GB/T21605—XXXX化學(xué)品急性吸入毒性試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了化學(xué)品急性吸入毒性試驗(yàn)方法的規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、試驗(yàn)原則、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告。本文件適用于評(píng)價(jià)可吸入受試物，如氣體、揮發(fā)性物質(zhì)、氣溶膠或顆粒狀物可否經(jīng)呼吸道吸收及其急性毒性。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列定義和術(shù)語適用于本文件。3.1急性吸入毒性acuteinhalationtoxicity實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)（指24h或24h之內(nèi)）一次連續(xù)吸入較高濃度的受試物（氣體、蒸汽、氣溶膠或顆粒狀物）出現(xiàn)的健康損害效應(yīng)。3.2吸入劑量inhaleddose動(dòng)物單位體重所吸入受試物的量。3.3半數(shù)致死濃度midianlethalconcentration（LC50）在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，經(jīng)呼吸道一次連續(xù)吸入受試物后，引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計(jì)學(xué)濃度，以單位體積空氣中受試物的質(zhì)量（mg/m3）來表示。3.4質(zhì)量中值空氣動(dòng)力學(xué)直徑massmedianaerodynamicdiameter（MMAD）由空氣動(dòng)力學(xué)直徑大小不一的顆粒組成的氣溶膠樣品中，小于和等于某一空氣動(dòng)力學(xué)直徑的顆粒占?xì)馊苣z樣品總質(zhì)量或總重量50%時(shí)，則該氣溶膠顆粒空氣動(dòng)力學(xué)直徑即為此氣溶膠樣品的質(zhì)量中值空氣動(dòng)力學(xué)直徑。3.545GB/T21605—XXXX幾何標(biāo)準(zhǔn)差geometricstandarddeviation（GSD）用以描述氣溶膠顆粒粒徑范圍的無量綱數(shù)。幾何標(biāo)準(zhǔn)差越小，含相似大小的顆粒比例越高，亦即氣溶膠顆粒的均一性越好，離散度越低。通常，將幾何標(biāo)準(zhǔn)差小于或等于2的氣溶膠樣品稱為單相分散氣溶膠。3.6可吸入顆粒直徑inhalablediameter能夠通過動(dòng)物的口和/或鼻吸入并沉淀在呼吸道任意部位的顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑。通常將空氣動(dòng)力學(xué)直徑在10μm以下的氣溶膠顆粒物稱為可吸入顆粒物。3.7劑量-反應(yīng)關(guān)系dose-responserelationship劑量與特定效應(yīng)的發(fā)生率間的關(guān)系。3.8最小致死濃度minimallethalconcentration（LC01）指一組試驗(yàn)動(dòng)物中，僅引起個(gè)別動(dòng)物死亡的最小劑量。3.9絕對(duì)致死濃度absolutelethalconcentration（LC100）引起一組試驗(yàn)動(dòng)物全部死亡的最低劑量。4試驗(yàn)?zāi)康脑u(píng)價(jià)可吸入受試物，如氣體、揮發(fā)性物質(zhì)、氣溶膠或顆粒物可否經(jīng)呼吸道吸收及其急性毒性，用于受試物危險(xiǎn)性評(píng)估，并可按GHS對(duì)受試物進(jìn)行毒性分類，同時(shí)還可為該物質(zhì)急性毒性強(qiáng)度及亞急性毒性、蓄積毒性和特殊毒性試驗(yàn)選擇劑量提供依據(jù)。5試驗(yàn)原則5.1在考慮根據(jù)本文件進(jìn)行試驗(yàn)之前，應(yīng)收集受試物相關(guān)的所有可用信息，包括已有的研究數(shù)據(jù)，如已有相關(guān)研究數(shù)據(jù)，可以不再開展新的試驗(yàn)，以盡量減少動(dòng)物的使用。受試物的有用信息包括受試物的特性（如純度化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)；任何體外或體內(nèi)毒性試驗(yàn)結(jié)果；預(yù)期用途和人體暴露的可能性；能得到的結(jié)構(gòu)類似物的構(gòu)效關(guān)系數(shù)據(jù)和毒理學(xué)數(shù)據(jù)等。5.2應(yīng)盡可能避免在預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重疼痛和/或痛苦的濃度下測(cè)試腐蝕性和/或刺激性的受試物。受試物是否具有腐蝕性/刺激性，應(yīng)由專家綜合所有數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，并分析是否可以免除進(jìn)一步的試驗(yàn)。需收集的數(shù)據(jù)包括來自人和動(dòng)物的數(shù)據(jù)（例如，在非腐蝕性/刺激性濃度下進(jìn)行的重復(fù)劑量研究中獲得的數(shù)據(jù)）、已有的體外數(shù)據(jù)、pH值、類似物質(zhì)的信息或任何其他相關(guān)數(shù)據(jù)。如有特定的監(jiān)管需求，可以使用本文件對(duì)具有腐蝕性和/或刺激性的受試物進(jìn)行測(cè)試，受試物的濃度不能引起嚴(yán)重的刺激/腐蝕性，但應(yīng)足以將濃度-反應(yīng)曲線擴(kuò)展到達(dá)到監(jiān)管和科學(xué)目標(biāo)的水平。需逐步選擇受試物的濃度，并提供濃度6GB/T21605—XXXX選擇的理由。5.3本文件旨在獲取足夠的受試物的急性毒性信息，以便對(duì)其進(jìn)行分類，并為一個(gè)或兩個(gè)性別提供致死性數(shù)據(jù)（例如LC50、LC01和斜率以滿足定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的需要。本文件提供兩種試驗(yàn)方法。第一種方法是傳統(tǒng)的LC50法，將幾組動(dòng)物暴露于一個(gè)限定濃度（限度試驗(yàn)）或按梯度設(shè)置的一系列濃度，通常持續(xù)4h。為了滿足特定的監(jiān)管目的，可能會(huì)應(yīng)用其他持續(xù)時(shí)間的暴露，但應(yīng)提供合理的理由。第二種方法是濃度-時(shí)間法（CXt將動(dòng)物暴露在一個(gè)限定濃度或一系列不同濃度，而且每個(gè)濃度的暴露時(shí)間也不同。染毒結(jié)束將動(dòng)物移至空氣清潔的室內(nèi)。需觀察染毒期間及終止染毒后試驗(yàn)動(dòng)物中毒體征與嚴(yán)重程度。死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行大體解剖，觀察期結(jié)束處死存活動(dòng)物并作大體解剖和病理學(xué)檢查。瀕死動(dòng)物或明顯處于痛苦中或表現(xiàn)出嚴(yán)重且持續(xù)痛苦跡象的動(dòng)物應(yīng)實(shí)行安樂死，并等同于在試驗(yàn)中死亡的動(dòng)物。6試驗(yàn)方法6.1動(dòng)物種屬選擇應(yīng)使用剛成年健康的動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)室常用品系。首選大鼠，如需選用其他品系需說明理由。6.2動(dòng)物準(zhǔn)備雌性動(dòng)物應(yīng)該是未妊娠和未生產(chǎn)的。在暴露開始時(shí)，動(dòng)物周齡一般8-12周，體重差異不得超過平均體重的±20%。動(dòng)物應(yīng)是隨機(jī)選擇的，并具有唯一性的標(biāo)識(shí)。動(dòng)物應(yīng)至少在開始試驗(yàn)前5d置于籠中以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件。動(dòng)物也應(yīng)該在試驗(yàn)開始前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備一段時(shí)間以減少進(jìn)入新環(huán)境引起的不適。每個(gè)濃度組需要雌雄性各5只動(dòng)物。6.3飼養(yǎng)條件動(dòng)物房的室溫控制在23±3℃。相對(duì)濕度30%-70%。試驗(yàn)前和染毒后每個(gè)濃度組動(dòng)物按性別和濃度分籠飼養(yǎng)，每籠動(dòng)物數(shù)以不干擾動(dòng)物個(gè)體活動(dòng)及觀察反應(yīng)為宜，并盡量減少因搶食和打架造成的損失。當(dāng)動(dòng)物通過僅鼻部暴露染毒時(shí)，可能需要適應(yīng)染毒裝置一段時(shí)間。鼻部暴露裝置不應(yīng)對(duì)動(dòng)物造成不適當(dāng)?shù)膲毫Γ珞w溫變化或呼吸頻率的改變等。如有數(shù)據(jù)表明不引起以上改變，則不需要適應(yīng)。當(dāng)動(dòng)物通過全身暴露方式染毒時(shí)，在染毒期間，為避免動(dòng)物從同伴的毛發(fā)吸入受試物氣溶膠，動(dòng)物應(yīng)單籠飼養(yǎng)。動(dòng)物食用常規(guī)和經(jīng)認(rèn)證的飼料，自由飲水（暴露期間除外）。應(yīng)該提供人工照明，12h明/12h暗。6.4受試物6.4.1受試物的形態(tài)可以是氣體、蒸汽、氣溶膠或它們的混合物，主要取決于受試物的物理化學(xué)性質(zhì)、選定的濃度，以及在處理和使用受試物時(shí)最可能存在的物理形態(tài)。吸濕性和化學(xué)反應(yīng)性受試物應(yīng)在干燥空氣條件下進(jìn)行試驗(yàn)。應(yīng)注意避免造成爆炸的濃度。6.4.2在染毒時(shí)受試物須在空氣中保持一定濃度，必要時(shí)應(yīng)加入適當(dāng)?shù)馁x形劑（首選水）。賦形劑本身無毒性，不與受試物反應(yīng)并不影響受試物的吸收。依據(jù)受試物的理化性質(zhì)調(diào)試染毒裝置，包括確定受試物的氣化和配氣方法，載氣種類，氣流速度，排氣方式等。6.4.3顆粒物質(zhì)可能需要經(jīng)過機(jī)械處理以達(dá)到所需的粒徑分布，但是要注意不要分解或改變受試物。如果認(rèn)為機(jī)械處理改變了受試物的組成，應(yīng)該通過分析方法驗(yàn)證受試物的組成。應(yīng)該采取足夠的預(yù)防措施避免受試物受到污染。沒有必要測(cè)試那些特意配制成不可吸入的非易碎顆粒材料。6.4.4研究中盡可能地使用一組受試物，而且其樣本應(yīng)該在能保持其純度、同質(zhì)性、穩(wěn)定性的條件下保存。在研究開始之前，應(yīng)對(duì)受試物進(jìn)行表征分析，包括其純度，如果技術(shù)上可行，還應(yīng)包括已識(shí)別的污7GB/T21605—XXXX染物和雜質(zhì)的特性和數(shù)量。可以通過以下數(shù)據(jù)來證明，但不限于：質(zhì)譜或氣相色譜分析中的保留時(shí)間、相對(duì)峰面積和分子量或其他值。6.5對(duì)照動(dòng)物一般不設(shè)陰性對(duì)照組。當(dāng)使用除水以外的賦形劑時(shí)，如果沒有其吸入毒性試驗(yàn)的歷史數(shù)據(jù)，需加入一個(gè)賦形劑對(duì)照組。如果在已有毒性試驗(yàn)中顯示賦形劑無毒，可以斷定這個(gè)賦形劑在測(cè)試濃度下是無毒的，因而可不設(shè)賦形劑對(duì)照組。6.6暴露條件監(jiān)測(cè)6.6.1暴露裝置動(dòng)物應(yīng)在吸入染毒設(shè)備中進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)受試物的物理特性和試驗(yàn)?zāi)康倪x擇染毒裝置。首選的暴露方式是僅鼻部暴露，特別是在研究液體、固體氣溶膠或可凝結(jié)成為氣溶膠的蒸汽時(shí)。如有特殊目的必須采用全身暴露方式染毒，需在試驗(yàn)報(bào)告中說明。采用全身暴露時(shí)，要保證染毒柜中氣流的穩(wěn)定性，試驗(yàn)動(dòng)物的總體積不應(yīng)超過染毒柜容積的5%。6.6.2室內(nèi)氣流染毒柜中氣流要連續(xù)監(jiān)測(cè)，至少每小時(shí)記錄一次。O2濃度不低于19%，CO2濃度不高于1%。如無法達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)，需說明理由，并監(jiān)測(cè)O2和CO2的濃度。6.6.3室內(nèi)溫度和相對(duì)濕度室內(nèi)溫度應(yīng)保持在22±3。C。無論是僅鼻道暴露還是全身暴露，動(dòng)物呼吸區(qū)域的相對(duì)濕度應(yīng)至少監(jiān)測(cè)三次并記錄。暴露時(shí)間超過4h或小于4h時(shí)，應(yīng)每小時(shí)記錄一次。理想情況下，相對(duì)濕度應(yīng)保持在30%至70%的范圍內(nèi)，無法實(shí)現(xiàn)時(shí)需說明理由。6.6.4受試物：計(jì)算濃度應(yīng)計(jì)算并記錄吸入室中受試物的計(jì)算濃度。計(jì)算濃度是受試物的質(zhì)量除以通過暴露系統(tǒng)的空氣總體積。計(jì)算濃度不用于描述動(dòng)物的暴露情況，但是計(jì)算濃度與實(shí)際濃度的比較可以指示試驗(yàn)系統(tǒng)的生成效率，因此可以用來發(fā)現(xiàn)生成過程中存在的問題。6.6.5受試物：實(shí)際濃度6.6.5.1實(shí)際濃度是指吸入室動(dòng)物呼吸區(qū)域受試物的濃度。實(shí)際濃度可以通過特定方法（例如直接采樣、吸附或化學(xué)反應(yīng)方法，以及后續(xù)表征分析）或非特定方法（如重量分析法）獲得。重量分析僅限于單一成分粉末氣溶膠或低揮發(fā)性液體氣溶膠，并且應(yīng)有適當(dāng)?shù)念A(yù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。如有分析數(shù)據(jù)證明空氣中物質(zhì)的組成與起始物質(zhì)相似，多組分粉末氣溶膠的濃度也可以通過重量分析來確定。如無可用信息，在研究過程中可能需要定期對(duì)受試物（理想情況下是其空氣中的狀態(tài)）進(jìn)行再分析。對(duì)于可能蒸發(fā)或升華的氣溶膠物質(zhì)，應(yīng)通過所選方法證明已收集所有相。研究報(bào)告中應(yīng)提供目標(biāo)濃度、計(jì)算濃度和實(shí)際濃度，但僅實(shí)際濃度用于統(tǒng)計(jì)分析以計(jì)算致死劑量。6.6.5.2應(yīng)盡可能地使受試物的實(shí)際濃度維持恒定，并根據(jù)分析方法連續(xù)和/或間歇監(jiān)測(cè)。當(dāng)使用間歇采樣時(shí)，暴露時(shí)間為4h時(shí)，至少采集兩次室內(nèi)氣體樣本。如果由于空氣流速有限或濃度低而無法實(shí)現(xiàn)，可以在整個(gè)暴露期間收集一個(gè)樣本。如果樣本間波動(dòng)明顯，下一步試驗(yàn)的濃度應(yīng)每次暴露采集4個(gè)樣本。單個(gè)室濃度樣本不應(yīng)超過平均濃度的±10%（氣體和蒸汽）或±20%（液體或固體氣8GB/T21605—XXXX溶膠）。應(yīng)計(jì)算并記錄吸入室受試物濃度達(dá)到平衡的時(shí)間（t95）。暴露持續(xù)時(shí)間應(yīng)涵蓋受試物生成的時(shí)間。6.6.5.3對(duì)于氣體/蒸汽和氣溶膠組成非常復(fù)雜的混合物，每個(gè)相在吸入室中可能表現(xiàn)不同，因此至少應(yīng)選擇每個(gè)相（氣體/蒸汽和氣溶膠）的一個(gè)指示物質(zhì)（分析物通常是受試物配方中的主要活性物質(zhì)。當(dāng)受試物是混合物（例如，一種配方）時(shí)，應(yīng)報(bào)告總配方的分析濃度，而不僅僅是活性成分或組分（分析物）的濃度。6.6.6粒徑分布6.6.6.1應(yīng)對(duì)所有氣溶膠以及可能凝結(jié)成氣溶膠的蒸汽進(jìn)行粒徑分析。在4h的暴露期間，應(yīng)至少使用級(jí)聯(lián)撞擊器或如空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分析儀等替代儀器，兩次確定氣溶膠的粒徑分布。如果能夠證明級(jí)聯(lián)撞擊器或替代儀器獲得的結(jié)果具有等效性，那么在整個(gè)研究中可以使用替代儀器。應(yīng)與主要儀器并行使用第二臺(tái)設(shè)備，如重量分析濾器、沖擊式吸收管、氣體泡沫吸收管等，以確認(rèn)主要儀器的收集效率。通過粒徑分析獲得的質(zhì)量濃度應(yīng)與通過濾器分析獲得的質(zhì)量濃度一致。6.6.6.2為了使呼吸道的所有相通區(qū)域均有受試物，推薦使用MMAD在1-4μm，GSD在1.5-3.0的氣溶膠。如無法實(shí)現(xiàn)，應(yīng)經(jīng)專家評(píng)估判斷。例如，金屬煙霧的粒徑可能小于此標(biāo)準(zhǔn)，而帶電粒子、纖維和吸濕性材料（在呼吸道濕潤(rùn)環(huán)境中粒徑會(huì)增加）的粒徑可能超過此標(biāo)準(zhǔn)。6.7試驗(yàn)程序有兩種試驗(yàn)方法：傳統(tǒng)的LC50法和濃度-時(shí)間法（CXt）。兩種方法都可能包括預(yù)試驗(yàn)、主試驗(yàn)和/或限度試驗(yàn)（傳統(tǒng)方法）或在限定濃度下進(jìn)行試驗(yàn)（CXt）。如果已知一個(gè)性別更易感，可以選擇只使用易感性別進(jìn)行研究。如果暴露的嚙齒動(dòng)物種類不是大鼠，并且采用的是僅鼻道暴露方式，最大暴露持續(xù)時(shí)間可能需要調(diào)整以減少特定物種的痛苦。6.7.1傳統(tǒng)的LC50法在傳統(tǒng)法中，暴露時(shí)間通常為4h。動(dòng)物暴露在一個(gè)限定濃度（限度試驗(yàn)）或在至少3組不同的濃度下（主試驗(yàn)）。除已知受試物信息外，在開展主試驗(yàn)前，需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。6.7.1.1預(yù)試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)可用來估計(jì)受試物的毒性效應(yīng)，確定易感性的性別差異，并為限度試驗(yàn)或主試驗(yàn)的濃度選擇提供幫助。在選擇預(yù)試驗(yàn)的濃度水平時(shí)，應(yīng)該充分利用所有可獲得的信息，比如構(gòu)效關(guān)系數(shù)據(jù)和類似化學(xué)物的信息。試驗(yàn)中，每個(gè)濃度水平的每種性別的試驗(yàn)動(dòng)物不超過3只。通常使用一個(gè)濃度水平。但如果需要，也可以測(cè)試更多濃度。已經(jīng)進(jìn)行過的其他研究可以用來替代預(yù)試驗(yàn)。6.7.1.2限度試驗(yàn)當(dāng)受試物已知或預(yù)期基本無毒時(shí)，可采用限度試驗(yàn)。受試物的毒性作用信息，可以來源于已測(cè)試過的類似化合物或混合物或產(chǎn)品的特性和具有毒理意義的組成成分。在限度試驗(yàn)中，雌雄各3只動(dòng)物暴露在限定濃度中。按照GHS的分類系統(tǒng)，氣體、蒸汽、氣溶膠的限定濃度分別為20000ml/m3(μl/L）、20如果在限定濃度發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡或?yàn)l死，則限度試驗(yàn)的結(jié)果可作為其他濃度試驗(yàn)（如主試驗(yàn)）的預(yù)試驗(yàn)。如果受試物的理化性質(zhì)決定其不可能達(dá)到限定濃度，則需測(cè)試其最大可及濃度。如果最大可及濃度的死亡率小于50%，則不需進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。9GB/T21605—XXXX6.7.1.3主試驗(yàn)進(jìn)行主試驗(yàn)時(shí)，一般每個(gè)濃度組有10只動(dòng)物，雌雄各半（或5只易感性別的動(dòng)物且至少有3個(gè)濃度水平。必須有足夠多的濃度水平足以繪制出濃度死亡曲線，并在可能情況下求出LC50值。各暴露組之間的時(shí)間間隔取決于中毒體征的出現(xiàn)、持續(xù)時(shí)間與嚴(yán)重程度。是否需要對(duì)下一濃度水平進(jìn)行試驗(yàn)，取決于先前的試驗(yàn)動(dòng)物是否能夠成活。6.7.2濃度-時(shí)間法（CXt）濃度-時(shí)間法（CXt）是傳統(tǒng)的LC50法的一種替代方法。這種方法使試驗(yàn)動(dòng)物暴露在不同濃度的受試物水平，而且暴露時(shí)間也不同。所有的試驗(yàn)都采用僅鼻部吸入的方法。具體方法見附錄1。與傳統(tǒng)法相比，濃度-時(shí)間法得到的LC01與LC100的值更加穩(wěn)定。當(dāng)在4個(gè)濃度水平和5種暴露持續(xù)時(shí)間的主試驗(yàn)采用濃度-時(shí)間法時(shí)，每個(gè)濃度-時(shí)間間隔只需使用2只動(dòng)物（雌雄各半或易受影響的單一性別）。在某些情況下，在每濃度-時(shí)間間隔，也可以選擇兩種性別的動(dòng)物各2只。這能減少參數(shù)估計(jì)的誤差和變異性，增加成功率，提高置信區(qū)間的覆蓋范圍。當(dāng)用來參數(shù)估計(jì)的數(shù)據(jù)擬合不好時(shí)，可能需要第5個(gè)濃度水平。6.7.2.1預(yù)試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)一般用各性別、各濃度3只動(dòng)物，它可以為主試驗(yàn)選擇一個(gè)合適的初始濃度和最大化減少動(dòng)物使用。暴露時(shí)間通常為4h。如果能從其他試驗(yàn)中得到死亡數(shù)據(jù)，那么可以不進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。在選擇研究中的初始目標(biāo)濃度時(shí)，應(yīng)該考慮在其他試驗(yàn)中觀察到的各性別和各濃度的死亡率。6.7.2.2主試驗(yàn)初始濃度（第一步暴露）可能是限定濃度，也可能是根據(jù)預(yù)試驗(yàn)選擇的濃度。每組雌雄各1只動(dòng)物暴露于此濃度下，持續(xù)時(shí)間不同（如15、30、60、120、240min總共用到10只動(dòng)物（附錄1）。限定濃度可根據(jù)監(jiān)管要求選擇，按照GHS，氣體、蒸汽、氣溶膠的限定濃度分別為20000ml/m3(μl/L）、20mg/L和5mg/L（或?yàn)樽畲罂杉皾舛龋Ｈ绻诘谝徊奖┞吨邪l(fā)現(xiàn)死亡，則引起死亡的最小暴露濃度將為下一步試驗(yàn)的濃度建立提供指導(dǎo)。每一個(gè)后續(xù)的試驗(yàn)都將取決于先前的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于很多受試物，在初始濃度得到的結(jié)果與在其他3個(gè)濃度組得到的結(jié)果，如果暴露時(shí)間間隔適當(dāng)，就能足以繪制濃度-時(shí)間-死亡曲線。對(duì)于處理濃度-時(shí)間法得到的試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析方法，參見附錄1。6.8觀察6.8.1臨床觀察6.8.1.1動(dòng)物在暴露期內(nèi)應(yīng)該頻繁進(jìn)行臨床觀察。在暴露剛開始當(dāng)天應(yīng)該至少進(jìn)行兩次臨床觀察，或者根據(jù)動(dòng)物對(duì)處理的反應(yīng)進(jìn)行更頻繁的觀察。觀察期限最少為14d，以后每天至少進(jìn)行一次觀察。觀察期限長(zhǎng)短不做硬性規(guī)定，可依據(jù)臨床癥狀和體征的性質(zhì)和時(shí)間以及恢復(fù)期的時(shí)間長(zhǎng)短來決定。中毒體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間都十分重要，特別是在有中毒體征延遲趨勢(shì)時(shí)。動(dòng)物瀕死、疼痛劇烈與嚴(yán)重且持久的痛苦皆應(yīng)予以安樂死。當(dāng)動(dòng)物被安樂死，或者發(fā)現(xiàn)死亡時(shí)，應(yīng)該盡可能的準(zhǔn)確記錄死亡時(shí)間。所有的觀察應(yīng)該被系統(tǒng)的記錄，每一個(gè)動(dòng)物應(yīng)該保持單獨(dú)記錄。6.8.1.2觀察內(nèi)容應(yīng)該包括皮毛，眼睛和黏膜，呼吸，循環(huán)，自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，肢體活動(dòng)和行為的改變。應(yīng)該記錄可能的局部和全身反應(yīng)的差別。要注意有無震顫、驚厥、流涎、腹瀉、昏睡、睡眠和昏迷癥狀。直腸溫度的測(cè)量可為由于處理因素和限制引起的反應(yīng)性呼吸過緩或者低溫/高溫提供證據(jù)。6.8.2體重GB/T21605—XXXX每只動(dòng)物體重應(yīng)該在暴露前一天到暴露（day0)，并且至少在第1天、第3天和第7天（以及此后每周)，以及在第1天后的死亡或安樂死時(shí)進(jìn)行記錄。相比之前數(shù)據(jù)，若動(dòng)物體重出現(xiàn)≥20%的持續(xù)遞減，應(yīng)該進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)。在暴露結(jié)束后，應(yīng)測(cè)量存活動(dòng)物的體重，并人道處死。6.8.3病理學(xué)檢查6.8.3.1所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括那些在試驗(yàn)中死亡的，或者出于動(dòng)物福利原因被安樂死以及從試驗(yàn)中移除的動(dòng)物，應(yīng)該進(jìn)行大體解剖。如果動(dòng)物被發(fā)現(xiàn)死亡后，不能被立即進(jìn)行尸體解剖，那么動(dòng)物應(yīng)該被冷藏，溫度應(yīng)足夠低，使試驗(yàn)動(dòng)物的損失減少到最低限度。應(yīng)盡可能快地進(jìn)行尸體解剖，通常在1-2d內(nèi)。記錄每個(gè)動(dòng)物的大體病理變化，并特別注意呼吸道改變。6.8.3.2附加檢查可為研究提供更為深入的解釋價(jià)值，例如測(cè)量存活大鼠肺的重量，和/或提供呼吸道刺激性的顯微鏡檢查證據(jù)。對(duì)表現(xiàn)出大體病理變化，器官已知或預(yù)期會(huì)受到影響的存活24h及以上的動(dòng)物，應(yīng)該檢查相應(yīng)器官。對(duì)整個(gè)呼吸道的顯微鏡檢杳可為易與水發(fā)生反應(yīng)的受試物（例如）提供有用的信息，例如酸性和吸濕性受試物。7數(shù)據(jù)與報(bào)告7.1數(shù)據(jù)應(yīng)該提供每只動(dòng)物的體重和尸檢發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)。臨床觀察數(shù)據(jù)應(yīng)該以表格的形式呈現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)出各組使用的動(dòng)物的數(shù)量，出現(xiàn)特殊中毒特征的動(dòng)物數(shù)量，試驗(yàn)中死亡或者人道處死的動(dòng)物數(shù)量，動(dòng)物個(gè)體的死亡時(shí)間，毒副作用的描述和時(shí)間進(jìn)程，可逆體征以及尸檢發(fā)現(xiàn)。7.2試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該包括以下內(nèi)容：7.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件——描述籠框條件，包括：每個(gè)籠子動(dòng)物的數(shù)量(或者數(shù)量改變)，鋪蓋材料，周圍溫度以及相關(guān)濕度，光周期，以及飲食；——使用動(dòng)物的種屬、品系，以及使用大鼠外其他物種的理由；——?jiǎng)游锏臄?shù)量，年齡和性別；——隨機(jī)化的方法；——詳細(xì)的飼料和水的質(zhì)量（包括飼料類型/來源，水源)；——試驗(yàn)前的狀態(tài)，包括飲食，檢疫和疾病治療。7.2.2受試物——物理性質(zhì)，純度，以及相關(guān)的理化性質(zhì)（包括異構(gòu)化);——鑒定材料，CAS編號(hào)。7.2.3賦形劑——使用除水以外的賦形劑和選擇賦形劑的理由；——以往或者同期數(shù)據(jù)顯示賦形劑不影響研究結(jié)果。7.2.4吸入室——吸入室的描述，包括規(guī)格和體積；——用于動(dòng)物暴露的設(shè)備和產(chǎn)生氣流的設(shè)備的來源和描述；——測(cè)量溫度，濕度，粒徑和實(shí)際濃度的設(shè)備；GB/T21605—XXXX——空氣來源，調(diào)節(jié)空氣的系統(tǒng)，供氣/排氣的方式；——用于校正保證氣流均一性的儀器的方法；——壓力差（正和負(fù))；——每個(gè)吸入裝置的暴露端口（僅鼻部暴露時(shí))；動(dòng)物在染毒裝置中的位置(全身暴露時(shí))；——即時(shí)的氣流均一性/穩(wěn)定性；——溫度和濕度傳感器的位置，以及吸入室的氣體抽樣；——?dú)饬魉俣龋┞抖丝诘臍饬魉俣龋▋H鼻部暴露)，或吸入裝置的動(dòng)物負(fù)荷（全身暴露)；——用來測(cè)量O2和CO2設(shè)備的信息；——吸入室中濃度達(dá)到平衡所需要的時(shí)間（t95)；——每小時(shí)的體積改變；——測(cè)量設(shè)備。7.2.5暴露數(shù)據(jù)——在主試驗(yàn)中，選擇目標(biāo)濃度的原因；——計(jì)算濃度（送入吸入室中受試物的總量除以通過的空氣的總體積)；——從動(dòng)物呼吸帶位置收集的受試物實(shí)際濃度；對(duì)于產(chǎn)生的多種的物理形態(tài)（氣體，蒸氣，氣溶膠）的混合物，每一種形態(tài)應(yīng)該被單獨(dú)分析；——所有空氣中的濃度，應(yīng)該以質(zhì)量濃度為單位（如mg/L、mg/m3等）進(jìn)行報(bào)告，也可附帶以體積分?jǐn)?shù)為單位（如10-6，10-9等)；——粒徑分布、空氣動(dòng)力學(xué)直徑中值（MMAD)，以及幾何標(biāo)準(zhǔn)差(σg）和它們的計(jì)算方法。還應(yīng)該報(bào)告?zhèn)€體粒徑分析。7.2.6試驗(yàn)條件——準(zhǔn)備受試物的詳細(xì)資料，包括降低固體材料的顆粒大小的過程的詳細(xì)資料，或者準(zhǔn)備受試物溶液的詳細(xì)資料，如機(jī)械加工過程可能改變受試物的構(gòu)成，還應(yīng)包括確認(rèn)受試物構(gòu)成的分析結(jié)果；——用于產(chǎn)生受試氣體和使動(dòng)物暴露的在試驗(yàn)氣體的設(shè)備的描述(最好包括圖表)；——詳細(xì)的化學(xué)分析的方法以及方法的有效性（包括采樣設(shè)備的分離受試物的效率)；——選擇試驗(yàn)濃度的理由。7.2.7結(jié)果——吸入室的溫度、濕度和氣流的表格；——吸入室的計(jì)算、實(shí)際濃度數(shù)據(jù)的表格；——粒徑數(shù)據(jù)的表格，包括分析樣本收集數(shù)據(jù)、粒徑分布、MMAD和幾何標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算：——每只動(dòng)物的反應(yīng)數(shù)據(jù)和濃度水平的表格（動(dòng)物表現(xiàn)出的毒性效應(yīng)，包括死亡率，嚴(yán)重程度，效應(yīng)發(fā)生和持續(xù)的時(shí)間)；——在研究期間，每只動(dòng)物的體重，先于安樂死的死亡的日期和時(shí)間，毒性效應(yīng)開始和持續(xù)時(shí)間過程，以及它們對(duì)于每個(gè)動(dòng)物是否可逆；——提供每只動(dòng)物的解剖發(fā)現(xiàn)和病理組織學(xué)報(bào)告；——死亡參數(shù)（LC50，LC01）包括其95%置信區(qū)間和斜率；——統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，包括濃度-時(shí)間法中指數(shù)n的估計(jì)及使用的統(tǒng)計(jì)軟件名稱。7.2.8結(jié)果的討論與解釋——特別強(qiáng)調(diào)的是，所用方法滿足試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，例如限定濃度或者粒徑；——應(yīng)該處理顆粒的可吸入性，尤其是在粒徑標(biāo)準(zhǔn)不能被滿足時(shí)：——根據(jù)文件，應(yīng)該為那些處于疼痛中或者顯示出嚴(yán)重和持久的不適體征的動(dòng)物而進(jìn)行的安樂死作GB/T21605—XXXX出解釋；——按本文件進(jìn)行試驗(yàn)的理由；——研究評(píng)價(jià)中應(yīng)該有確定計(jì)算濃度與實(shí)際濃度的方法的一致性，以及兩者之間的關(guān)系；——應(yīng)該考慮死亡的可能原因以及占主導(dǎo)的反應(yīng)（全身和局部)。GB/T21605—XXXX濃度-時(shí)間法（CXt）1.逐步進(jìn)行的濃度-時(shí)間法是用來吸入毒性試驗(yàn)傳統(tǒng)法的替代方法。濃度-時(shí)間法可優(yōu)先用于檢測(cè)動(dòng)物不同暴露持續(xù)時(shí)間的特殊監(jiān)管需要和科學(xué)研究中。濃度-時(shí)間法通常先在限定濃度進(jìn)行試驗(yàn)（暴露Ⅰ)，有5個(gè)不同的暴露持續(xù)時(shí)間（如15，30，60，120，240min)。根據(jù)全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽系統(tǒng)，氣體、蒸氣和氣溶膠的限定濃度分別為20000ml/m3(μl/L）、20mg/L和5mg/L。2．受試物的毒性資料缺乏或較少時(shí)，可能需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)：各性別不超過3只動(dòng)物暴露在目標(biāo)濃度下240min。3．如果在暴露Ⅰ中，限定濃度動(dòng)物的死亡率小于50%，沒必要進(jìn)行下一步試驗(yàn)。如果有監(jiān)管或科學(xué)研究需要在比限定濃度更高的濃度建立濃度-時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系，下一步暴露需要更高的濃度進(jìn)行試驗(yàn)（如2倍限定濃度)。4.如果在限定濃度發(fā)現(xiàn)毒性效應(yīng)，需要進(jìn)行下一步試驗(yàn)（主試驗(yàn))。主試驗(yàn)可能在更低濃度調(diào)整的暴露時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)(圖1中的暴露II，Ⅲ,IV’)或在更高濃度較短的暴露時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)（圖1中的暴露Ⅳ)。5．試驗(yàn)各濃度/暴露時(shí)間需雌雄動(dòng)物1只或2只更易受影響性別的動(dòng)物。在某些情況下，也可在各濃度/暴露時(shí)間用雌雄動(dòng)物各2只或4只更易受影響性別的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。這樣可以減少參數(shù)估計(jì)偏倚和變異性，增加參數(shù)估計(jì)成功率和置信區(qū)間的覆蓋范圍。6．理想情況下，每次暴露試驗(yàn)進(jìn)行1天。這樣可以在找到合適的生存率的置信度前延遲進(jìn)行下一步暴露，或調(diào)整下一步暴露的目標(biāo)濃度和持續(xù)時(shí)間。進(jìn)行每步暴露試驗(yàn)時(shí)，先選擇最長(zhǎng)的暴露時(shí)間，如先240min，再120min。如果在240min的組發(fā)現(xiàn)動(dòng)物在90min后出現(xiàn)死亡或嚴(yán)重的毒性效應(yīng)，則不需要進(jìn)行120min的試驗(yàn)（死亡率可能是100%)。在該濃度下，應(yīng)該選擇更短的暴露時(shí)間（如90、65、45、33、25min)。7．應(yīng)經(jīng)常測(cè)量每段暴露時(shí)間染毒柜中的時(shí)間加權(quán)平均濃度。只要可能，每只動(dòng)物的死亡前的暴露時(shí)間（而不是整個(gè)暴露持續(xù)時(shí)間）應(yīng)該用到數(shù)據(jù)分析中去。8．應(yīng)仔細(xì)檢查前4步暴露的結(jié)果，已確認(rèn)有無數(shù)據(jù)缺陷。當(dāng)擬合不好時(shí)，可能需要第5步暴露，以填補(bǔ)數(shù)據(jù)缺陷。9．?dāng)?shù)據(jù)分析將使用到每步暴露的數(shù)據(jù)來得到濃度-