ICS11.020CCSC05HumanamnioticmesenchymalstemcellderiIT/LNSI010-2024 2規范性引用文件 3術語和定義 4符號和縮略語 5技術要求 6檢驗方法 7檢驗規則 8使用說明 9標簽 10包裝、儲存及運輸 11廢棄物處理 附錄A（規范性）外泌體形態檢測透射電鏡觀察法 9附錄B（規范性）外泌體數量檢測納米流式檢測法 10附錄C（規范性）外泌體粒徑檢測納米流式檢測法 12附錄D（規范性）外泌體蛋白檢測蛋白印跡法 14附錄E（規范性）抑制淋巴細胞增殖檢測CFSE標記法 附錄F（規范性）抑制Th1功能檢測胞內因子染色法 17T/LNSI010-2024本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化的文件結構和起草規則》的規定起本文件由沈陽艾米奧生物工程技術研發中心有限公司、沈陽市再生生物醫學重點實驗室提出。本文件由遼寧省免疫學會歸口。本文件起草單位：沈陽艾米奧生物工程技術研發中心有限公司、中國醫科大學干細胞與再生醫學研究室、沈陽市再生生物醫學重點實驗室、沈陽市干細胞與再生醫學重點實驗室、遼寧艾米奧干細胞與再生醫學研究院、遼寧省細胞生物學學會、遼寧省生物技術協會、沈陽市干細胞與再生醫學產業技術創新聯盟、沈陽藥科大學、中國醫科大學附屬第一醫院、中國醫科大學附屬口腔醫院、中國醫科大學附屬盛京醫院、艾米奧國際干細胞醫院。本文件主要起草人：龐希寧、龐然、施萍、單風平、王莉莎、赫甡、宋揚、徐東芬、荊晶、姜雯宇、高航、謝光麟、邵錫柱、王竟、孟濤、蘇航、張美玲、聶宏光、郎宏鑫、劉曉玉、王喜良、張濤、趙峰、張殿寶、王瑞、李彩虹、李宏圖、潘長偉、孔娟、王哲、王蔚、殷軍、郭然、張寧、李曉航、王嬌。本標準的制訂基于相關技術的綜合考慮，旨在推動行業的發展和規范化。在編寫過程中，團體成員充分研究了現有技術和專利信息，并積極尋求相關權益方的支持和參與。特此聲明，在編寫本標準期間，我們已經采取了合理的努力來促進并保護涉及的知識產權。鑒于技術的不斷創新和發展，如果其他相關專利或權益未在本標準中明確聲明，請權益人及時聯系標準制定團體，以便進行進一步的溝通和許可。本標準中使用的專利聲明如下：[CN201010252201]：[中國醫科大學]，[CN]，[一種人羊膜間充質干細胞無血清培養基及其培養方法]。以上聲明是為了更好地保護知識產權，遵循了國家相關法律法規和知識產權的規定。我們鼓勵所有使用本標準的相關方與專利權人合作，以確保公平的利益分配和技術發展。1T/LNSI010-2024人羊膜間充質干細胞外泌體本文件規定了人羊膜間充質干細胞來源外泌體的技術要求、檢驗方法、檢驗規則、使用說明、標簽、包裝、儲存、運輸和廢棄物處理要求。本文件適用于人羊膜間充質干細胞來源外泌體的生產和檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。WS213丙型肝炎診斷WS273梅毒診斷WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》T/LNSI001-2023《人羊膜間充質干細胞》T/CSCB0007-2022《人干細胞來源細胞外囊泡制備通用要求》T/CSCB0001-2022《人干細胞研究倫理審查技術規范》GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法中華人民共和國藥典（2020年版）全國臨床檢驗操作規程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1干細胞stemcells2T/LNSI010-2024干細胞是來自于胚胎、胎兒或成人體內具有在一定條件下無限制自我更新與增殖分化能力的一類細胞，能夠產生表現型與基因型和自己完全相同的子細胞，也能產生組成機體組織、器官的已特化的細胞，同時還能分化為祖細胞。3.2間充質干細胞mesenchymalstemcells間充質干細胞是一種多能干細胞，它具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。3.3人羊膜間充質干細胞humanamnioticmesenchymalstemcells人羊膜間充質干細胞屬中胚層來源，是一種存在于人羊膜間充質的多能干細胞，它具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。3.4外泌體exosome外泌體是細胞分泌的膜外雙層脂質小囊泡，直徑30~200nm，包含了蛋白質、脂質、多糖及RNA等物質，可以轉運核酸、脂質和蛋白質，參與細胞間的信息交流。3.5人羊膜間充質干細胞外泌體humanamnioticmesenchymalstemcellderivedexosome人羊膜間充質干細胞外泌體是人羊膜間充質干細胞分泌的膜外雙層脂質小囊泡，粒徑應小于200納米，呈雙層膜結構的茶托狀結構。4符號和縮略語下列符號和縮略語適用于本文件。EBV——皰疹病毒（Epstein-BarVirus）HBV——乙型病毒性肝炎（HepatitisBVirus）HCMV——人巨細胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV——丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV——人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HTLV——人類嗜T細胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）TP——梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）3T/LNSI010-20245技術要求5.1原材料5.1.1應符合T/CSCB0001-2022要求。5.1.2應建立供者細胞采集的供者評估與篩選標準、采集方法、運輸標準和交接標準，保證供者和細胞的安全。5.1.3供體應篩查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，并記錄結果。5.2制備與純化方法5.2.1人羊膜間充質干細胞人羊膜間充質干細胞關鍵質量屬性應符合T/LNSI001-2023的規定。5.2.2人羊膜間充質干細胞培養上清為了獲得高質量的外泌體，收獲外泌體最佳時間限定為P2-P3代人羊膜間充質干細胞，要求融合率達95%以上的細胞上清。5.2.3外泌體的制備與純化應符合T/CSCB0007-2022的要求。5.3關鍵質量屬性5.3.1形態透射電顯微鏡觀察，外泌體形態為雙層膜結構的茶托狀結構。5.3.2粒徑外泌體粒徑應小于200nm，且在60-120nm范圍內形成粒徑峰值。5.3.3濃度用于皮膚及骨關節抗衰用人羊膜間充質干細胞外泌體濃度應不低于3×1010顆粒/ml。5.3.4標志蛋白外泌體表面標志物CD63、CD81和CD9中的任意兩個表達陽性。4T/LNSI010-20245.3.5微生物真菌、細菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP為陰性。5.3.6過程控制人羊膜間充質干細胞制備過程控制應符合T/LNSI001-2023要求。外泌體分離過程控制應符合T/CSCB0007-2022的要求。6檢驗方法6.1人羊膜間充質干細胞按照“T/LNSI001-2023”文件規定的關鍵質量屬性標準進行檢驗。6.2形態按照附錄A的方法檢驗。6.3粒徑按照附錄B的方法檢驗。6.4數量按照附錄C的方法檢驗。6.5表面標志蛋白按照附錄D的方法檢驗。6.6免疫調節6.6.1抑制淋巴細胞增殖按照附錄E的方法檢驗。6.6.2抑制Th1細胞功能按照附錄F的方法檢驗。6.7微生物5T/LNSI010-20246.7.1真菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢驗。6.7.2細菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢驗。6.7.3支原體按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3301無菌檢查法”項檢驗。6.7.4HBV按照《全國臨床檢驗操作規程》核酸法檢驗。6.5.5HCV按照WS213核酸法檢驗。6.7.6HIV按照WS293-2019核酸法檢驗。6.7.7HTLV按照《全國臨床檢驗操作規程》核酸法檢驗。6.7.8EBV按照《全國臨床檢驗操作規程》核酸法檢驗。6.7.9HCMV按照《全國臨床檢驗操作規程》核酸法檢驗。6.7.10TP按照WS273核酸法檢驗。6.7.11外源病毒因子按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3302外源病毒因子檢查法”項檢驗。6T/LNSI010-20247檢驗規則7.1抽樣方法和數量7.1.1在一個生產周期中，同一生產線、同一來源、同一代次、同一方法制備出來的產品為一批。7.1.2在同一批的產品中隨機抽取3個最小包裝單元。7.2出廠檢驗7.2.1每批產品應進行出廠檢驗，并附檢驗報告。7.2.2出廠檢驗項目應包括5.3規定的所有項目。7.3復核檢驗若客戶需要，應由第三方專業細胞檢驗機構或實驗室進行復核檢驗，檢驗項目應包括第5章規定的所有項目。7.4判定規則7.4.1出廠檢驗項目全部符合5.3規定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規定，則判為不合格品。7.4.2復核檢驗項目全部符合5.3規定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規定，則判為不合格品。8使用說明應至少包括以下內容：a）外泌體來源細胞名稱；b）外泌體來源細胞代次；e）生產批號；f）生產組織；7T/LNSI010-2024i）使用方法；j）執行標準號；k）生產地址；l）聯系方式；m）郵政編碼；n）注意事項。注：根據用戶需求，可標注內毒素含量。9標簽應至少包括以下內容：a）外泌體來源細胞名稱；b）外泌體來源細胞代次；c）外泌體的濃度；d）生產日期；e）生產批號；f）生產組織；g）儲存條件。10包裝、儲存及運輸10.1包裝應選擇對人羊膜間充質干細胞來源的外泌體關鍵質量屬性無影響的袋或瓶中，應選擇低吸附性的袋或瓶。10.2儲存應在低于-80℃環境下儲存。10.3運輸凍存的外泌體應在干冰或低于-80℃條件下運輸，非凍存的外泌體應在2℃~8℃條件下運輸。8T/LNSI010-202411廢棄物處理人羊膜間充質干細胞來源的外泌體生產和檢測過程中生產的廢棄物應按照T/CSCB0001-2022中的規定處理。9T/LNSI010-2024（規范性）外泌體形態檢測透射電鏡觀察法A.1儀器和設備A.1.1透射電子顯微鏡。A.1.2載樣銅網。A.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規定的一級水。A.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。A.2.2戊二醛溶液。A.2.3醋酸雙氧鈾溶液。A.3檢測步驟A.3.1將外泌體樣品滴加于載樣銅網上，靜置20min。A.3.2滴加適量磷酸緩沖液于樣本上，清洗3次。A.3.3滴加適量戊二醛溶液于樣本上，固定5min，隨后用超純水清洗8次。A.3.4用醋酸雙氧鈾溶液染色5min。A.3.5銅網在常溫下干燥10min。A.3.6將銅網置于透射電子顯微鏡樣本室內，觀察外泌體形態。A.4結果分析透射電鏡顯微鏡下可觀察到100nm左右外泌體膜的茶托樣結構。T/LNSI010-2024（規范性）外泌體數量檢測納米流式檢測法B.1儀器和設備B.1.1納米流式儀。B.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規定的一級水。B.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。B.2.2納米流式濃度標準品（1.99×1010個顆粒/mL）。B.3檢測步驟B.3.1按照使用說明，對納米流式儀進行液流初始化和管路氣泡排出。B.3.2用超純水將濃度標準品稀釋10倍，按照使用說明進行納米流式儀的質控，將納米流式儀調試到最佳檢測狀態后（散射和熒光通道的信號均達到最強且均一在濃度標準品的測量參數下對稀釋后的標準品采集數據。B.3.3按照使用說明，依次用洗液和超純水清洗進樣毛細管。B.3.4在LabelledExo樣品測量參數下檢測磷酸鹽緩沖液的顆粒數，確定磷酸緩沖液的潔凈度，顆粒數計數小于200的磷酸鹽緩沖液才能作為空白對照的數據采集并用于后續的樣品稀釋。如果顆粒數計數高于200，需用0.22um的過濾膜過濾。B.3.5用潔凈的磷酸鹽緩沖液將外泌體樣品預稀釋100倍，在EXO樣品測量參數對外泌體樣本進行數據采集。納米流式儀顆粒計數在4000-8000之間為準確測量范圍，若樣品顆粒數計數過高或過低，則需調整樣品的稀釋倍數，在進行測定，記下樣品的最終稀釋倍數。另外需注意樣品上機檢測時散射通道的基線和自動閾值與空白對照（磷酸緩沖液）檢測的基線和自動閾值是否一致，若樣品檢測時出現基線抬升，則需重新制備更高純度的樣品。B.4結果分析T/LNSI010-2024得到的檢測結果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算外泌體數量。抑制率按式（B.1）進行計算：X=(B-C)/A×1.99×108×D×E（B.1）式中：Y—外泌體樣本的數量；A—測得的標準品顆粒數；B—測得的（稀釋后）樣本顆粒數；C—空白對照的顆粒。D—樣本的稀釋倍數；E—樣本的體積（mL）。T/LNSI010-2024（規范性）外泌體粒徑檢測納米流式檢測法C.1儀器和設備C.1.1納米流式儀。C.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規定的一級水。C.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。C.2.2納米流式濃度標準品（1.99×1010個顆粒/mL）。C.2.3S16M-EXO粒徑標準品。C.3檢測步驟C.3.1按照使用說明，對納米流式儀進行液流初始化和管路氣泡排出。C.3.2用超純水將濃度標準品稀釋10倍，按照使用說明進行納米流式儀的質控，將納米流式儀調試到最佳檢測狀態后（散射和熒光通道的信號均達到最強且均一在濃度標準品的測量參數下對稀釋后的標準品采集數據。C.3.3按照使用說明，依次用洗液和超純水清洗進樣毛細管。C.3.4在LabelledExo樣品測量參數下檢測磷酸鹽緩沖液的顆粒數，確定磷酸緩沖液的潔凈度，顆粒數計數小于200的磷酸鹽緩沖液才能作為空白對照的數據采集并用于后續的樣品稀釋。如果顆粒數計數高于200，需用0.22um的過濾膜過濾。C.3.5用潔凈的磷酸鹽緩沖液將外泌體樣品預稀釋100倍，在EXO樣品測量參數對外泌體樣本進行數據采集。納米流式儀顆粒計數在4000-8000之間為準確測量范圍，若樣品顆粒數計數過高或過低，則需調整樣品的稀釋倍數，在進行測定，記下樣品的最終稀釋倍數。另外需注意樣品上機檢測時散射通道的基線和自動閾值與空白對照（磷酸緩沖液）檢測的基線和自動閾值是否一致，若樣品檢測時出現基線抬升，則需重新制備更高純度的樣品。T/LNSI010-2024C.4結果分析得到的檢測結果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明，最終得到待測樣品粒徑檢測報告。T/LNSI010-2024（規范性）外泌體蛋白檢測蛋白印跡法D.1儀器和設備D.1.1電泳儀。D.1.2轉膜儀。D.1.3搖床。D.1.4化學熒光成像儀。D.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規定的一級水。D.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。D.2.2商品化分離膠、濃縮膠溶液。D.2.3TBST平衡鹽緩沖液。D.2.4電泳緩沖液。D.2.5轉膜緩沖液。D.2.6封閉液。D.2.7抗體（一抗、二抗）。D.3檢測步驟D.3.1SDS電泳、轉膜和封閉。D.3.1.1取20um外泌體（濃度不低于1×1010個顆粒/mL）使用電泳儀和垂直電泳槽進行電泳。按照儀器說明書進行。D.3.1.2使用轉膜儀進行轉膜。按照儀器說明書進行。D.3.1.3轉膜后，使用封閉液室溫封閉1h。D.3.2抗體孵育T/LNSI010-2024D.3.1.1孵育一抗，搖床4℃過夜。孵育結束后，用TBST平衡鹽緩沖洗滌3次。D.3.1.2孵育二抗，搖床室溫封閉1h。孵育結束后，用TBST平衡鹽緩沖洗滌3次。D.3.3顯影使用化學熒光成像系統進行顯影。按照儀器說明書進行。T/LNSI010-2024（規范性）抑制淋巴細胞增殖檢測CFSE標記法E.1儀器和設備E.1.1血球計數板。E.1.2倒置顯微鏡。E.1.3水平離心機。E.1.4流式細胞儀。E.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規定的一級水。E.2.1磷酸緩沖液：pH為7.4。E.2.4植物凝集素（PHA）。E.2.5淋巴細胞分離液。E.2.7羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）染料。E.3檢測步驟E.3.1利用淋巴細胞分離液，分離外周血單核細胞（PBMC）。E.3.2使用血球計數板及顯微鏡計算細胞懸液活細胞濃度。然后進行CFSE標記，根據CFSE產品說明書進行。E.3.3使用血球計數板及顯微鏡計算CFSE標記細胞濃度，將PBMC以5×105細胞/mL接種于12孔培養板中，反應體系1m