神經生長因子誘導神經母細胞瘤分化的研究【摘要】目的觀察神經生長因子對神經母細胞瘤(neuroblastoma，NB)細胞增殖的抑制和可能的分子機制及NGF-TrkA信號傳導途徑在NB細胞分化中的作用。方法取本院住院患兒新鮮手術標本，進行原代細胞培養作為細胞模型，通過臺盼藍拒染法計數活細胞；觀察NGF干預前后細胞形態學變化；MTT法檢測細胞的增值活性；RT-PCR分析TrkA表達情況。結果NGF作用NB細胞后，細胞形態發生顯著變化，并可劑量依賴性的抑制細胞增殖，2d時TrkA表達增加，4d以后出現TrkA表達的明顯增加。結論NGF對NB細胞體外增殖有抑制作用并誘導其分化，且表現劑量依賴關系；NGF可誘導NB細胞分化成熟及TrkAmRNA表達水平增高，可能是NGF誘導NB細胞分化逆轉的分子生物學機制之一。

【關鍵詞】神經母細胞瘤神經生長因子細胞分化

【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferentiationandproliferationofneuroblastoma(NB)cellsinducedbynervegrowthfactor(NGF)anditspossiblemechanisms.MethodsNBtumortissueswerecollectedandprimarycellculturewasperformed.Trypanblueexclusionwasusedtocountthealivecells.Morphologicalchangeswereobservedunderthephase-contrastmicroscope.ThechangeofcellproliferationwasdeterminedbymeansofMTTassay.TrkAexpressionwasexaminedbyRT-PCRmethod.ResultsByday,thealivecellsofgroupA、BandCdecreasedbytreatmentofNGF;morphologicalchangesofNBcellswerealsoobserved.RT-PCRdetectionshowedthattheTrkAmRNAexpressionincreasedfromdayandreacheditspeakondayinatimeanddosedependentmannerbytreatmentofNGF.ConclusionNBcellstreatedbyNGFdifferentiatetoneuron-likecellsandthecellgrowthisinhibitedinadose-dependentmanner.TrkA'sexpressionisincreasedbyNGF.ThismaybeoneofthemechanismsofspontaneousregressionofNB.

【Keywords】neuroblastomanervegrowthfactorcelldifferentiation

神經母細胞瘤(neuroblastoma，NB)是起源于胚胎期神經嵴細胞的兒童惡性腫瘤，自然退化常見于新生兒、嬰兒和早期腫瘤，而較大兒童晚期患者惡性程度高，預后差。對化療耐藥是治療失敗的主要原因［1］。如何應用人為方法使NB細胞分化、逆轉、消退，是當今腫瘤界研究的熱點問題［2］，用藥物誘導NB向良性轉化可能成為臨床治療的一個新途徑。

1資料與方法

一般資料

歲男性患兒，因發現“腹部腫物”1周，于XX年6月10日入住本院，行腹部B超、CT檢查，考慮為神經源性腫瘤；于XX年6月12日行剖腹探查、腹部腫物切除術。手術標本冰凍切片提示神經母細胞瘤。為Evans分期Ⅲ期，無遠處轉移，術后病理診斷：神經母細胞瘤。

研究方法

(1)試劑：NGF購自晶美公司；MTT購自華美公司。其它均為國產分析純試劑。Trizol購自美國GBICO公司；RT-PCR試劑盒購自Promega公司；TaqDNA合成酶、瓊脂粉購自上海生工生物工程公司；DNAMarker購自寶生物工程大連公司；引物TrkA引物序列根據Genebank資料設計如下：TrkAsense:CTGGGCGGAGTGCCTGAA，antisense：GGCTC-CGGCTCCAGGAA，擴增產物為528bp，TrkA引物及β-actin(114bp)內參照引物由北京賽百盛公司合成。(2)NB細胞培養：用消化法進行原代細胞培養，培養基為DMEM，含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素/ml，在5%CO2、95%空氣環境中恒溫恒濕孵育。(3)實驗分組：用作生長及分化研究的NB細胞分成4組。A組：DMEM培養基加入NGF使終濃度為5μmol/L；B組：DMEM培養基加入NGF使終濃度為10μmol/L；C組：DMEM培養基加入NGF使終濃度為20μmol/L；D組：作為對照組，培養基中不加NGF干預。每組設4份同樣的標本。(4)活細胞計數：取指數生長期細胞，接種至24孔培養板,細胞濃度為1×105細胞/ml，于0、2、4、6、8d用臺盼藍拒染法計數活細胞。(5)細胞形態學觀察：用作分化研究的細胞，以1×103/ml密度接種至25ml培養瓶中，A、B、C、D組同時接種，于0、2、4、6、8d在相差顯微鏡下計數分化細胞。方法：對每瓶細胞選取5個不同視野的200個細胞，根據Sandquist法，有一個或一個以上的軸突長度延伸至胞體直徑二倍以上者為細胞分化，計算細胞分化百分率。(6)MTT法檢測NB細胞增殖活性原理：活細胞，特別是增殖的細胞中，其中線粒體能量代謝中產生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的四甲基偶氮唑鹽(MTT)還原成藍紫色的結晶沉積在細胞內和細胞周圍，形成的結晶與細胞數成正比，用酸化異丙醇溶解結晶即可在酶標比色計上直接比色，此數值的升高標志細胞能量代謝旺盛、增殖活躍。檢測方法：細胞培養于96孔培養板中，37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養1h使細胞貼壁，按A、B、C、D組要求加入NGF，繼續培養2h；吸去培養液，用PBS洗滌細胞一次；每孔加濃度5mg/ml的MTT染液20μl(溶于PBS中，濾過除菌，4℃避光保存)于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中繼續孵育細胞4～h；加入新鮮配制的DMSO溶解MTT150μl/孔，水平搖床上搖10min，使還原產物充分溶解，酶標儀上570nm波長下測定光密度值。(7)TrkA表達檢測：①NB細胞總RNA的提取：將培養的細胞用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計測吸光度OD260值和OD280值，計算提取物濃度及純度。經定量后用DEPC水稀釋至1mg/ml，-20℃保存。②逆轉錄合成cDNA：根據逆轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA。③PCR擴增反應體系：反應體系為25μl，PCR反應參數：94℃預變性5min，變性1min，55℃退火45s，72℃延伸2min，共35個循環。④擴增產物半定量分析：取10μl擴增產物在含溴化乙錠(μg/ml)的2%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀觀察RT-PCR擴增產物，與Marker比較鑒定結果，凝膠成像分析系統掃描擴增帶，用TrkA/β-actin比值表示TrkA的相對表達水平。

統計學處理

用SPSS軟件進行方差分析，兩均數比較采用校正t檢驗。

2結果

.1NGF對NB細胞活細胞計數的影響見表1。表1不同作用時間的活細胞計數比較注：*Ｐ.2NGF誘導NB細胞分化觀察

NB細胞呈小梭形，部分呈淚滴狀，少數呈三角形。經NGF干預后，2d后開始出現形態分化，細胞變短、變圓，逐漸有神經突起形成，類似樹突、軸突，整個細胞形態由原來的小梭形變為類多邊形，類似成熟的神經節細胞。不同作用時間、不同濃度NGF干預的細胞分化百分率見表2。表2不同作用時間、不同濃度NGF對NB細胞分化百分率的影響注：*P.3NGF對NB細胞增殖的抑制見表3。MTT檢測結果顯示NGF劑量依賴性的抑制NB細胞的增殖。表3NGF抑制NB細胞增殖注：A、B、C三組與D組相比P.4不同濃度NGF對TrkAmRNA/βactin比值的影響見表4。NGF不同濃度誘導后，隨著作用時間和濃度的增長，TrkAmRNA表達均增強，與作用時間和NGF濃度正相關。表4不同濃度NGF對TrkAmRNA/β-actin比值的影響

3討論

NB是小兒最常見的實體瘤之一，起源于原始神經嵴［3］，惡性度極高，早期易發生肝和皮膚轉移，50％以上發生骨髓轉移，預后極差，但部分患者具有自行消退和體外誘導分化成熟的特點，有研究認為細胞周期G1期“限制點”的Rb通路蛋白表達參與了神經母細胞瘤向良性的轉化［4］。探討誘導瘤細胞分化成熟的因素具有至關重要的意義。

神經生長因子是最早發現的生長因子，β亞基是NGF的活性部分，稱為β-NGF，也可稱其為神經生長因子，它是一種較強的促細胞分裂因子，作用廣泛，效應細胞多，在神經元的存活、生長、發育和分化及損傷修復與再生等方面具有重要的作用，有研究證實在神經母細胞瘤細胞中轉入NGF基因，具有誘導其分化的作用［5］。本結果顯示NGF本身對培養的瘤細胞也具有誘導分化、抑制增殖和刺激TrkA受體表達的功能。一般認為，NGF通過與受體結合而產生促進NB細胞分化的作用，主要通過高親和力受體TrkA介導，缺乏TrkA受體或其結構異常是神經母細胞瘤產生和不分化的重要原因［6］。本研究中NGF時間和劑量依賴性的促進TrkAmRNA表達，并使分化細胞的百分比顯著升高，證實其具有通過誘導TrkA高表達而引起NB細胞分化的功能。TrkA主要由一種跨膜酪氨酸激酶gp140trk組成，它是原癌基因Trk的產物。當NGF與TrkA結合后，通過RAS/MAPK信號通路的激活，影響基因的轉錄和翻譯，表現為對細胞生長的調控［7］。本研究中NGF使活細胞數減少，劑量依賴性的抑制細胞增殖。NGF與TrkA間的相互作用是影響惡性腫瘤細胞生長和擴展、播散的重要因素，TrkA與其配體NGF結合引發信號傳導的瀑布式級鏈反應。本研究證實NGF可在體外誘導NB瘤細胞向神經元方向分化，在NB患兒向成熟方向分化過程中起到重要作用。近年來的研究表明，TrkA所介導的信號傳導通路在NGF誘導包括神經母細胞瘤在內的多種神經源性體外培養細胞分化過程中起到較為決定性的作用［8］

RAS/MAPK信號通路的激活，對于NGF介導的NB細胞的分化來說，可能是最重要的。與凋亡有關的基因c-myc與神經生長因子共同調節細胞凋亡，NGF能選擇性誘導NB細胞向神經元方向分化的瘤細胞中c-myc表達下降，提示NGF可能還通過抑制c-myc表達而促進分化。從惡性腫瘤細胞向成熟分化逆轉這個角度出發，本研究結果具有重要的意義，可作為對該腫瘤進行實驗性基因治療的重要指標。

【參考文獻】

1李愛敏，孫洪亮，張錦華.Caspase-8沉默—神經母細胞瘤耐藥新機制.國外醫學·兒科學分冊，004，31：165～167.

鹿洪亭，董，楊傳民，等.ATRA誘導神經母細胞瘤細胞分化及TrkA表達的研究.中華小兒外科雜志，004，25：71～74.

RellingerREJr,MailliardRB,BarksdaleEMJr.Neuroblastomaanddendriticcellfunction.SeminPediatrSurg，004,13(1):1～71.

趙強，郝希山，閆慶娜，等.Rb通路蛋白表達與神經母細胞瘤轉化的關系.中華神經科雜志，004,7(2):170～171.

高強，董，呂振華，等.轉神經生長因子基因誘導神經母細胞瘤分化的研究.中華小兒外科雜志，005，26：34～37.

SugimotoT,KurodaH,HoriiY,etal.SignaltransductionpathwaysthroughT