GB/TXXXXX—XXXX泛腫瘤異質性血管細胞整合及鑒定指南范圍本文件給出了基于單細胞轉錄組測序數據整合與識別不同功能血管相關細胞的標準化數據處理方法，包括單細胞數據整合，污染因素去除，批次矯正以及細胞亞型鑒定方法等。本文件適用于腫瘤微環境、血管生成及內皮細胞研究的科學家和研究人員使用。本文件適合各級醫院腫瘤科、病理科等相關科室臨床醫師以及從事臨床教學、科研等工作者使用。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。Tumorvasculatureatsingle-cellresolutionUnderstandingtumourendothelialcellheterogeneityandfunctionfromsingle-cellomics術語和定義下列術語和定義適用于本文件。單細胞轉錄組測序single-cellRNAsequencing;scRNA-seq單細胞轉錄組測序是一種測序技術，用于捕獲和定量分析單個細胞的mRNA分子。這種技術允許研究人員在單細胞水平上研究基因表達，從而提供了對細胞間異質性、細胞發育軌跡和細胞間相互作用的深入理解。內皮細胞endothelialcells；ECs內皮細胞是覆蓋血管內表面的一層扁平細胞，形成了血管壁的內襯。這些細胞在動脈、靜脈、毛細血管以及淋巴管中均有分布，構成了血管內皮??。血管內皮細胞vascularendothelialcells；VECs血管內皮細胞是位于血管內壁的內皮細胞，負責調節血管的通透性、血液流動以及血管的收縮和擴張。血管內皮細胞在維持血管完整性和功能中起關鍵作用，參與血管生成、炎癥反應和血管舒張等過程。動脈內皮細胞arterialendothelialcells；ArtECs動脈內皮細胞是指覆蓋在動脈血管內壁的單層扁平細胞，屬于內皮細胞的一種。它們在維持血管功能和結構的完整性方面發揮關鍵作用。靜脈內皮細胞venousendothelialcells；VenECs靜脈內皮細胞是覆蓋在靜脈血管內壁的單層扁平細胞，屬于內皮細胞的一種。它們在調節血液回流、維持血管通透性和血管生物學功能方面起重要作用。毛細血管內皮細胞capillaryendothelialcells；CapECs毛細血管內皮細胞是指覆蓋在毛細血管內壁的單層細胞。這些細胞在微循環系統中起關鍵作用，負責調節血液與組織之間的物質交換。淋巴管內皮細胞lymphaticendothelialcells；LECs淋巴管內皮細胞是覆蓋在淋巴管內壁的細胞，屬于內皮細胞的一種。它們在調節淋巴液流動、免疫監視和維持組織液平衡方面起重要作用。壁細胞muralcell；MCs壁細胞是一類存在于血管壁和微血管壁的支持細胞，包括平滑肌細胞和周細胞。它們在維持血管的結構完整性和功能穩定性方面起著關鍵作用。周細胞pericytes；PCs周細胞是一種位于毛細血管和小靜脈周圍的間質細胞，嵌入在內皮細胞基底膜內。它們的主要特征是具有突起狀結構，可以延伸到血管壁上，與內皮細胞形成物理和功能上的聯系。平滑肌細胞smoothmusclecells；SMCs平滑肌細胞是內臟器官中的關鍵細胞，負責調節管腔和空腔器官的收縮和舒張。它們的結構、功能和調節機制使其在維持內臟器官的正常功能中扮演著重要角色。血管生成angiogenesis血管生成是指從現有血管中生成新血管的生物學過程。這個過程在許多生理和病理情況下都非常重要，包括胚胎發育、傷口愈合、月經周期以及腫瘤生長和轉移等。泛腫瘤單細胞轉錄組數據收集與整理為了使本標準更加全面與適用，前期收集了涵蓋31種癌癥類型的scRNA-seq數據，包括372名患者和437個樣本。經過數據處理和細胞注釋過程，本標準最終收錄了183,977個血管細胞（見表1）。這些scRNA-seq數據主要涉及7種技術平臺：10xGenomicsChromium、BDRhapsody、DropSeq、Microwell-seq、SeekOneDDChip、Seq-well和Singleron。對于可獲得原始scRNA-seq數據集，我們量化了基因表達計數矩陣；否則，我們下載了CPM/TPM矩陣并用于下游分析。總共有四種技術生成的數據集需要從原始數據開始處理，包括10xGenomicsChromium、BDRhapsody、Singleron和SeekOneDDChip。原始數據處理10xGenomicsChromium平臺：FASTQ文件使用CellRangertoolkit（v.6.1.2）進行比對和定量分析，初步過濾后的UMI矩陣由CellRanger流程生成，并用于下游分析。BDRhapsody平臺：FASTQ文件通過BDRhapsody?分析流程（BDBiosciences）進行處理，并在CWL-runner中實現。唯一分子標識符（UniqueMolecularIndentifier，UMI）計數使用BDBiosciences開發的遞歸替換誤差校正（recursivesubstitutionerrorcorrection，RSEC）算法進行校正，以糾正測序和PCR錯誤。條形碼寡核苷酸結合抗體（單細胞多重試劑盒；BDBiosciences）用于通過BDRhapsody分析流程推斷樣本來源。Singleron平臺：使用SCOPE-tools將FASTQ測序數據映射到人類基因組。首先，對讀段1進行過濾并提取細胞條形碼和UMI，將其添加到讀段2的ID中。然后，利用cutadapt對讀段2進行修剪。接著，使用STAR將修剪后的讀段2比對到參考基因組上。使用featureCounts將已比對的讀數定位到基因的基因組位置。最后，合并具有相同細胞條形碼、UMI和基因的讀數，得到每個細胞每個基因的UMI數量。SeekOneDDChip平臺：使用SeekOneTools（BeijingSeekGeneBioSciences）處理FASTQ原始數據，處理過程與CellRanger流程相似，最終輸出每個細胞在不同基因上的UMI值。注：所有讀段都比對到GRCh38版本的參考基因組中（ensembleversion99）。質量控制與數據過濾首先，我們對每個單細胞數據集應用Seurat管道ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA20，根據細胞內表達的基因數目、UMI數目，對細胞進行過濾ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA20。然后，我們使用CellCycleScoring函數計算線粒體和核糖體UMI計數的百分比，以及S期和G2M期的評分。接著，我們過濾掉線粒體UMI計數超過30%的細胞，并使用Scrublet的默認參數去除潛在的雙細胞ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA21。主要細胞亞群注釋與血管細胞提取使用“LogNormalize”方法對基因計數表達矩陣進行標準化，比例因子為10,000，并通過FindVariableFeatures函數使用“vst”方法識別前2,000個高變異基因。隨后，使用SCTransform函數對高變異基因表達矩陣進行標準化，應用回歸方法去除線粒體和核糖體基因百分比、細胞周期和供體的影響。接著，使用RunPCA函數進行主成分分析，然后用R包harmony中的RunHarmony函數對前30個主成分進行技術和樣本效應校正ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA22。通過FindNeighbors函數構建SNN圖，并使用基于“harmonyreduction”的FindClusters函數中的“Louvain算法”對細胞進行聚類。對于所有數據集，分辨率參數設置為2.0，以產生足夠細化的聚類ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA23。接下來，根據經典標記物的表達對血管細胞群進行注釋，內皮細胞（endothelialcells，ECs）使用PECAM1，壁細胞（muralcell，MCs，包括平滑肌細胞/周細胞）使用RGS5、PDGFRB、ACTA2和TAGLN。然后，我們使用FindAllMarkers函數識別每個血管群中的差異表達基因。發現某些群高表達編碼熱休克蛋白的基因，可能與先前描述的組織解離操作有關ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA23-25。我們統計了在解離相關群中復發率超過30%的標記基因，將其定義為解離誘導基因，并進一步使用AddModuleScore函數計算解離誘導基因評分。此外，識別出一些污染群，顯示出黑素細胞（PMEL、MLANA和TYRP1）、上皮細胞（EPCAM）、紅細胞（HBB、HBA1和HBA2）、髓系細胞（CD163、CD14和LYZ）、T/NK細胞（CD2、CD3D、PTPRC和KLRD1）以及B/漿細胞（CD79A和MS4A1）的特征。這些與解離相關和污染的群被排除在后續分析之外。表1.泛腫瘤單細胞轉錄組數據統計腫瘤類型縮寫測序技術患者數量樣本數量細胞數量AcralMelanomaAM10x5,BDRhapsody,Singleron193012,770BreastCancerBC10x,10x5,10x3,Singleron19193,851BasalCellCarcinomaBCC10x5,10x3,BDRhapsody,Singleron15219,363BladderCancerBLCASingleron999,688CholangiocarcinomaCHOL10x3684,077CutaneousNeurofibromacNF10x333,128ColorectalCancerCRC10x3,10x526322,668CutaneousSquamousCellCarcinomacSCC10x3,BDRhapsody,Singleron56840CervicalSquamousCellCarcinomaCSCSingleron232,782CutaneousTCellLymphomaCTCL10x5152831,283EndometrialCancerEC10x3552,543EpendymomaEPN10x322261EsophagealCarcinomaESCADropSeq525415,807GlioblastomaGBM10x,Microwell-seq,Singleron78972GastricCancerGC10x528286,213GastrointestinalStromalTumorGIST10x512185HepatocellularCarcinomaHCC10x315155,593HeadandNeckSquamousCellCarcinomaHNSCCBDRhapsody,Singleron,SeekOneDDChip16216,593MeningiomasMEN10x3374,482MelanomaMELBDRhapsody,Singleron9123,610NeuroendocrineTumorNET10x310127,255Non-smallCellLungCancerNSCLC10x3,BDRhapsody,Singleron17182,549OvarianCancerOC10x3,DropSeq31317,442OsteosarcomaOS10x314143,645PancreaticCancerPDACSingleron33245ProstateCancerPCaSeq-well15152,567PheochromocytomaPHEOSeekOneDDChip668,423PenileSquamousCellCarcinomaPSCCBDRhapsody,Singleron483,259RenalCellCarcinomaRCC10x3141420,419ThyroidCarcinomaTC10x,10x3,Microwell-seq14165,041UvealMelanomaUVM10x51168血管細胞整合與主要細胞群體鑒定細胞和基因篩選首先，整合由多個平臺生成的異質性血管細胞。篩選過程中，去除了在少于100個細胞中表達的基因，以及表達少于200個基因或多于4000個基因的細胞。基因表達矩陣標準化對整合后的基因表達矩陣進行標準化處理，檢測出前2000個高變異基因。為減少線粒體基因和核糖體基因百分比、細胞周期、解離誘導基因特征、技術和供體的影響，使用ScaleData函數對高變異基因計數矩陣進行Z-score標準化。批次效應消除為消除批次效應，利用R包simspec中的cluster_sim_spectrum函數計算聚類相似譜（ClusterSimilaritySpectrum，CSS）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>He</Author><Year>2020</Year><RecNum>122</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">26</style></DisplayText><record><rec-number>122</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="5zsxdxaabp9ft7eerz5xed2l229xpwpxsef0"timestamp="1717824943">122</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>He,Z.</author><author>Brazovskaja,A.</author><author>Ebert,S.</author><author>Camp,J.G.</author><author>Treutlein,B.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiosystemsScienceandEngineering,ETHZurich,Basel,Switzerland.zhisong.he@bsse.ethz.ch. MaxPlanckInstituteforEvolutionaryAnthropology,Leipzig,Germany. InstituteofMolecularandClinicalOphthalmology,Basel,Switzerland.grayson.camp@iob.ch. UniversityofBasel,Basel,Switzerland.grayson.camp@iob.ch. DepartmentofBiosystemsScienceandEngineering,ETHZurich,Basel,Switzerland.barbara.treutlein@bsse.ethz.ch. MaxPlanckInstituteforEvolutionaryAnthropology,Leipzig,Germany.barbara.treutlein@bsse.ethz.ch.</auth-address><titles><title>CSS:clustersimilarityspectrumintegrationofsingle-cellgenomicsdata</title><secondary-title>GenomeBiol</secondary-title></titles><periodical><full-title>GenomeBiol</full-title></periodical><pages>224</pages><volume>21</volume><number>1</number><edition>2020/09/02</edition><keywords><keyword>Genomics/*methods</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>*SequenceAnalysis,RNA</keyword><keyword>*Single-CellAnalysis</keyword><keyword>UnsupervisedMachineLearning</keyword></keywords><dates><year>2020</year><pub-dates><date>Sep1</date></pub-dates></dates><isbn>1474-760X(Electronic) 1474-7596(Print) 1474-7596(Linking)</isbn><accession-num>32867824</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/32867824</url></related-urls></urls><custom2>PMC7460789</custom2><electronic-resource-num>10.1186/s13059-020-02147-4</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>26，并采用默認參數。具體步驟如下：=1\*romani.將每個供體的細胞進行分組，基于預先計算的前20個主成分應用Louvain聚類，分辨率設置為0.6。=2\*romanii.計算每個供體中每個聚類的高變異基因平均表達量。=3\*romaniii.計算每個供體中細胞和聚類之間的Spearman相關系數。=4\*romaniv.對于每個細胞，將其與不同供體中不同聚類的相關性進行Z-score轉換，這些相關性被連接起來，形成了最終的CSS維度ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA27,28。=5\*romanv.在CSS維度上執行UMAP可視化。血管相關細胞的主要群落注釋根據經典基因表達，ECs被注釋為淋巴管內皮細胞（lymphaticendothelialcells，LECs）和血管內皮細胞（vascularendothelialcells，VECs），其中血管內皮細胞包括動脈內皮細胞（arterialendothelialcells，ArtECs）、靜脈內皮細胞（venousendothelialcells，VenECs）和毛細血管內皮細胞（capillaryendothelialcells，CapECs）。此外，我們檢測到正在經歷內皮-間充質轉化（endothelial-to-mesenchymaltransition，EndoMT）的VECs，這些細胞共表達內皮和間充質標記物。此外，在相應的癌旁組織中，還鑒定出兩種特定組織的內皮細胞，包括腎小球細胞（renalglomerularcells，RGCs）和肝竇內皮細胞（liversinusoidalECs，LSECs）（表2，圖1）。表2.血管相關細胞標記基因細胞分類細胞亞分類標記基因內皮細胞（ECs）淋巴管內皮細胞（LECs）LYVE1,PROX1動脈內皮細胞（ArtECs）SEMA3G靜脈內皮細胞（VenECs）ACKR1毛細血管內皮細胞（CapECs）RGCC壁細胞（MCs）周細胞（PCs）RGS5,PDGFRB平滑肌細胞（SMCs）ACTA2,TAGLN內皮-間充質轉化細胞（EndoMT）PDGFRB+EndoMT-IPECAM1，PDGFRBDCN+EndoMT-IIPECAM1，DCN組織特異性正常內皮細胞腎小球細胞（RGCs）EMCN，SOST，PLAT肝竇內皮細胞（LSECs）CLEC4G，CLEC1B圖1.泛腫瘤血管相關單細胞圖譜。(a)血管相關細胞的UMAP降維可視化結果，不同細胞類型使用不同的顏色進行了標注。(b)熱圖展示了不同血管相關細胞的經典基因表達水平。整合效果量化通過計算局部逆辛普森指數（LocalInverseSimpson’sIndex，LISI）來量化整合效果，使用R包LISI中的compute_lisi函數（/immunogenomics/LISI）。該指標反映了細胞鄰域中數據集的有效數量。較高的LISI值表示鄰域中由更多的數據集提供，從而降低批次效應。經過不同的處理過程，可以觀察到LISI水平逐步提高，這表明數據整合效果良好（圖2）。圖2.血管細胞的數據整合。(a)UMAP圖展示了整合步驟后血管細胞的分布（從原始計數到Z-score標準化再到CSS）。經過CSS處理后，不同平臺生成的細胞明顯聚類。(b)UMAP圖展示了各細胞類型的選定標記基因表達。(c)箱線圖展示了每個整合步驟后的LISI值（n=116,958個細胞）。對于箱線圖，中心線表示中位數，箱體范圍表示上四分位數和下四分位數，須線延伸至1.5倍四分位距。血管細胞鑒定魯棒性分析在本研究中，我們對血管細胞鑒定和整合的魯棒性進行了多方面的詳細分析。以下是主要分析點：數據整合方法選擇我們采用了CSS算法進行數據整合，而非廣泛使用的Harmony方法。Harmony因可能導致過度矯正而著稱，從而可能掩蓋生物學上真實存在的差異。CSS通過不同樣本中細胞聚類的相似性來表征每個細胞，生成無監督的無參考數據表示。批次矯正性能比較我們對CSS與BBKNN和Harmony等已知方法的批次矯正性能進行了詳細比較（圖3a）。觀察到使用不同批次矯正方法后，內皮-間充質轉化（EndoMT-ECs）細胞類型的分布明顯不同（圖3b）。在我們的研究中，EndoMT-ECs被注釋為兩種類型：PDGFRB+的EndoMT-I和DCN+的EndoMT-II（圖3c）。LISI分析通過計算局部LISI，進一步量化了不同方法的單細胞整合效果（圖3d）。結果表明，CSS在整合單細胞數據時，相較于BBKNN和Harmony是一種相對溫和的方法，能夠更好地減少批次效應而不過度矯正。血管細胞獨立聚類現象分析獨特屬性和內皮細胞異質性：除了ArtECs，VenECs，CapECs外，還有一些特定器官的EC群體，如維持肝星狀細胞在靜止狀態的LSECs，從而抑制肝內血管收縮和纖維化的發展ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA29；以及具有獨特窗孔特征的RGCs，能夠處理大量的過濾ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA30。因此，考慮到這些細胞的獨特屬性和內皮細胞的異質性，數據整合后獨立的LSECs和RGCs群體可以作為潛在批次效應被校正的指示。數據來源和樣本組成分析：我們分析了LSECs和RGCs的數據來源、樣本組成和樣本類型（圖3d）。LSECs主要來源于多份樣本的相鄰非腫瘤組織，這些樣本來自兩個已發表的數據集：Lu等人的肝癌研究ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA31和Zhang等人的肝內膽管癌研究ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA32。RGCs主要來自一個樣本的相鄰非腫瘤組織（GSM4735369，83%）。此外，GSM4735369僅貢獻了我們的圖譜中的RGCs（圖3f）。因此，我們可以認為這是一個樣本特定的RGCs群體。獨立數據集驗證：為了進一步確認這兩個細胞群體的身份，我們進行了獨立的數據整合測試。我們使用了兩個單細胞數據集，每個數據集都有預定義的肝臟和腎臟組織的細胞類型。一個數據集用于LSECs（來自MacParland等人）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA33，另一個用于RGCs（來自Zhang等人）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA34。結果顯示，新加入的細胞能夠與我們的LSECs和RGCs聚合（圖3g）。此外，LSEC和RGC相關的細胞標志物（RGC:EMCN、SOST和PLAT；LSEC:CLEC4G和CLEC1C）在我們的LSECs和RGCs中高度表達，進一步支持了我們定義的細胞身份。綜上所述，通過采用CSS算法和多種分析方法，我們確保了血管細胞鑒定的魯棒性，減小了批次效應的影響，同時保留了生物學上的重要差異，為泛腫瘤異質性血管細胞的整合和研究提供了堅實的基礎。圖3.數據整合和批次效應矯正分析。(a)不同方法的UMAP圖，展示了CSS、BBKNN和Harmony的整合效果。(b)不同批次矯正方法下的EndoMT-ECs分布比較。(c)PDGFRB+的EndoMT-I和DCN+的EndoMT-II的UMAP圖。(d)使用不同方法計算的LISI值比較。(e)LSECs和RGCs的數據來源、樣本組成和樣本類型分析。(f)GSM4735369在RGCs群體中的貢獻。(g)獨立數據集的整合驗證，展示了LSECs和RGCs的融合情況。(h)LSECs和RGCs相關細胞標志物的表達水平(RGCs:EMCN,SOST和PLAT;LSECs:CLEC4G和CLEC1C)。小結及展望在本指南中，我們詳細闡述了基于單細胞轉錄組測序數據，整合和鑒定泛腫瘤異質性血管細胞的方法和流程。通過對183,977個血管細胞的分析，我們成功識別并分類了多種內皮細胞和壁細胞，揭示了腫瘤微環境中血管細胞的復雜性和多樣性。這些發現不僅有助于深入理解內皮細胞在腫瘤進展和抗血管生成療法中的關鍵角色，還為未來的抗血管生成治療提供了新的思路和潛在靶點。隨著單細胞技術和數據分析方法的不斷進步，我們可以期待更高分辨率和更大規模的數據整合與分析，從而更全面地揭示血管細胞的異質性和功能特性。此外，結合多組學數據和空間轉錄組學技術，我們將能夠更加精準地描繪血管細胞在腫瘤微環境中的動態變化和相互作用。這將進一步推動精準醫療和個性化治療的發展，為臨床應用提供更加堅實的理論基礎。我們相信，這些研究成果將促進抗血管生成療法的優化和創新，提高其在不同腫瘤類型和患者中的療效，最終為癌癥治療帶來新的突破。參考文獻ADDINEN.REFLIST1 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