第四章蛋白質的折疊(zhédié)4.1、概述4.2、蛋白質的自發折疊(zhédié)4.3、受助的蛋白質折疊(zhédié)4.4、蛋白質的折疊(zhédié)病4.5、研究蛋白質折疊(zhédié)的意義精品PPT蛋白質折疊(zhédié)的定義蛋白質憑借相互作用在細胞環境(特定的酸堿度、溫度(wēndù)等)下自己組裝自己，這種自我組裝的過程被稱為蛋白質折疊。4.1、概述精品PPT蛋白質折疊問題是生命科學領域的前沿課題之一，并且被列為“21世紀的生物物理學”的重要課題，它是分子生物學中心法則尚未解決的一個重大生物學問題。從一級序列預測蛋白質分子的三級結構(jiégòu)并進一步預測其功能，是極富挑戰性的工作。研究蛋白質折疊，尤其是折疊早期過程，即新生肽段的折疊過程是全面的最終闡明中心法則的一個根本問題。精品PPT蛋白質折疊(zhédié)研究的背景遺傳信息的傳遞(chuándì)DNARNAProteins肽鏈有活性的蛋白質天然構象實質上是多肽鏈遺傳信息的傳遞應該是從核苷酸序列到有完整結構的功能蛋白質的全過程。？精品PPT第二(dìèr)遺傳密碼多肽鏈的一級結構決定它的空間結構，既然前者決定后者，一級結構和空間結構之間肯定存在某種確定的關系(guānxì)，這是否也像核苷酸通過“三聯密碼”決定氨基酸順序那樣有一套密碼呢？后來，有人把這設想的一級結構決定空間結構的密碼叫作“第二遺傳密碼”。精品PPT完整的提法應該是遺傳密碼的第二部分，即蛋白質中氨基酸序列與其空間結構的對應關系(guānxì)，國際上稱之為第二遺傳密碼或折疊密碼。精品PPT第二(dìèr)遺傳密碼的特點簡并性在第一遺傳密碼中有所謂“簡并性”，即同一AA可以由不同密碼子所編碼(biānmǎ)，如CGA和AGC都編碼(biānmǎ)為Arg，UCC和AGU都編碼(biānmǎ)為Ser等。第二密碼也同樣有簡并性。現在已經知道有很多氨基酸序列不同的肽鏈可以有極為相似甚至相同的空間結構，這就是第二密碼的簡并性。精品PPT簡并性的證據(zhèngjù)不同生物體中執行相同功能的蛋白質有AA序列上的差異,但卻有相同的整體空間結構。例如：線粒體Cytc的AA序列已經測定，AA殘基數均在104左右,但在不同生物體的Cytc中僅有21個AA是完全相同的，但是所有Cytc的整體空間結構卻是非常相似的。另外，兩個在功能上完全無關的蛋白質，卵類黏蛋白的第三結構域和核糖體結構蛋白L7/L12的C-末端部分在AA序列上僅有3%相同,卻具有幾乎完全相同的空間結構。此外(cǐwài)，對蛋白質進行化學修飾或定點突變，對分子的總體結構沒有影響。精品PPT多意性某些相同的氨基酸序列還可以在不同條件下決定不同的空間結構，這種情況可以稱之為第二(dìèr)遺傳密碼的多意性。例如，天然型朊病毒主要為α-螺旋結構，而感染型的朊病毒卻主要為β-折疊結構，但二者一級結構相同。精品PPT全局性第二密碼必須把蛋白分子作為一個全局來考慮，這就從根本上決定了第二密碼的復雜性，它不可能像第一(dìyī)密碼那樣有簡單的一對一的關系。某些蛋白C-末端少數氨基酸的去除,或側鏈基團的翻譯后修飾，有時都可以對整體構象和功能產生重大影響。在新生肽鏈合成過程中，后形成的肽段可以影響已經形成的肽段的構象從而造成對分子整體的影響。第二密碼的全局性還體現在環境對分子結構的影響上，水分子對于維系蛋白質一定的空間結構有重要作用。精品PPT破譯“第二遺傳(yíchuán)密碼”正是“蛋白質結構預測”從理論上最直接地去解決蛋白質的折疊問題，這是蛋白質研究最后幾個尚未揭示的奧秘之一。精品PPT蛋白質折疊的研究(yánjiū)內容蛋白質折疊的研究，狹義的定義就是研究蛋白質特定三維空間(sānwéikōngjiān)結構形成的規律、穩定性及與其生物活性的關系。在概念上有熱力學的問題和動力學的問題；蛋白質在體外折疊和在細胞內折疊的問題；有理論研究和實驗研究的問題。精品PPT蛋白質折疊(zhédié)研究的概況20世紀60年代，安芬森（Anfinsen）基于還原變性的牛胰RNase的研究提出“自組裝學說(xuéshuō)”Ellis于1987年提出了蛋白質折疊的“輔助性組裝學說(xuéshuō)”。精品PPT經典的蛋白質折疊自組裝(zǔzhuānɡ)學說實驗基礎:Fraekel-Conral和Williams重組(zhònɡzǔ)實驗（20世紀50年代）煙草斑紋病毒外殼蛋白核糖核酸在體外生理條件下重組得到有感染活力的病毒粒子4.2、蛋白質的自發折疊精品PPTSHSHSHSHSHSHSHSH110Anfinsen實驗(shíyàn)8mol/L尿素(niàosù)或6mol/L鹽酸胍及β-巰基乙醇透析去掉尿素及β-巰基乙醇，讓變性酶的巰基在空氣中緩慢氧化，恢復其原有的二硫鍵(4個)和次級鍵，酶的活性又逐漸恢復（95～100%）。牛胰核糖核酸酶精品PPT隨機重組:8個SH形成4個二硫鍵的概率是:1/7×1/5×1/3=1/105核糖核酸酶不僅重新折疊了,而且(érqiě)選擇了105種可能方式中正確的一種。精品PPT60年代，Anfinsen提出氨基酸序列(xùliè)決定了蛋白質特定三維空間結構的著名假說。self-assembly的主導學說：蛋白質的氨基酸序列已經(yǐjing)包含了它的三維結構的全部信息（一級結構決定高級結構）精品PPT細胞內新合成的多肽鏈，在其合成終了之后(zhīhòu)，不需要別的分子的幫助，也不需要額外能量的補充，就應該能夠自發地折疊而形成它的三維結構。——所謂翻譯后的自發折疊過程。體外實驗結論(jiélùn)擴展到體內：精品PPT蛋白質折疊機制(jīzhì)的理論模型框架模型（FrameworkModel）疏水塌縮模型（HydrophobicCollapseModel）成核-凝聚(níngjù)-生長模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）精品PPT精品PPT與大量(dàliàng)現代實驗相矛盾有的蛋白復性效率很低，甘油醛-3-磷酸脫氫酶核糖核酸酶在較高蛋白質濃度、較高溫度(wēndù)等接近生理條件下，復性效率也不高變性蛋白復性是一個較慢過程（幾十分鐘），新生肽鏈的折疊是一個快過程（幾分鐘）。精品PPT新生(xīnshēng)肽鏈的折疊的新觀點:1、新生肽鏈的折疊是隨著(suízhe)肽鏈的延伸同時進行折疊、又不斷進行調整（協調動態過程）先形成的結構會作用于后合成的肽鏈的折疊；后形成的結構會影響已形成的結構的調整；新生肽鏈的合成、延伸、折疊、調整→三維結構4.3、受助的蛋白質折疊精品PPT2、細胞內新生肽鏈的折疊和成熟為功能蛋白，一般來說是需要幫助的，而不是自發(zìfā)的。一類新的生物功能的蛋白，能夠幫助細胞內的其它蛋白折疊精品PPT蛋白質的體外折疊(zhédié)與體內折疊(zhédié)精品PPT幫助新生肽折疊(zhédié)的蛋白（輔助蛋白）分子伴侶(bànlǚ)折疊酶分子內伴侶(bànlǚ)精品PPT分子(fēnzǐ)伴侶-蛋白質的保姆分子伴侶：(Chaperone或molecularchaperone,也可譯為侶伴蛋白)，是細胞內的一類保守蛋白質，可識別肽鏈的非天然構象，促進各功能域和整體蛋白質的正確(zhèngquè)折疊。精品PPT分子(fēnzǐ)伴侶概述分子伴侶的作用機制實際上就是它如何識別靶蛋白，怎樣與它結合，結合后會發生什么變化，在什么條件下又解離(jiělí)，解離(jiělí)后分子伴侶和靶蛋白又會如何等這樣的問題。對此目前認識還很少，現在只知道分子伴侶識別折疊中間物的非天然構象，而不能識別天然的構象。精品PPT幾點說明(shuōmíng)：1）分子伴侶是從功能上定義的，凡具有(jùyǒu)這種功能的蛋白都是分子伴侶，它們的結構可以完全不同，可以是完全不同的蛋白.精品PPT2）分子伴侶(bànlǚ)的作用通過催化的或非催化的方式，加速或減緩組裝過程；傳遞組裝所需要的空間信息；也可能只是抑制組裝過程中不正確的副反應；精品PPT3）分子伴侶一定不是最終組裝完成的結構的組成部分(zǔchénɡbùfèn)一些蛋白酶的前導序列及核糖體蛋白的泛尾肽——分子內分子伴侶精品PPT4）分子伴侶幫助(bāngzhù)正確的“非共價組裝”,排除共價修飾酶.5）不僅幫助(bāngzhù)新生肽鏈的折疊，還幫助(bāngzhù)新生肽成熟為活性蛋白，包括轉運、越膜定位、亞基組裝等。最大一類蛋白為熱激蛋白（Hsp60，Hsp70，Hsp90）精品PPT到底非天然構象的什么特征能被分子伴侶識別呢？確切的原因還未知，目前只知道在天然構象中，疏水殘基多半位于分子的內部而形成疏水核，去折疊后就可能暴露出來，或者在新生肽段的折疊過程中，會暫時形成在天然構象中本應該(yīnggāi)存在于分子內部的疏水表面，因此認為分子伴侶最有可能是與疏水表面相結合。精品PPT分子伴侶(bànlǚ)的類型“HSP”后面的數字(shùzì)表示以kDa為單位的分子伴侶的分子量。輔分子伴侶=GropES+GropEL精品PPTHSP40（DnaJ）I型HSP40II型HSP40底物結合位置2個鋅指，I型獨有尚缺乏N端J-結構域，該結構域能激活(jīhuó)HSP70的ATP酶活性并調節Hsp70與底物的結合。精品PPTHSP40（DnaJ）I型HSP40II型HSP40底物結合位置2個鋅指，I型獨有HSP70（DnaK）底物結合位置C端核苷酸結合位置（N端）精品PPTHSP40與HSP70相互作用示意圖底物精品PPTHsp70作為一種重要的內源性保護因子，可提高肺組織對各種損傷的耐受性。肺組織中Hsp70表達的增加可減輕肺水腫及炎性反應，減少(jiǎnshǎo)肺組織細胞凋亡，從而改善氧合功能，降低病死率。增加心臟組織中Hsp70基因的表達，可使心臟具有抵抗缺血或內毒素損傷的作用Hsp70的其他(qítā)功能精品PPT近幾年，有關Hsp70的研究已成為分子生物學的一大熱點，并逐漸成為臨床多種疾病治療的新途徑。由于Hsp能夠對各種形式(xíngshì)的組織細胞損傷提供保護作用，隨著研究的深人，應用藥物或基因工程等技術誘導Hsp作為肺損傷的治療方法頗具前景。精品PPTGroEL（HSP60）型伴侶(bànlǚ)素存在于真細菌、線粒體和葉綠體中，由雙層7個亞基組成的圓環組成，每個亞基分子量約為60Ku。它們在體內與一種輔助因子，如E.coli中的GroES，協同作用以幫助蛋白折疊(zhédié)。除了葉綠體中的類似物外，這些蛋白是應急反應誘導的。精品PPTGroEL的立體(lìtǐ)結構圖一個(yīɡè)亞基兩個七亞基圓環—頂端結構域中間結構域——赤道

結構域精品PPT一個(yīɡè)亞基GroEL+

GroESGroESGroELGroESGroELGroES為7亞基組成(zǔchénɡ)的盤狀結構GroEL中的頂端結構域向上垂直移動以便和GroES相互作用。精品PPT在未結合(jiéhé)和結合(jiéhé)GroES時GroEL結構域的重排頂端(dǐngduān)結構域中間結構域赤道

結構域疏水面順式環反式環精品PPT結合(jiéhé)了ATP和GroES的GroEL未結合(jiéhé)配體的GroEL球棍模型：疏水側鏈精品PPTGroEL/GroES系統(xìtǒng)促進蛋白質折疊過程分子伴侶的主要作用——為非自發性折疊蛋白質提供(tígōng)能折疊形成天然空間構象的微環境。精品PPT折疊酶蛋白質多膚鏈的折疊過程中，還需要酶的催化，稱之為折疊酶。它們催化與蛋白質折疊直接(zhíjiē)有關的、對形成功能構象所必需的共價鍵變化，幫助蛋白質正確折疊。精品PPT折疊(zhédié)酶類型(1)蛋白質二硫鍵異構酶PDI

(Proteindisulfideisomerase)(2)肽基脯氨酰順反異構酶PPI(Peptidylprolylcis/transisomerase)精品PPT蛋白(dànbái)二硫鍵異構酶(proteindisulfideisomerases，PDI)真核生物的PDI在內質網腔活性很高，細菌中的類似物是Dsb家族，位于細菌外周質(periplasm)，在肽鏈中催化錯配二硫鍵斷裂并形成正確二硫鍵連接，最終使蛋白質形成熱力學最穩定的天然構象。通過催化巰基與二硫鍵的交換反應，從而催化蛋白質二硫鍵的形成、還原（斷裂）或重排（異構化）。在蛋白質折疊過程中，主要催化含有二硫鍵的膜蛋白或分泌(fēnmì)蛋白的正確折疊。精品PPT細菌中含有二硫鍵蛋白質的氧化和異構化過程。DsbA蛋白負責氧化，DsbB是參與重新(chóngxīn)氧化DsbA的一個膜蛋白。還原形式的DsbC催化異構化過程。DsbC的還原態由DsbD維持。在真核生物中，只有PDI1個蛋白在內質網中既負責(fùzé)氧化也負責(fùzé)異構化過程。PDI的重新氧化由FAD依賴型內質網氧化還原蛋白完成。精品PPT肽基脯氨酰順反異構酶(PPI)PPI廣泛分布于各種生物體及各種組織中，多數定位于胞漿，但也存在于大腸桿菌的外周質、紅色面包霉的線粒體基質、酵母、果蠅和哺乳動物的內質網。肽基脯氨酰順反異構酶是蛋白質三維構象形成的限速酶，在細胞中通過非共價鍵方式，穩定扭曲的酰胺過度態，而催化肽基脯氨酰順反式的相互轉變。在肽鏈合成后需形成順式構型時，可使多肽在各脯氨酸彎折處形成準確(zhǔnquè)折疊。精品PPT對于(duìyú)大多數肽鍵而言，反式比順式穩定1000倍。反式順式反式順式第二個殘基為Pro的肽單元(dānyuán)普通肽單元對于第二個殘基為Pro的肽鍵而言，反式僅比順式穩定4倍。精品PPT結構：8個β折疊形成β折疊桶，外側有兩個α螺旋(luóxuán)。結合部位通過結合含脯氨酸的四肽（綠色）而定位。肽基脯氨酰順反異構酶精品PPTPDI和PPI不僅可以起到折疊酶的催化作用，而且具有防止折疊中間體聚集的類似分子伴侶的功能。王志珍等最早提出PDI是分子伴侶的假說(jiǎshuō)并驗證了PDI的這一功能精品PPT分子(fēnzǐ)內伴侶(intramolecularchaperones)1987年，Ikemura發現枯草桿菌素(subtilisin)的折疊需要前肽(propeptide)的幫助。這類前肽常位于信號肽與成熟多肽之間，在蛋白質合成過程中與其(yǔqí)介導的蛋白質多肽鏈是一前一后合成的，并以共價鍵相連接，是成熟多肽正確折疊所必需的，成熟多肽完成折疊后即通過水解作用與前肽脫離。Shinde和Inouye將這類前肽稱為分子內伴侶。精品PPT精品PPT精品PPT4.4、蛋白質的折疊(zhédié)病（folddisease)蛋白質分子的氨基酸序列沒有改變(gǎibiàn)，即一級結構正常，只是其二級結構、乃至立體結構（構象）異常也可導致疾病，這類疾病稱為“構象病”，或稱“折疊病”。精品PPT從本質(běnzhì)上講分子伴侶突變引起的疾病蛋白(dànbái)折疊、轉運異常引起的疾病精品PPT瘋牛病牛海綿狀腦病(bovinespongiformencephalopathy,BSE):俗稱瘋牛病(madcowdisease):1986年首次在英國報道。該病潛伏期4～5年，發病初期表現為體質(tǐzhì)變差，體重減輕，產奶量下降等非特異性癥狀。隨后神經系統癥狀逐步明顯，出現小腦共濟失調、震顫等，由于病牛常表現出感覺過敏、恐懼甚至狂亂，因此俗稱“瘋牛病”。瘋牛病是由朊病毒蛋白(dànbái)(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。精品PPTPrP的一般性質朊病毒蛋白(PrP)是由宿主基因編碼的，其編碼蛋白有兩種形式，一種是正常的細胞型PrP(PrPc)，屬蛋白酶敏感型，是細胞的正常組分；另一種是異常的致病型PrP(PrPsc)，具有(jùyǒu)一定的抗蛋白酶消化特性，是TSE的致病因子。PrPsc經蛋白酶消化后剩下的核心部分分子量約27-30kD(稱PrP27-30)仍具感染性。PrPC是一種膜蛋白，分子量33~35kD，N端含有22個殘基的信號肽序列，C端含有1對二硫鍵和2個N型復合寡糖鏈，以及1個糖基磷脂酰肌醇（GPI）結合位點。精品PPT糖基化的人PrPC蛋白模型：兩個N-連接的寡糖(藍色)，一個二硫鍵連接螺旋(luóxuán)2和3，和糖基磷脂酰肌醇（GPI）的“錨”（它將蛋白錨定在細胞膜外表面）。精品PPTPrPc與PrPsc具有相同的氨基酸順序和共價修飾，但三維結構卻差異很大，傅里葉變換紅外光譜和圓二色譜研究表明，PrPc主要由α螺旋構成，PrPsc則含有40%的β折疊。血清學研究表明，特異的抗體(kàngtǐ)只與PrpSC有血清反應，而與PrpC無反應。精品PPT朊病毒的結構(jiégòu)與功能根據傅里葉變換紅外光譜(guāngpǔ)（FTIR）和圓二色譜（CD）的研究，PrPC和PrPSC的二級結構差異很大，PrPC中含43%的a螺旋，而PrPSC中含有30%的a螺旋和43%的b片層。對PrPSC的免疫原性分析表明，構象的變化主要發生在90~145或175的殘基區域。目前已獲得鼠、羊、人和牛全長PrPC的NMR結構，不同種屬的PrPC的結構都很類似；PrPSC是纖維狀的多聚體，在非變性溶液中是不溶解的，目前還沒有實驗結構。精品PPT不溶性的PrPSC形成(xíngchéng)的纖維狀聚集體酵母Sup35蛋白（酵母細胞中的prion蛋白）形成的纖維的電子顯微像，右側是一根(yīɡēn)放大的纖維。精品PPT小鼠PrPCC端結構(jiégòu)域(121-231)的NMR結構(jiégòu)包括三個α螺旋(luóxuán)和兩股反平行β折疊。其中兩個α螺旋(luóxuán)（螺旋(luóxuán)2和3）通過一個二硫鍵錨定在一起組成V形骨架，另一個a螺旋(luóxuán)（螺旋(luóxuán)1）和2條b折疊鏈附著在此骨架上。精品PPT用分子模擬方法(fāngfǎ)預測的PrP