技術在大腸桿菌中首次證實了DNA的半保留復制(15N)

基因工程原理及實驗技術DNA半保留復制圖基因工程原理及實驗技術3）遺傳信息的傳遞方式（中心法則）

中心法則的確立F.Crick(1958)中心法則的確立F.Crick(1958)中心法則的確立F.Crick(1958）1958年克里克確立的中心法則(1971年修改),最早提出遺傳密碼這一名詞的是量子力學奠基人之一，奧地利物理學家施勒丁格(E．Schrodinger，1944)。第一個提出遺傳密碼具體設想的是美國物理學家G.Gamov，他通過推算提出了三聯體密碼子的概念，并且進一步推論一種氨基酸可能不止有一個密碼子。第一個用實驗破譯密碼子的是馬太(Matthaei)和尼倫伯格(Nirenberg)，1966M.NirenbergandH.Khorana（1968年諾貝爾生理醫學獎獲得者）建立了完整的遺傳密碼表基因工程原理及實驗技術DNA技術分子體外切割與連接技術限制性內切酶(1970)和DNA連接酶(1967)發現，標志著DNA重組時代的開始基因工程載體技術

1970載體（vector）的使用成功1970年，逆轉錄酶的發現使真核基因的制備成為可能。2技術上的三大發明基因工程原理及實驗技術DNA技術分子體外切割與連接技術

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—限制性內切酶和DNA連接酶的發現限制性核酸內切酶HindⅡ1970年，美國生化學家Simith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離提純了限制性核酸內切酶

HindⅡ（1978年諾貝爾生理醫學獎獲得者)EcoR1限制性核酸內切酶(1972年Bover實驗室發現）G↙AATTCDNA連接酶的發現：1967年世界上5個實驗室幾乎同時發現了DNA連接酶。1970年，在美國Khorana實驗室發現了一種高效連接活性的DNA連接酶—T4DNA連接酶

基因工程原理及實驗技術

1970美國DulleccoTemin和Baltimore（1975年諾貝爾生理醫學獎獲得者）在腫瘤病毒中存在反轉錄酶打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。

DNA分子序列分析及相關技術的發展也推動了基因工程的發展DNA分子的核苷酸序列分析技術，瓊脂糖凝膠電泳和Southern雜交技術等技術的展。基因工程載體技術1970載體（vector）的使用成功.1970年λ噬菌體導入大腸桿菌細胞內（轉化）1970年，逆轉錄的發現.基因工程原理及實驗技術

1973年，美國斯坦福大學Boyer和Cohen等獲得了抗四環素和抗新霉素（卡那霉素）的重組菌落，標志著基因工程的誕生。1973年建立的基因工程的基本模式為標志的。他們將大腸桿菌體內的兩個不同的質粒提取出來，拼接成一個雜合的質粒。當雜合質粒被導入大腸桿菌后，它能在大腸桿菌內復制并表達雙親質粒的遺傳信息。這是基因工程的第一個成功的克隆轉化實驗。

Tetracycline

pSC101EcoRIDNALigaseKanamycin

R6-5Kanr

andTetr基因工程的誕生標志基因工程原理及實驗技術基因工程的成熟

1977年日本的Itakura及其同事首次在大腸桿菌中克隆并表達了人的生長激素釋放抑制素基因。幾個月后．美國的Ullvich克隆并表達了人的胰島素基因。1978年，美國Genentech公司開發出利用重組大腸桿菌合成人胰島素的先進生產工藝，從而揭開了基因工程產業化的序幕。

基因工程原理及實驗技術表1-1主要基因工程產品的研制、開發、上市時間產品時間國家用途上市時間國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美國乙肝1986歐洲人白細胞介素1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國基因工程原理及實驗技術三、基因工程的騰飛：1.1982年，美國人，大鼠生長激素基因轉入小鼠；

2.1983年，美國人，Ti質粒導入植物細胞（細菌Neor基因）

3.1990年，美國人，腺苷脫氨酶（ADA）基因治療，重度聯合免疫缺陷癥（SDID）

4.1990年，美國倡導，人類基因組計劃，15年時間30億USD；2000年6月26日各國科學家向全世界宣布“人類基因組計劃”工作草圖繪制成功，“基因”和“基因組研究”更是成為人們談論的焦點問題。2003人類基因組側序完成。5.1997年，英國，克隆多利綿羊基因工程原理及實驗技術基因工程原理及實驗技術三、基因工程的騰飛：基因工程原理及實驗技術基因工程原理及實驗技術基因工程原理及實驗技術四.基因工程的意義

基因工程可以繞過遠緣有性雜交的困難，使基因在微生物、植物、動物之間交流，迅速并定向的獲得人類需要的新的生物類型概括地講，其意義體現在以下三個方面大規模生產生物分子；

設計構建新物種；

搜集、分離、鑒定生物信息資源

基因工程原理及實驗技術導致第四次工業大革命

1980年11月15日，美國紐約證券交易所開盤的20分鐘內，Genentech公司的新上市股要