5微生物反應器操作教學基本內容：講授微生物反應器的操作方式，包括分批式操作、連續式操作、流加式操作。連續式操作的定義、數學模型，連續穩態操作條件，連續操作的優缺點，在生產上和科研中的應用；流加式操作的定義、數學模型，定流量流加、指數流加的概念，流加式操作的控制優化問題。分批式操作下微生物生長曲線。5.1微生物反應器操作基礎5.2連續式操作5.3流加式操作5.4分批式操作授課重點：1.三種基本操作方式的比較。2.單級連續式操作的數學模型，連續穩態操作條件，沖出現象。3.連續操作的優缺點及在生產上和科研領域的應用。4流加式操作的數學模型，指數流加和定流量流加的概念。5.流加操作的控制與優化。6.分批式操作下微生物的生長曲線。難點：1.連續式操作的數學模型。2.多級連續培養的數學模型。3.流加式操作的數學模型。本章主要教學要求：1.理解微生物反應器操作方式的概念。注意連續式操作、流加式操作和分批式操作的區別。2.理解和掌握連續式操作的數學模型及連續穩態操作條件。3.理解指數流加和定流量流加的區別。4.了解連續式操作的優缺點和應用。5.了解流加式操作的優化和控制。5微生物反應器操作5.1微生物反應器操作基礎5.1.1微生物反應器操作方式分批式操作：是指基質一次性加入反應器內，在適宜條件下將微生物菌種接入，反應完成后將全部反應物料取出的操作方式。連續式操作：是指分批操作進行到一定階段，一方面將基質連續不斷地加入反應器內，另一方面又把反應物料連續不斷的取出，使反應條件不隨時間變化的操作方式。流加式操作：是指先將一定量基質加入反應器內，在適宜條件下將微生物菌種接入反應器中，反應開始，反應過程中將特定的限制性基質按照一定要求加入到反應器內，以控制限制性基質濃度保持一定，當反應終止時取出反應物料的操作方式。Vt圖5－1分批式操作中基質體積變化Vt圖5－2流加式操作Vt圖5－3連續式操作5.1.2不同操作方式的特點在分批式操作中，反應液中基質濃度S隨反應進行不斷降低，菌體濃度X、產物濃度P則不斷升高，因此是一個動態變化過程。當微生物反應存在底物抑制時，初期底物濃度高不利于反應。后期底物濃度過低，則反應速度很低。在流加式操作中，基質濃度控制在一定水平，避免了底物抑制問題。流加過程中反應液體積是變化的。流加式操作可達到擬穩態。在連續式操作中，反應液體積V、底物濃度S、菌體濃度X、產物濃度P保持恒定，連綿式操作是一個穩態過程。5.1.3不同操作方式的優缺點見教材73頁表5-1。5.2連續式操作連續式操作有兩大類型，即CSTR型和CPFR型，CPFR型多用于酶促反應過程，微生物反應的連續式操作多采用CSTR型。根據達成穩定狀態的方法不同，CSTR型連續操作，大致可分為以下3種：恒化器法：指連續培養過程中，基質流加速度恒定，以調節微生物細胞的生長速率與恒定流量相適應的方法。恒濁器法：指預先規定細胞濃度，通過基質流量控制，以適應細胞的既定濃度的方法。營養物恒定法：指通過流加一定成分，使培養基中的營養成分恒定的方法。5.2.1恒化器法單級連續操作5.2.1.1數學模型圖5－4所示的單級CSTR培養系統中，流入液中僅一種成分為微生物生長的限制性因子，其他成分在不發生抑制的條件下充分存在。F（S0，X0）S，X，PF（S，X，P）F（S0，X0）S，X，PF（S，X，P）圖5－4單級CSTR培養系統菌體的物料衡算式：變化量=流入量+生長量流出量即：（5－1）限制性基質的物料衡算式：變化量=流入量流出量－消耗量即（5－2）產物的物料衡算式：變化量=流入量＋生成量流出量即：（5－3）（5－1）式～（5－3）式兩邊同除以V，則（5－4）（5－5）（5－6）式中D為稀釋率，穩定狀態下，，因此D=μ（5－7）（5－8）（5－9）若微生物生長符合莫諾模型，則（5－10）（5－7）式～（5－10）式為恒化器法單級連續培養的數學模型。稀釋率D是一個重要的操作參數。根據上述方程可知當D確定時，、S、X、P即可唯一確定。D=F/V，因此，當反應液體積一定時，可通過控制流量F來控制、S、X、P，這正是恒化器法又被稱為外部控制方法的緣故。5.2.1.2連續穩態操作條件：D的取值是有限制的，即應有，式中，為臨界稀釋率。微生物反應一般是在條件下進行的，所以當D時，根據（5－4）式可知，反應器中菌體終將全部被沖出(wash-out)，稱為沖出現象。5.2.1.3菌體產率、產物產率菌體產率（5－11）產物產率（5－12）獲得最大菌體產率（或最大產物產率）時的稀釋率為（5－13）此時，最大菌體產率為（5－14）最高產物產率為（5－15）當時，，（5－16）例1：以葡萄糖為限制性底物，連續培養大腸桿菌，在此培養條件下，測得實驗數據如下，比較理論與實驗的結果。已知m=1.08h-1，KS=0.102g/L，YX/S=0.505g/g。單級恒化器連續培養大腸桿菌S0=0.968g/L稀釋率D(h-1)葡萄糖S(mg/L)菌體濃度X(mg/L)菌體產率DX(mg/L.h)0.066427260.1213434520.24334171000.31404381360.43644221810.531024272260.601224242540.661534222790.691704302970.712213902770.73210352257解：根據實驗數據計算菌體產率DX，列入上表。根據理論公式計算不同稀釋率下的葡萄糖濃度S、菌體濃度X和菌體產率DX，列入下表。，，單級恒化器連續培養大腸桿菌S0=0.968g/L稀釋率D(h-1)葡萄糖S(mg/L)菌體濃度X(mg/L)菌體產率DX(mg/L.h)0.066486290.1213482580.24294741140.31414681450.43674551960.53984392330.601274252550.661604082690.691803982750.711963902770.73213381278分別以實驗數據和理論數據繪制S~D、X~D及DX~D曲線。實驗曲線用實線表示，理論曲線用虛線表示。XXDXDXSS觀察理論曲線與實驗曲線的擬合情況，可以發現，兩組曲線基本吻合，在稀釋率較小時X~D理論曲線與實驗曲線存在較大偏差。例2葡萄糖為限制性基質進行呼吸缺陷型酵母突變株的單級連續培養（恒化器法）。請給出存在乙醇抑制和無抑制兩種情況下稀釋率D與菌體濃度X、基質濃度S與產物濃度P的關系。已知原料中不含產物乙醇（Pin＝0），基質濃度Sin=10g/L。存在乙醇抑制的生長動力學模型可采用解：存在乙醇抑制時，連續培養穩態下，無乙醇抑制時，連續培養穩態下，例3判斷題1)單罐連續培養穩態下，稀釋率與生長比速的關系：D>()D=()D<()D==0()3)單罐連續培養穩態下，在洗出稀釋率下，可達到最大的菌體產率。()4)單罐連續培養穩態下，在Dmax的細胞濃度不是最大細胞濃度。()5)單罐連續培養穩態下，細胞濃度越高，菌體產率越大。()6)單罐連續培養穩態下，在洗出稀釋率下罐內底物濃度等于零。()7)單罐連續培養穩態下，細胞濃度越高，罐內底物濃度越低。()例4（教材例4－7）求青霉素連續發酵的穩定狀態下最大菌體生成速度(DX)max及此時的稀釋率Dmax，菌體濃度X和基質濃度Sout。已知Sin=30g/L，YX/S＝0.45，菌體生長可用Monod方程表達，max=0.18h-1，KS＝1.0g/L。解：菌體生長符合Monod模型，連續培養穩態下達到最大菌體生成速度的稀釋率5.2.2具有反饋的單級連續培養有時為了增加反應器內的菌體濃度，或者在某種條件下提高發酵產物的產率，對單級連續培養可以采取將反應器排出液中的部分菌體重新返回反應器中。5.2.2.1數學模型（1+（1+）F（X，S）F（S0）S，XF{[1+（1-）]X，S}F(X，S)圖5－5具有反饋的單級連續培養圖5－5表示具有反饋的單級連續培養系統，圖中g為微生物的濃縮系數（g1），r為再循環反應液的比例（返回的反應液與供給的新鮮反應液的體積比）。菌體衡算式：（5－17）基質衡算式：（5－18）培養達到穩定狀態時， 即：=D(1+r-gr)=DR（5－19）（5－20）式中，R為循環濃縮因子，R＝1＋r－rg，若微生物生長模型可采用Monod方程，則（5－21）（5－19）式、（5－20）式、（5－21）式為具有反饋的單級連續培養數學模型。5.2.2.2穩態操作條件：(在通常情況下，Sin<<KS)（5-22）穩態操作條件：DDcrit可見，具有反饋的單級恒化器與無反饋的單級恒化器相比，穩定狀態下的菌體濃度X增大，臨界稀釋率增大。5.2.2.3菌體產率對具有反饋的單級連續培養，還應考慮排出反應液中的菌體濃度X。菌體分離裝置處的菌體衡算式為（5-23）所以，從分離裝置處流出的菌體濃度（5-24）菌體產率（5-25）例5（教材例4－9）以葡萄糖為基質在如下條件進行具有反饋的連續操作。V＝1m3；F＝0.1m3/h；YX/S＝0.158g/g(以細胞/葡萄糖計)；Sin=10kg/m3；r=0.8；g=1.5。已知微生物反應可以用Monod方程來表示，其中max=0.41h-1，KS＝0.22kg/m3，求比生長速率，反應器內基質濃度Sout和菌體濃度X和分離裝置出口處的菌體濃度X。解：微生物反應可以用Monod方程來表示，具有反饋的連續培養穩態下，5.2.3多級連續培養5.2.3.1數學模型：以微生物生長符合莫諾模型為例。F，SF，S2，X2，P2F，SF，S3，X3，P3F，SoF，S1，X1，P1圖5－6多級連續培養操作達到穩態時，第一級罐（5-26）（5-27） （5-28）（5-29）第n級罐物料衡算式（5-30）（5-31）（5-32）（5-33）化簡，得 （5-34）（5-35）（5-36）（5-37）例6某微生物的生長可用Monod方程來描述，并且max=0.5/h，KS=2g/L。(1)連續培養中，流加基質濃度So=48g/L，YX/S=0.45g/g，在穩定狀態下，菌體的最大生產強度為多少？(2)采用相同容積的發酵罐，且D=0.2/h連續穩定狀態下培養，若要保證反應系統的基質流出濃度S小于0.5g/L，問需要幾個發酵罐串聯？基質轉化率為多少？解：(1)微生物的生長可用Monod方程來描述，連續培養穩態下，取得最大生產強度的稀釋率(2)連續培養穩態下，第一級罐中第二級罐中：（1）（2）（3）聯立方程求解,得，S2=0.3g/L基質轉化率:5.2.4連續培養中的雜菌污染和菌種變異目前，除大規模工業化生產單細胞蛋白、工業化處理廢水采用連續培養技術之外，其他發酵產品的工業生產極少采用連續培養技術。主要原因有三：(1)雜菌污染問題。因連續培養以長期、穩定連續運轉為前提，在整個培養過程中，必需不斷地供給無菌的新鮮培養基，好氧發酵時，必需同時供給大量的無菌空氣，這兩種供給的過程中極易帶來雜菌的污染，長期保持連續培養的無菌狀態非常困難。(2)菌種變異問題。因工業化生產所用菌株大都是通過人工誘變處理的高度變異株，在長期的連續培養過程中容易使回復突變菌株逐漸積累，最后取得生長優勢。(3)成本問題。為降低成本,其一要使原料以最大的轉化率和最大的產率轉化為產物；是使發酵終了液中含有盡可能高的產物濃度，以縮小產物分離提取系統的規模和操作的費用。一些發酵過程其產物的分離提取費用約占生產總成本的40%以上；而對于大多數抗生素和精細化學品的發酵生產，其本身就是一個高成本分離過程的生產過程。而在連續培養過程中，流出的發酵液中產物濃度一般比分批培養、流加培養的低，結果加重了分離提取的負荷，在生產成本上沒有競爭力。目前連續培養的應用主要集中在研究領域。XWS設連續培養微生物X的過程中被Y或Z或W微生物所污染。其中雜菌Y在給定的限制性底物S中的比生長速率；雜菌Z在S中的比生長速率；而雜菌W在S中的比生長速率則與S有關。三種菌在連續培養中與微生物X的生長關系如圖所示。XWSXZSXZSXYS根據連續培養理論，對于雜菌Y，在一定S下，，，因此雜菌Y被沖出，不能殘存在系統中。對于雜菌Z，在一定的S下，，,因此雜菌Z將殘存在系統中。其殘存方式是：由于，微生物Z增殖，Z的增殖將導致限制性底物濃度S的下降，下降至時，有，建立了一個在下新的穩定狀態。在下，，微生物X將從培養系統中洗出。對于雜菌W，W的殘存與否取決于操作的稀釋率，在D=0.25Dcrit時,X將洗出，在D=0.75Dcrit時,W將被洗出。由此可見，在系統中保留的是在此環境中比生長速率最大的微生物。5.2.5連續培養在研究領域的應用(1)發酵動力學參數的測定。莫諾模型中max、KS的測定：繪制曲線或曲線，即可由直線斜率和截距計算出max、KS。為了達到測定的準確性，就要求S-數據準確、可靠、重現性好。采用分批培養，由于過程的不穩定性，數據重現性不好，另外還要求底物、菌體濃度測定方法極為靈敏、準確；而連續培養由于過程的穩定性，數據準確、可靠、重現性好。測定一般采用恒化器實驗，即控制不同的稀釋率D，使系統達到穩定狀態后，測定相應的底物濃度S，而=D，這樣，就得到了-S數據。產物動力學模型中系數的測定：，可變形為同樣采用恒化器實驗，即控制不同的稀釋率D，使系統達到穩定狀態后，測定相應的產物濃度P、菌體濃度X，根據連續培養產物恒算式計算Qp，而=D，這樣，就得到了-Qp數據。繪制Qp~曲線，根據直線斜率、截距即可計算出、。(2)確定最佳培養條件這是過程優化的一個內容。對于一個發酵過程，優化的內容包括：什么樣的條件下能獲得最大菌體產率、產物產率？什么樣的條件下能獲得最大的菌體得率、產物得率？控制哪種限制性底物，在何種濃度水平才能最大限度地避免其他副產物的形成？下面將舉例說明。微生物培養的目的有兩個：一是菌體，二是產物。先以面包酵母生產為例。以葡萄糖為限制性底物，在不同稀釋率D下進行連續培養，測定穩態下的菌體濃度X、糖濃度S、乙醇濃度P并計算出得率YX/S、乙醇生成比速，可得如圖5－7所示培養結果。0.40.30.20.10.40.40.30.20.10.40.30.20.1(a)(b)(b)DDDD0.10.20.30.40.50.10.20.30.40.50.10.20.30.40.50.10.20.30.40.5SS(c)(c)0.20.20.10.10.20.30.40.50.10.20.30.40.5SS圖5－7面包酵母連續培養實驗結果由圖(a)可知：在D=0.1-0.25之間培養能夠取得最高轉化率YX/S=0.5g/g；在此種稀釋率D下，所對應的葡萄糖濃度S0.12g/L，如圖(b)所示；在這一底物濃度下，乙醇的比產生速率QP=0，如圖(C)所示。根據這些參數間的關系，可知在培養面包酵母時，應控制發酵液中面包酵母的比生長速率在0.1-0.25之間,選擇合適的初糖濃度S0，使培養操作時的底物濃度S0.12g/L；在此條件下培養，基本無乙酵生成，轉化率可達到最高為50%。生產中呼吸商RQ是易于測定和控制的參數，RQ=QCO2/QO2。測定培養過程菌體濃度X、氧攝取速率QO2、二氧化碳排出速率QCO2，計算呼吸商RQ，可得圖5－8所示的結果。XQCO2XQCO2YX/SXX，YX/S，RQ12X，YX/S，RQ1284QCO2，QO2D圖5－8連續培養面包酵母時各參數間的關系從圖中可以看出：呼吸商RQ為1時取得最大轉化率YX/S，呼吸商RQ大于1時，轉化率下降。綜合上述結果，可得培養面包酵母的最佳培養條件：S=0.12g/L；=0.25h-1；RQ=1，此時，轉化率、產率均可達到最大值。依此培養條件，采用連續培養或流加培養就能夠獲得最好的培養結果。事實上，現代工業化規模生產面包酵母的流加培養和操作控制技術就是建立在上述研究基礎上的。我們再舉一個以得到發酵產物為目的例子。在這類發酵中，過程優化的問題就是研究如何提高產物產率。其中研究限制性底物對產物比生成速率的影響十分重要。在各種限制性底物對鏈球菌產生乳酸的研究中得到如下結果。限制性底物稀釋率D(h-1)細胞產酸力YP/X（g/g）比產物生成速率(h-1)乳酸P(g/L)葡萄糖0.0175.40.0924.0葡萄糖0.0346.10.214.0葡萄糖0.0516.00.313.8氮源0.03426.30.8910.0磷酸鹽0.03480.02.74.8表中細胞產酸力YP/X反映了生長與產物的偶聯情況。當以葡萄糖為限制性底物時，生長與產酸相偶聯；而當以氮源或磷酸鹽為限制性底物時，由于氮源和磷酸鹽都是構成菌體成分的物質，氮源或磷酸鹽的限制，使葡萄糖的代謝與生長速率無關，即生長與葡萄糖代謝非偶聯，促使葡萄糖的分解代謝產物乳酸大量產生、積累，菌種的比產物生成速率提高了一個數量級。(3)富集、選育特殊性狀的菌種一般的菌種選育方法有物理誘變法、化學誘變法，利用連續培養技術選育菌種，是一種十分簡便的方法。這種方法包括兩個要點：一是要針對具體選定的微生物群，根據所要求的功能建立高度選擇的培養環境，使得無此功能的微生物在此環境中不能生長或極少生長，例如，選育能夠利用碳氫化合物的微生物，則需以碳氫化合物為唯一碳源；又如選育的是酵母而非細菌，則可在高酸性條件下培養，pH3-4；如果所選育的是嗜熱微生物，則在高溫條件下培養。第二個要點是選擇合適的稀釋率。5.3流加式操作F，SF，S0XS圖5－9流加式操作在流加式操作中，反應液體積是變化的，。5.3.1流加操作的數學模型流加操作中菌體、基質、產物的物料衡算式：（5-38）（5-39）（5-40）當培養達到擬穩態時，基質濃度S、菌體濃度X恒定。即：（5-41）即：（5-42）（5-43）化簡后，得到（5-44）（5-45）（5-40）式化簡可得，（邊界條件：）(5-46)對（5－46）式積分，得(5-47)若，

則(5-48)流加操作中有關參數的變化如圖5－10所示。X，S，PtX，S，PtXSPVVtt圖5-10流加操作中有關參數的變化5.3.2流加的方式指數流加：指稀釋率D恒定，對積分，得。即基質流量按指數規律變化，這種方式可達到擬穩態，微生物呈指數生長。定流量流加：流量F恒定，定流量流加的最大特點是微生物進行線性生長，即（一定）5.3.3流加操作的控制流加操作的控制包括無反饋控制和反饋控制。無反饋控制的流加操作是指按預先設置好的模式進行底物的流加。因此，系統的數學模型是否正確成為控制成敗的關鍵。另外，由于微生物反應的復雜性，使實際情況總會與理論模型存在偏差，而無反饋控制不能及時修正偏差。反饋控制則可彌補這一缺陷。反饋控制又可分為直接反饋控制和間接反饋控制。直接反饋控制監測的是發酵液中底物濃度S、菌體濃度X、產物濃度P等直接指標。如果些指標不能在線測定，可以監測溶氧、pH等可在線測定的間接指標，這就是間接反饋控制。無論直接反饋控制，還是間接反饋控制，都可以根據監控指標的變化情況對過程中產生的偏差進行修正。5.3.4流加操作過程的優化。發酵動力學的應用并不限于對發酵過程的模擬，更重要的是實施過程的優化，以達到高產、低耗的目的。由于微生物生長是代謝產物合成的基礎，并對產物合成起著調控作用，故發酵過程的優化主要是微生物生長的優化。考慮到實用的目的，這里主要介紹補料分批發酵過程的優化。流加培養優化是指控制適當的稀釋率或菌體生長比速，是生產強度和得率盡可能最大。大量的菌體時產生產物的前提，因此在菌體生長階段，應控制較高的生長比速，使菌體量快速增長。進入產物生成階段后，應控制較低的菌體生長比速，以減少基質的消耗，并保證“壯齡”細胞在細胞群體中占絕大多數。進行流加培養優化時，還應考慮以下邊界條件：(1)最大比生長速率。流加操作擬定態要求。(2)臨界比生長速率。每個菌株維持具有較高產物合成酶活性的“壯年”細胞占優勢都必須滿足一個最低比生長速率，低于它，老齡細胞將逐漸占優勢，致使產物合成能力下降，這就是臨界比生長速率。根據這一要求，應有。(3)發酵罐最大允許細胞濃度。由于發酵罐氧傳遞能力的限制，使細胞濃度也有一臨界值，超過它，氧的供應將失去平衡，使細胞處于缺氧狀態，產物合成能力將急劇下降。(4)細胞對底物的耐受力。一般來說，底物濃度越大，細胞生長比速越大，但是由于細胞對底物有一定的耐受力，因此底物濃度并非越大越好。例7流加基質為葡萄糖，培養大腸桿菌。流加培養開始時的，，反應