分子生物學原核生物的轉錄教學要求掌握一些基本概念:轉錄的不對稱性,有義鏈,反義鏈

,轉錄單元掌握大腸桿菌RNA聚合酶的組成及各部分的功能理解大腸桿菌σ因子尤其是σ70的功能和識別序列掌握原核生物轉錄的過程第1節轉錄的基本原則第2節大腸桿菌RNA聚合酶第3節大腸桿菌σ70

啟動子第4節轉錄過程主要內容MolecularBiologyCourse第1節

轉錄的基本原則一、轉錄概述二、RNA合成的過程1.轉錄(Transcription):生物體以DNA為模板合成RNA的過程。

TranscriptionRNADNA

一、轉錄概述CentralDogmaofmolecularbiologyInformationstoreinDNAflows:FromDNA→DNA(Replication)FromDNA→RNA(Transcription)FromRNA→Protein(Translation)FourtypesofRNAmadeMessenger

RNAMostoftheRNAincellsisfoundinribosomes--ourprotein-synthesizingmachinesThetransferRNAmoleculesusedtoaddeachnewaminoacidtogrowingproteins.SmallRNAmoleculesareinvolvedinregulating,processinganddisposingoftheconstanttrafficofmessengerRNA.MessengerRNATransferRNARibosomalRNASmallNuclearRNA(eukaryotes)Somepromotersarenot.Somepromotersequencearenotsufficientlysimilartotheconsensussequencetobestronglytranscribedundernormalcondition,thusactivatingfactorisrequiredforefficientinitiation.StructureofatypicaltranscriptionunitSensestrand由6個堿基組成，其中心位于-10位置處，在許多不同的大腸桿菌基因啟動子中都存在。顯著的增強全酶與正確啟動子結合位點相結合的特異性。AACTGT（1）新生RNA鏈發夾結構形成Transcriptionbubble全酶（HoloEnzyme）功能2、依賴ρ因子的終止子Transcriptionbubbleb由rpoB編碼,b’由rpoC編碼.TranscriptionterminationofProkaryotic保守序列為TATAAT.2.轉錄所需的物質Theprecursorribonucleotides(前體核糖核酸):NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)Template(模板):DNAEnzyme(酶):RNApolymerase(RNA-pol)RNA聚合酶OtherproteinfactorsRNAistranscribed5

→3

3.轉錄所需的模板(1)結構基因：DNA分子上，能編碼RNA或蛋白質的DNA片段。(2)Templatestrand(antisense

strandorWatsonstrand)

模板鏈或反義鏈:

根據堿基互補原則指導RNA合成的DNA鏈。

(3)Codingstrand(sense

strandorCrickstrand)

編碼鏈或有義鏈:與mRNA序列相同的那條DNA鏈nonsensesenseRNApolymeraseATPGTPCTPUTP5

3

3

5

TemplatestrandCodingstrandCodingstrandTemplatestrandStructuralgeneDirectionoftranscriptionDirectionoftranscription4.Asymmetrictranscription(不對稱轉錄)

DNA鏈上只有部分的區段作為轉錄模板(反義鏈或模板鏈),且模板鏈并非自始至終位于同一股DNA單鏈上，稱為轉錄的不對稱性。5.transcriptionunit（轉錄單元）一段從啟動子開始至終止子結束的DNA序列。包括上游調控區、結構基因區、下游轉錄終止區三個部分。原核生物的轉錄單位多為多順反子,真核生物中的轉錄單位多為單順反子。轉錄起點即轉錄原點記為＋1，其上游記為負值，下游記為正值。PromoterTerminatorTranscribedregionSensestrandAntisensestrandDNARNATranscription+1StructureofatypicaltranscriptionunitIstranscribedregionequaltocodingregion?Why?單林娜制作15

lacIRegulatorygenelacZlacYlacADNAm-RNAβ

-GalactosidasePermeaseTransacetylaseProteinStructuralGenesPlacIPlacOlac6.轉錄與復制的比較相同點的：Template:DNA底物:nucleotideDirection:5′→3′DNA-dependentpolymerase依賴DNA的聚合酶Watson-CrickbasepairingProduct:polynucleotidechain多聚核苷酸鏈不同點replicationtranscription模板兩股鏈均作為模板模板鏈作為模板原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶產物子代DNA雙鏈mRNA;tRNA;rRNA配對A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物需RNA引物--------方式(特點)半保留復制不對稱轉錄二、

RNA合成的過程RNA聚合酶識別啟動子Initiation起始Elongation延伸Termination終止第2節大腸桿菌RNA聚合酶以DNA為模板合成單鏈RNAArthurKornberg(left)withhisson,Roger,afterRogerreceivedtheNobelPrizeinChemistryfor2006.ArthurKornbergreceivedtheNobelPrizeinPhysiologyorMedicinein1959.BothfatherandsonarefacultymembersattheStanfordUniversitySchoolofMedicine.Kornbergswiththepolymerases"Therehavegottobetensofthousandsofpeoplearoundtheworldtodaywhoseeyesaretearingupwiththenewsthathe'sgone.""Hewasanextraordinaryscientist.Hisaccomplishmentsmightbecalledlegendary."

不需要引物以DNA為模板5′3′合成需要Mg2+沒有3’5’外切活性，核苷酸的錯誤摻入率為10-4-10-5

由多亞基構成的酶一、RNApolymerase以DNA為模板，催化2個游離的NTP形成3’，5’-磷酸二酯鍵二、E.coliRNA聚合酶E.coli

只有一種RNA聚合酶，指導所有類型RNA的合成最大的酶之一全酶至少由5個亞基構成,2alpha(a),and1ofbeta(b),betaprime(b’),omega(w)andsigma(s)亞基RNA合成的速率:37oC下

40nt/sE.ColiRNApol的亞基組成β’βα

α

ω

σ

只用于起始

用于起始和延伸

BacterialRNApolymeraseAACTGTIstranscribedregionequaltocodingregion?Why?序列形成（富含G/C）掌握大腸桿菌RNA聚合酶的組成及各部分的功能DNA-酶-底物NTP三元起始復合物的形成Thereisconsiderablevariationinsequencebetweendifferentpromoters,andthetranscriptionefficiencycanvarybyupto1000-fold.TranscriptionterminationofProkaryotic4)轉錄產物RNA沿5’3’方向延長TransferRNA(2)Templatestrand(antisensestrandorWatsonstrand)模板鏈或反義鏈:根據堿基互補原則指導RNA合成的DNA鏈。(recognitionsite)Example:LacpromoterPlacrequiresactivatingprotein,cAMPreceptorprotein(CRP，環腺苷酸受體蛋白),tobindtoasiteontheDNAclosetothepromotersequenceinordertoenhancepolymerasebindingandtranscriptioninitiation.RNApolymeraseDNA模板上有終止信號SmallRNAmoleculesareinvolvedinregulating,processinganddisposingoftheconstanttrafficofmessengerRNA.1.α亞基由rpoA編碼核心酶的組建因子

促使RNApol與DNA模板鏈結合前端α因子－－使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈尾端α因子－－使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈α＋α2α＋β

α2β＋β’BacterialRNApolymeraseb

由rpoB

編碼,b’由rpoC

編碼.RNA聚合酶的催化中心.bsubunit：含有兩個結構域分別負責轉錄的起始和延伸。2.bandb

亞基b’亞基結合兩個鋅離子，參與酶的催化功能。負責酶與模板DNA相結合(充當SSB的作用)。許多原核生物含有多個s

因子，用于識別不同的啟動子，最常見的是s70核心酶與s因子結合轉變為全酶。啟動子識別中起著關鍵的作用轉錄起始后，sfactor解離(RNAchainis9-10nt)細胞中s

因子比其他亞基少。3.s

因子E.coli中不同的

因子可識別不同的啟動子GeneFactorUseSequence

SeparationSequence

－35

－10

70

General

32Heatshock

EHeatshock

54

Nitrogen

Fflagellar

大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對分子量亞基數組分功能αrpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動子識別βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶用于模板的結合ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多種σ因子，用于識別不同的啟動子CoreEnzyme

具有的四個功能位點

ααβ’β★

DNA/RNA雜交位點(β)

★

D.S.DNA解鏈位點(α)

★

D.S.DNA重旋(α)

★啟動子識別位點

σ★

DNA無義鏈結合位點(β’)

4.全酶（HoloEnzyme）功能用于轉錄的起始和延伸依靠空間結構與DNA模板結合(σ與核心酶結合后引起的構象變化)專一性地與DNA序列(啟動子)結合結合常數：1014／mol轉錄效率低，速度緩慢（σ的結合）BacterialRNApolymerase5.核心酶（CoreEnzyme）的功能作用于轉錄的延伸過程（終止）依靠靜電引力與DNA模板結合（蛋白質中堿性基團與DNA的磷酸根之間）非專一性的結合（與DNA的序列無關）結合常數：1011／molBacterialRNApolymeraseT3RNA聚合酶和T7

RNA聚合酶小分子轉錄速度快(200nt/sec)

識別自身啟動子RNApolymerasediffersfromorganismtoorganism6.其他RNA聚合酶第三節大腸桿菌s70啟動子一、

Promoter啟動子二、promoterefficiency啟動子的效率一、Promoter啟動子特異的短的保守序列位于轉錄起始位點的上游，用負數表示。是RNA聚合酶特異性結合和轉錄起始所必須的。是指DNA分子上被RNA聚合酶識別并結合形成起始轉錄復合物的區域，它還包括一些調節蛋白因子的結合位點。Differentpromotersresultindifferingefficienciesoftranscriptioninitiation,whichinturnregulatetranscription.PromoterTerminatorTranscribedregionSensestrandAntisensestrandDNARNATranscription+1-55to+20:全酶的結合-20to+20:聚合酶緊密結合，防止DNaseΙ的降解Uptoposition–40:最重要

(mutagenesisanalysis)-10and–35sequence:6bp,對大腸桿菌基因的起始轉錄最關鍵s70promoter開始轉錄TTGACAAACTGT-35區(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物啟動子保守序列RNA-pol辨認位點(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保護區結構基因3

3

-10sequence(Pribonowbox，Pribonow框)高度保守序列，位于DNA解旋開始的部位。由6個堿基組成，其中心位于-10位置處，在許多不同的大腸桿菌基因啟動子中都存在。保守序列為TATAAT.頭兩個堿基(TA)

和最后的堿基T

高度保守。與轉錄起始位點(+1)之間的距離為5-8bp。RNAchain起始發夾結構的突變可阻止轉錄的終止前端α因子－－使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈Negativesupercoiling(負超螺旋)&unwinding(一)、終止子的種類RNA聚合酶的催化中心.Termination終止Elongation延伸(一)、終止子的種類使轉錄復合物趨于解離，RNA產物釋放。17個核苷酸的DNA形成解鏈區，產物RNA鏈大約有12個核苷酸與模板形成RNA-DNA雜合雙鏈StructureofatypicaltranscriptionunitRNA聚合酶（全酶）中的σ因子在DNA雙鏈上迅速、隨機滑動，尋找到啟動子-35區，形成疏松的復合物，DNA雙鏈未解開。★啟動子識別位點σ(rho-dependentterminators)其功能是:(1)RNApol緊密結合;(2)形成開放啟動復合體；酶在此處與DNA結合成穩定的復合物，在轉錄方向上解開雙鏈形成開放型起始結構。

(3)使RNApol定向轉錄。-35sequence(Sextama盒,Sextamabox):

RNA聚合酶的起始識別區；σ亞基識別-35序列，為轉錄選擇模板位于-35位置處的一個保守的六聚體序列TTGACA頭三個堿基(TTG)是高度保守的與–10box之間的距離為16-19bpRNA聚合酶的松弛（初始）結合位點RNA聚合酶依靠其σ亞基識別該位點，為轉錄選擇模板——識別位點重要性:很大程度上決定了啟動子的強度Transcriptionstartsite轉錄起始位點轉錄開始時模板上的第一個堿基，90％基因的起始位點是嘌呤G比A普遍(i.e.CGTorCAT)在起始核苷酸的兩側是C和T大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A100以DNA為模板合成單鏈RNA酶移動到轉錄起始位點，第一個rNTP轉錄開始,σ因子釋放,形成酶-啟動子-rNTP三元復合體（ternarycomplex）。轉錄速度快(200nt/sec)——RNApol解離——轉錄終止轉錄起始后，sfactor解離(RNAchainis9-10nt)DNA模板上有終止信號1、不依賴ρ因子的終止子(強終止子)轉錄起點即轉錄原點記為＋1，其上游記為負值，下游記為正值。細胞中s因子比其他亞基少。Tonextpic.RNA聚合酶（全酶）移向-10區和轉錄起始當RNA聚合酶聚合新生RNA鏈為9~10個核苷酸時，σ因子脫離全酶，進入延伸階段。coli中不同的因子可識別不同的啟動子第三節大腸桿菌s70啟動子全酶至少由5個亞基構成,2alpha(a),and1ofbeta(b),betaprime(b’),omega(w)andsigma(s)亞基二、promoterefficiency啟動子的效率Thereisconsiderablevariationinsequencebetweendifferentpromoters,andthetranscriptionefficiencycanvarybyupto1000-fold.The–35sequence

:s因子識別的區域.The-10sequence

對DNA解旋起著重要的作用。起始位點周圍的序列影響起始效率。最初轉錄的30個堿基控制著RNA聚合酶離開啟動子，使另一聚合酶復合物重新起始轉錄的速率。Somepromotersequence

arenotsufficientlysimilartotheconsensussequence

tobestronglytranscribedundernormalcondition,thusactivatingfactorisrequiredforefficientinitiation.Example:

Lac

promoter

Plac

requiresactivatingprotein,

cAMP

receptorprotein

(CRP，環腺苷酸受體蛋白),

tobindtoasiteontheDNAclosetothepromotersequenceinorderto

enhancepolymerasebindingandtranscriptioninitiation.Weakpromotersandactivatingfactor第4節轉錄過程一、RNA鏈起始二、RNA鏈延伸三、RNA鏈終止一、RNA鏈起始Promoterbinding啟動子結合DNAunwindingDNA解旋RNAchaininitiationRNA鏈起始1.

啟動子的結合尋找啟動子的速度非常快全酶與－35序列結合，產生封閉的酶-啟動子二元復合物and–10regionLink核心酶a2bb’w,

與DNA的結合無特異的親和性，結合非常松散顯著的增強全酶與正確啟動子結合位點相結合的特異性。Theroleofsfactor

inpromoterbinding

2.

DNA解旋全酶緊密地結合在-10序列處，模板DNA局部變性，形成開放的啟動子二元復合體+1DNA解旋是必須的，使反義鏈通過堿基配對合成RNA。Negativesupercoilingenhancesthetranscriptionofmanygenes，sinceitfacilitates(有利于)unwinding.Somepromotersarenot.Exceptionalexample:

promtersfortheenzymesubunitsofDNAgyrase(旋轉酶)

areinhibitedbynegativesupercoiling,servingasanelegantfeedbackloopforDNAgyraseexpression.Negativesupercoiling(負超螺旋)&unwinding3.

RNAchain起始+1酶移動到轉錄起始位點，第一個rNTP轉錄開始,σ因子釋放,形成酶-啟動子-rNTP三元復合體（ternarycomplex）。StartswithaGTPorATPRNApolymeraseholoenzyme(+sfactor)closedpromotercomplex(moderatelystable)thesigmasubunitbindstothe-10regiononceinitiationtakesplace,RNApolymerasedoesnotneedveryhighaffinityforthepromotersigmafactordissociatesfromthecorepolymeraseafterafewelongationreactionselongationtakesplacewiththecoreRNApolymeraseopenpromotercomplex(highlystable)theholoenzymehasveryhighaffinityforpromoterregionsbecauseofsigmafactorssigmacanre-bindothercoreenzymesThesigmacycless起始過程：RNA聚合酶全酶搜索并結合DNA特異位點RNA聚合酶全酶接觸DNA分子,通過接觸-解離-再接觸搜索啟動子序列閉和的啟動子復合體RNA聚合酶（全酶）中的σ因子在DNA雙鏈上迅速、隨機滑動，尋找到啟動子-35區，形成疏松的復合物，DNA雙鏈未解開。開放的啟動子復合體RNA聚合酶（全酶）移向-10區和轉錄起始點,在-20區DNA雙鏈解開12-17bp時的啟動子復合體。DNA-酶-底物NTP三元起始復合物的形成在聚合酶全酶的作用下，聚合第一個磷酸二酯鍵以及連續的一小段新生RNA鏈。當RNA聚合酶聚合新生RNA鏈為9~10個核苷酸時，σ因子脫離全酶，進入延伸階段。σα2ββ’5’5’原核生物轉錄起始過程二、

RNAchain延伸Transcriptionbubble(轉錄泡)1)

亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿3’5’方向前移；

2)

在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。

3)

RNA-DNA形成12bp長的雜交螺旋

4)

轉錄產物RNA沿5’

3’方向延長單林娜制作61

7啟動子清除:起始成功后，s

因子釋放出來，形成一個由RNA聚合酶-DNA-新生的RNA組成的三聚體，核心酶向下游移動離開啟動子。Transcriptionbubble:

(轉錄泡)17個核苷酸的DNA形成解鏈區，產物RNA鏈大約有12個核苷酸與模板形成RNA-DNA雜合雙鏈RNA聚合酶沿著DNA鏈移動，在轉錄泡之間解開雙螺旋，在轉錄泡之后形成雙螺旋。TheE.colipolymerasemovesatanaveragerateof~40ntpersec,dependingonthelocalDNAsequence.Transcriptionbubble三、轉錄的終止

TranscriptionterminationofProkaryoticRNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進，轉錄產物RNA鏈從轉錄復合物上脫落下來。(一)、終止子的種類(二)、原核生物轉錄的終止TranscriptionterminationofProkaryotic

(一)、終止子的種類1、不依賴ρ因子的終止子/內在終止子(rho-independentterminators/intrinsicterminators)

體外實驗中，只有核心酶和終止子就足以使轉錄終止。2、依賴ρ因子的終止子

(rho-dependentterminators)

蛋白質輔助因子－－ρ因子存在時，核心酶終止轉錄

兩者有共同的結構特征（序列差異）1、不依