DB51Technicalstandardformonitoringthepinewoodnem四川省市場監督管理局發布I 1 1 1 3 3 3 3 4 6 6 7 本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起本文件起草單位：成都海關技術中心、寧波海關技術中1口岸松材線蟲疫情監測技術規范驗室檢測、監測樣品的保存及處理、監測結果GB/T23476-2009松材線蟲病檢疫技GB/T23478松材線蟲普查監測SN/T1724-2006進境針葉樹原木、木制品和木質包裝材料中松材線蟲的檢SN/T4350-2015旅客攜帶物和郵寄物檢疫鑒定學名：Bursaphelenchusxylophilus(寄生滑刃亞科（Parasitaphelenchinae傘滑刃屬（Bursaphelenchus能引起松樹萎蔫病，是針葉樹木上最重要的病原生物之一。松材線蟲相關信息參松褐天牛MonochamusalternatusHope,18432又名松墨天牛、松天牛，屬于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是為害松樹云杉花墨天牛MonochamussaltuariusGebler,1830又名云杉花黑天牛，屬于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛屬（Monochamus），是一種蛀干性昆松木及其制品pinewoodandwoodenw木質包裝材料woodpackingma色物將胞壁染色，促使木材藍變的現象。藍變是判斷松材線蟲監測抽樣的一個重海關指定監管場地customsdesignatedsupervisio高風險動植物及其產品實施查驗、檢驗、檢海關監管貨物cargounderc減免稅貨物，以及暫時進出口貨物、保稅貨物和34監測范圍墊材料、運輸工具、郵寄物及旅客攜帶物。松材線蟲的寄主植物范圍參見附錄A.牙以及中國臺灣等國家或地區的松木及其制品、郵寄物及旅客攜重點抽取材質干燥無松脂香味、有藍變、有媒樣品標識信息應完整、清晰，確保可溯源、可追查，規范填寫附錄表B4誘捕時間一般為每年的4月下旬至10月底（不同地區有差異），即松墨天牛成蟲羽化初期開始，直誘捕器下端離地面1.5m～2.0m。誘捕器上下兩端應用鐵絲綁牢并固定，正確添加或更換引誘劑，應注照GB/T23476-2009中附錄C執行。分離時室內溫度應保持在20℃~30℃之間，或置于恒溫培養箱中進置體視顯微鏡下鏡檢（放大倍率10X～20X為宜）。媒介昆蟲樣品的分離分離線蟲，也可直接浸泡于加水的表面皿或培養皿中，2h后在體視顯微鏡下直接觀察是否有線蟲。以避免漏檢），轉移到載玻片上，液滴體積50μL左右為宜。在酒精燈上以1s左右的頻率通過8次~10次，使線蟲恰好被殺死為宜。加蓋玻片，制成臨時玻片。若分離的線蟲均為幼蟲或數量極少影響后球、尾部，尤其注意雌蟲陰門區以及雄蟲交合刺，并拍攝顯微照片。一般在40倍物鏡下，拍攝雌蟲頭5部、陰門區、尾部各1張照片，拍攝雄蟲頭部和尾部各1張照片，必要時在100倍油鏡下拍攝。顯微鏡配測量并計算體長/蟲體最寬處體寬（a）、體長/尾長（c）、尾長/肛門處體寬（c’）等值。如樣品足夠，應測量雄蟲、雄蟲各20條以上。測計方法參考SN/T27松材線蟲特異PCR檢測見附錄E，實時熒光PCR檢測見附錄F，DNA條形碼鑒定見復核提供復核的材料為具松材線蟲雌雄成蟲的線蟲分離液9監測樣品的保存及處理6），7A.1發現歷史和背景松材線蟲最早于1929年從美國德克薩斯州的長葉松（Pinuspalustris）木材中分離到，被描述為樹枯死的記錄，損失巨大，但長期未找到病因。直到1971年等確認其為異名，松材線蟲從此被定名為Bursaphe1970。A.2地理分布美國、加拿大、墨西哥、日本、韓國、西班牙、葡萄A.3侵染循環松材線蟲通過墨天牛屬（Monochamus）昆蟲在寄主植物間傳播。天牛蛹中羽化后即將離開寄主樹通過傷口進入松樹后，立即轉為繁殖階段，4d～5d即可發育為成蟲。松材線蟲利用天牛的發育過程，通過取食和產卵這兩種途徑，傳播到新的寄A.4傳播途徑8本松材線蟲的傳播媒介為松褐天牛（M.alternatus）、云杉花墨天牛（M.saltuarius），北美洲為卡羅來納墨天牛（M.carolinensis），葡萄牙為樟子松墨天牛（M.galloprovincialis）。天牛科其它屬及鞘翅目樹加工成的木質包裝材料中經常被截獲。因此，松材線蟲A.5松材線蟲生活史段。在25℃的有利條件下，松材線蟲從卵開始，經過4個繁殖階段的幼蟲齡期（J1至J4），在4蟲在腸道細胞中積累脂肪，可在干旱、低溫或營養缺乏的逆境下存活。通常該齡幼蟲蛻皮成為分散型4齡幼蟲JIV（持久型幼蟲），再由媒介甲蟲傳播給新的樹木。然而，如果條件變得適合線蟲發育，例如將分散型3齡幼蟲JⅢ接種到真菌培養皿中，線蟲會發育成為繁殖型4齡幼蟲J松材線蟲的寄主主要是松屬（Pinusspp.）針葉木，我國寄主主要加拿大云杉（P.canadensis）、北美云杉（P.pungens）、歐洲落葉松（Larixeuropaea）、美加落葉松松屬以外的寄主很少在感染松材線蟲后死亡。目前僅美國報道藍杉（Piceapungens）和花旗松（Pseudotsugamenziesii）感染松材線A.7松材線蟲雌蟲尾形變化綜述然而，這不是絕對的。許多學者的研究證實的占77%（其中圓尾型占44%超過1μm（1.46μm～3.41μm）的占23%。2005年，趙文霞等報道到黑松后重新分離，4.2%雌蟲有尾尖突；接種到油松上，15%雌蟲有尾尖突，但未測量尾尖突長度。尖突，平均長度約為1.7μm，最長達2.9μm。但該線蟲經灰葡萄孢培養后，所有雌蟲尾均寬圓，無尾度為0.5μm～1.2μm，較本文的群體更短。2011年，顧建鋒等報道了一種美國木質包裝中截獲的松材線蟲，從木質包裝中直接分離獲得的雌蟲約一半尾端寬圓，無尾尖突；其余則有很短的尾尖突，約0.5μm～1μm。但經過灰葡萄孢人工培養一月后，超過一半雌蟲有1μm～2μm的尾尖突，另有大約10%的雌蟲尾尖突為2μm～2.4μm，其余雌蟲則無尾尖突或小于0.5μm。2020年，顧建鋒等從遼寧紅松分離9到一種具明顯尾尖突的松材線蟲，其雌蟲尾末部分均有或長或短的尾尖突，末端鈍圓或銳尖，長1.8松材線蟲雌蟲均有尾尖突、或者尾尖突長度超過2μm的情況是比較罕見的，從實驗室對上千批次松材末端寬圓，無尾尖突。群體內一些雌蟲有短尾尖突，但長度不超過2μm。并且，通常群體內總能發現號【檢查時間】具體到年月日；——偽傘滑刃線蟲B.fraudulentusRühm，1956（J.B.Goodey，1960）——擬松材線蟲B.mucronatu——灰黃錦天牛傘滑刃線蟲B.luxurio——楊傘滑刃線蟲B.populiTomalak&Filipiak，2010——擬灰黃錦天牛傘滑刃線蟲B.paraluxuriosaeGu,Wang,Braasch,2012——日本冷杉傘滑刃線蟲B.firmaeKanzaki,Maehara,Aikawa&Matsumato,2012——韓國傘滑刃線蟲B.koreanusGu,Wang&Chen,2013——吉拉尼傘滑刃線蟲B.gillaniiSch?nfeld,Braasch,Riedel&Gu,2013——錦天牛屬傘滑刃線蟲B.acaloleptaeKanzaki,Ekino,Maehara,Aikawa&Giblin-Davis,20松材線蟲組線蟲均具有以下共同鑒定特征：側線4條；典型的雄蟲交合刺形狀（較長、弓形，喙突明顯，遠端一般有盤狀突：均與松材線蟲交合刺形態相似）；尾乳突7個，P4明顯，P3和P4鄰近且位于交合傘起始處；雌蟲陰門蓋較長（圖C.1）。上述特征中，由于側線和尾乳突特征有時在光學顯微鏡下）；注：A.持久型幼蟲；B.繁殖型幼蟲；C.雌蟲；D.雄蟲；E.繁殖型幼蟲體前端；F.雌蟲陰門區；G.繁殖型幼蟲尾部；注：該群體為紅松中分離到的松材線蟲，其雌蟲3%，其余絕大部分均有或長或短的尾尖突，末端鈍圓或銳尖，長1.8μm±0.7μm(0.3μm～3.2葡萄孢人工培養后，所有的雌蟲尾端鈍圓，均無尾尖突。A～N.直接從紅松樣品分離到的松材線蟲雌蟲尾形；圖D.4遼寧紅松中分離到的松材線蟲注：A.體前部；B.中食道球區；C、E.雄蟲尾部；D.雌蟲陰門區；F～I.雌蟲尾部。松材線蟲M型株系雌蟲具有長約2.2μm～3.0μm的尾尖突，且經人工培養后仍如此。而松材線蟲R型株系盡管有些個體會有短尾尖突，甚至有些群體大部分都有尾尖突，但尾尖突一般在人工培養后消失。目前M型松材線蟲僅分布于北美，其寄主主要是注：A.頭部；B.交合傘及尾乳突；C-D、F-GABDCABDCEFHGEFHGJILKJILK注：A-B.陰門；C.交合刺；D.交合傘；E-H.培養后雌蟲尾部；I-L.原木中分注：A、B.頭部；C.雌蟲陰門蓋；D.雌蟲陰門至尾末端；E-F.培養后的雌蟲尾部形態；G.木質包裝中直接分離的雌μLPCR管中（含8μLddH2O和1μL10×PCR）），），加熱10min，即得到線蟲DNA模板。得到的DNA提取液可直X-FX-R222ddH2O以松材線蟲DNA模板作為陽性對照，以不含松材線蟲的DNA模板作為陰性對照，以ddH2O作為空V/cm～5V/cm電場強度電泳，約0.5h，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統上拍照并保留結果。采用X-F/X-R引物對擴增后，電泳檢測得到與陽性對照一致的560bp左右大小的特有條帶J10-1/J10-2Rc引物對得到160bp左右大小的特有條帶，判定結果為陽性；否則判定結果為陰性。每個樣品設置3個平行實驗，同時每次檢測設立3個對照，分別為：含有松材線蟲DNA的陽性對照，2212ddH2O熒光信號的收集條件應與探針的熒光基團一致，具體設置方法參照相應熒光P應根據實際情況調整基線范圍。閾值設置原則以基線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，且Ct 該引物正常的PCR擴增產物片段大小為800bp左右，若樣品PCR擴增獲得正），使用Chormas軟件或其他序列分析軟件，對28S基因測序得到的雙向峰圖文件（后綴名.ab）進行拼接。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需對測序質量進行評估，去除測序結果兩端峰形雜亂的低質量序列，并去除引物所在序列區域，獲得相應的DNA序列。拼接完成后，DNA序列方向應與PCR擴增正（/Blast.cgi）進行比對。在BasicBLAST中選擇nucleotideblast，在Enter（Per.Ident）。在BLAST結果中查看序列相似性最高若待測樣品序列與已知的松材線蟲序列（AY508107.1、EF446929.1-EF446933.1、EF446935.1、AM396580.1等）相似性（Per.Ident值）達98.98%以上，與其他種類的相似性材線蟲陽性。若待測樣品序列與已知的松材線蟲相似性低于98.98%如BLAST結果所顯示的線蟲不是傘滑刃屬線蟲，甚至不是線蟲，很可能是實驗過程中由于操作不[1]顧建鋒,王江嶺.傘滑刃屬線蟲形態和分子鑒定圖譜[M].廈門大學出版社,2011.[2]劉偉,楊寶君.松材線蟲和擬松材線蟲雄蟲交合傘形狀的比較[J].林業科學研究,1995,10(2):223-225.[3]夏永剛,王明旭,張玉榮,等.臨湘市具尾尖突松材線蟲病病原的鑒定及病源分析[J].湖南農業大學學報(自然科學版),2009.[4]趙文霞,楊寶君.松材線蟲雌蟲尾部形態和寄主的關系[J].林業科學研究,2005,18(3):362-363.[5]鄭煒,顧建鋒,吳昊,等.寧波馬尾松中松材線蟲形態變異研究[J].浙江林業科技,2007(03):38-40.[6]BraaschH,BurgermeisterW,GuJ.Revisedintragener(Nematoda:Aphelenchoididae).JournalofNematodeMorphologyandSystematics,2009,12:65-88.[7]KiyoharaT,TogushigeY.Inoculationexperimentsofanematode,Bursaphelenchussp.trees[J].NihonRingakkaiShi/JournaloftheJapaneseForestrySociety,1971,53(7):105-114.[8]Mamiya,Yasuharu,Enda,Nobuo.TransmissionofBursaphelenchusLignicolus(Nematoda:Aphelenchoididae)ByMonochamusAlternatus(Coleoptera:Cer