4香型粳稻分子育種技術規程本文件規定了香型粳稻分子育種前的準備和育種程序等。本文件適用于粳稻品種中香味品質的改良及攜帶香味基因Badh2的香稻品種的分子標記輔助育種。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T15682大米食用品質感官評價方法GB/T19495.1轉基因產品檢測通用要求和定義GB/T19495.3轉基因產品檢測核酸提取純化方法NY/T83米質測定方法NY/T593食用稻品種品質NY/T596香稻米DB21/T3079優良食味水稻品種（品系）選育技術規程3術語、定義和縮略語3.1術語和定義GB/T19495.1界定的以及下列術語和定義適用于本文件。3.1.1分子育種molecularbreeding指通過分子技術對育種的目標基因和目標性狀進行轉移和選擇，進而培育出優良的新品種。3.1.2純合個體Homozygousindividual指同源染色體在同一基因座上的兩個等位基因相同的基因型個體，自交后代不會分離。3.1.3雜合個體heterozygousindividual指同源染色體在同一基因座上的兩個等位基因不同的基因型個體，自交后代產生分離。3.1.4輪回親本recurrentparent指回交育種中用于多次回交的親本。3.1.5供體親本donorparent5指回交育種中提供目標性狀的親本。3.2縮略語Badh2：香味基因（betainealdehydedehydrogenaseaDNA：脫氧核糖核酸(deoxyribonuclcicacid)；PCR:聚合酶鏈式反應(Polymerasechainreaction)；bp：堿基對(basepair)；4準備4.1設備、試劑和材料樣品DNA提取所需設備、試劑和材料的準備按GB/T19495.3的規定執行。PCR檢測所需設備、試劑和材料的準備見本文件的附錄A。4.2引物同時使用4條PCR引物，兩條3’末端位于突變位點上的分屬不同基因型的方向相反的內引物（引物2和引物3），兩條位于突變位點外側并與突變位點距離不等的外引物（引物1和引物4）。內引物用來檢測等位基因型，外引物在PCR反應中不但作為陽性參照而且和內引物分別配對有選擇性地擴增，通過擴增片段大小和有無即可判斷個體的基因型。引物信息見附錄B。5育種程序5.1技術路線技術路線圖見附錄C。5.2親本選擇5.2.1輪回親本選擇當地豐產性好、抗病性強、抗倒伏、米質優、綜合性狀較好的品種作為輪回親本（P1)。5.2.2供體親本選擇含有香味基因Badh2的香型優質水稻品種作為供體親本(P2)。5.3雜交以P1為母本，以P2為父本，去雄授粉按照DB21/T3079規定執行，成熟后雜交粒全部收獲，脫粒、記錄、保存，獲F1代種子。5.4回交6以P1為母本，以F1為父本，人工授粉回交，獲BC1F1代種子。5.5BC1F1香味基因Badh2雜合個體篩選BC1F1一般種植10株以上，單株栽插。5.5.1采樣待植株長至三葉一心時，按單株采取葉片進行樣品制備，樣品編號要與田間單株一一對應。5.5.2DNA提取與純化按照按GB/T19495.3的規定執行。5.5.3PCR擴增具體檢測方法見附錄D。5.5.4分型與結果判讀電泳圖中擴增產物片段大小為499bp和171bp，判定該品種為香型純合體；擴增產物片段大小為499bp和364bp，則判定該品種為非香型純合體；擴增產物片段大小為499bp、364bp和171bp，則判定該品種為香型雜合體。5.5.5篩選根據電泳圖中顯示擴增結果，篩選香味基因Badh2的雜合個體。5.6BC1F1回交以P1為母本，以5.5收獲的香型雜合個體為父本，回交，獲BC2F1代種子。5.7BC2F1自交BC2F1一般種植10株以上，單株栽插，自交，混收，獲BC2F2代種子。5.8BC2F2群體中香味基因純合個體篩選BC2F2一般種植1000株左右，單株栽插，按照5.5中方法采樣、提取DNA、PCR擴增、判讀結果，利用分子標記輔助選擇技術篩選香味基因Badh2的純合個體，分單株收獲種子形成株系。5.9常規系選分株系種植BC2F3代，自交獲得BC2F4代，篩選株高、穗型整齊，抽穗期一致，抗性好的株系。5.10米質鑒定、抗病鑒定按NY/T83米質測定方法測定米質性狀，利用谷粒分析儀和食味分析儀測定樣品的食味值，按GB/T15682大米食用品質感官評價方法，結合人工品嘗，確定食味品質，按照NY/T596香稻米檢驗方法，選擇香味綜合評分≥60，食味值≥75，粳稻品質等級達到NY/T593規定的三等以上的優良品系，在稻瘟病自然發病嚴重區進行田間稻瘟病綜合抗性鑒定，篩選出優質抗病香型粳稻品系。7PCR檢測所需要的設備、試劑的準備A.1設備準備A.1.1PCR儀。A.1.2凝膠成像系統。A.1.3瓊脂糖電泳槽及電泳儀等電泳裝置。A.1.4移液槍和吸頭（200μL和10μL）。A.2試劑和材料準備A.2.12×TaqPCRMasterMix（包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mgcl2、反應緩沖液、PCR反應的增強劑和優化劑以及穩定劑，濃度為2×。DNA擴增時，只需加入模板，引物和水，使MasterMix溶液的A.2.2DL2000（標準分子量的核酸標記，可以清楚地區分100bp～1000bp的DNA片段）。A.2.31×TAE緩沖液（1X的電泳緩沖液）。A.2.4Goldenview（核酸染料）。擴增香味基因Badh2的引物表B.1給出了用于本文件規定的擴增香味基因Badh2的引物。表B.1擴增香味基因Badh2的引物序列(5’-3’)TGTCATCACACCCTGGTGTAGACACCATAGGAGCAGCTGAAATATCTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTCAGTTAAGTGCTTTACAAAGTCCC香型粳稻分子育種技術路線圖C.1給出了用于本文件規定的香型粳稻分子育種技術路線P1×P2P1×F1P1×香味基因雜合的BC1F1個體↓↓?香味基因純合的個體↓?穩定株系↓米質鑒定、抗病鑒定優良品系圖C.1香型粳稻分子育種技術路線注：圖中×表示雜交；?表示自交。（規范性）PCR擴增步驟D.1PCR反應體系將試樣DNA、2×TaqPCRMasterMix、引物1、引物2、引物3、引物4及ddH2O置于冰上融化。在200μL加蓋無菌離心管中，加入：2×TaqPCRMasterMix引物1(100nM)引物2(100nM)引物3(100nM)引物4(100nM)試樣DNA(50ng/μL)ddH2O0.4μL1.6μL1.6μL0.4μL 用移液槍抽打混勻，蓋上蓋子短暫離心，置于冰上待用。D.2PCR反應程序94℃預變性5min