1/1胞內S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和ER-α表達的關系胞內S-腺苷同型半胱氨酸升高抑制HUVEC增殖和ER-表達的關系【摘要】目的探討S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）升高抑制血管內皮細胞增殖和雌激素受體-（estrogenreceptor-，ER-）基因表達變化的關系。

方法以分離的原代人臍靜脈內皮細胞（humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）為研究對象，經不同濃度的SAH水解酶強效抑制劑3-deazaadenosine（DZA）處理24～72h后，反相高效液相色譜法測定胞內SAH濃度，利用細胞計數法、流式細胞儀和TUNEL技術檢測細胞的增殖凋亡能力，Westernblot法檢測ER-蛋白的表達，熒光定量-PCR檢測其mRNA表達，甲基化特異PCR法檢測ER-基因啟動子甲基化狀態。

結果經DZA處理后，HUVEC胞內SAH濃度升高（P＜0.05），生長增殖能力降低（主要受阻于G1/G0期），凋亡率增加（P＜0.05），ER-mRNA和蛋白的相對表達量降低（P＜0.05），但DZA處理前后ER-基因啟動子甲基化狀態不發生明顯改變。

結論SAH升高抑制HUVEC的增殖能力與ER-的表達變化有關，但這種作用不是通過改變ER-基因啟動子的甲基化而實現的。

【關鍵詞】S-腺苷同型半胱氨酸人臍靜脈內皮細胞雌激素受體-甲基化Abstract：

ObjectiveToexploretherelationshipofinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularS-adenosylhomocysteine(SAH)accumulationandexpressionofestrogenreceptor-(ER-)inHUVEC.MethodsAfterisolatedprimaryHUVECtreatedwithout(normal)orwith3-deazaadenosine(DZA),apotentS-adenosylhomocysteinehydrolaseinhibitor,for24-72h,intracellularSAHlevelwasmeasuredwithreversedphasehigh-performanceliquidchromatography(RP-HPLC).TheproliferativeabilityofHUVECwasdetectedwithcytometry,flowcytometryandTUNELmethods.TheexpressionofER-proteinandmRNAwasdeterminedwithWesternblotandquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(qRT-PCR)techniques,respectively.ThepromotermethylationofER-genewasanalyzedwithmethylationspecificPCR(MSP).ResultsTheresultsshowedthatthelevelofintracellularSAHwasincreasedinHUVECincubatedwithDZAcomparedtonormal.TheproliferativeabilityofHUVECweredecreasedandtheapoptoticratewasincreasedaftertreatmentwithDZA(P＜0.05).TherelativeexpressionofER-mRNAandproteininHUVECtreatedwithDZAwaslowerthanthatofnormal(P＜0.05).ButtherewerenoobviouschangesofER-genepromotermethylationinHUVECbeforeandaftertreatmentwithDZA.ConclusionsThesefindingssuggestedthattheinhibitedproliferativeabilityinducedbyintracellularincreasedSAHwascorrelativewithER-expressioninHUVEC.Thisactionwasnotrelatedwithitspromotermethylatedpatterns.Keywords:S-adenosylhomocysteine;humanumbilicalveinendothelialcells;estrogenreceptor-;methylation隨著研究的深入，人們逐漸發現血漿同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）與血管疾病間并不一定存在著必然的因果關系，蛋氨酸的另一中間代謝產物S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）可能是血管疾病的真正致病因素，而Hcy可能只是其中的一個伴隨現象［1］。

近年來人們研究證實，動脈粥樣硬化（artherosclerosis，As）相關基因啟動子甲基化的改變，導致其轉錄失調在As形成過程中拌演著重要的角色［2］。

我們先前研究發現3-deazaadenosine（DZA）作為S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的強效抑制劑，其應用在降低Hcy的同時，可以升高胞內SAH含量，降低DNA甲基轉移酶1的表達，導致整體基因組低甲基化［3］。

為了進一步闡明SAH升高促進As形成的機制，本研究探討了DZA對HUVEC增殖的影響與ER-基因表達變化及其啟動子甲基化的關系。

1材料和方法1.1主要試劑1640培養基干粉購于Hyclone公司；特級胎牛血清、DeathDetectionKit(POD原位細胞凋亡檢測試劑盒)購于醫學科學研究院生物工程研究所；SAH標準品和DZA購自Sigma公司；CytotoxicityDetectionKit購自(RocheMolecularBiochemicals公司；CycleTESTTMPLUSDNA試劑盒購自BDBiosciencesPharmingen公司；UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（CatDV811A）購自寶生物工程（大連）有限公司；GENMED蛋白質西方雜交印跡試劑盒（Cat.GMS30005.2）購自上海杰美基因醫藥科技有限公司；EZDNAMethylation-GoldKit(tm)試劑盒（Cat.D5005）購自ZYMORESEARCHCORP公司。

1.2細胞來源及分組取足月妊娠分娩后的新生兒臍帶20cm，1.25g/L胰蛋白酶消化分離內皮細胞，1640培養基，10%胎牛血清，5％CO2，37℃常規培養傳代［4］。

考慮SAH不能直接通過哺乳動物的細胞膜，應用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑DZA阻斷SAH向Hcy的轉化，從而升高胞內SAH的濃度。

實驗分為以下4組：

①對照組；②5mol/LDZA處理組；③10mol/LDZA處理組；④20mol/LDZA處理組。

處理時間分別為24、48、72h，對照組用等體積的滅菌雙蒸水代替DZA。

經CytotoxicityDetectionKit檢測乳酸脫氫酶（LDH）釋放量完全排除了DZA的細胞毒性作用。

1.3反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定SAH濃度提取胞漿蛋白，Bradford法測蛋白含量后，按1∶1體積比加入等量三氯乙酸（100g/L，含4mmol/LEDTA2K)，漩渦振蕩混勻，4℃13000r/min離心10min。

取20l上清液上機分析胞漿SAH的濃度（nmol/mgprotein）。

檢測條件：

美國Waters公司高效液相色譜儀，Empower色譜工作站，Waters1525BinaryHPLCpump高壓泵，7125i進樣器，Waters2966photodiodearraydetector紫外檢測器；大連依利特HypersilBDSC18(4.6mm250mm，5m)色譜柱；柱溫40℃；檢測波長260nm；流動相50mmol/LNaH2PO4(pH=5.5)∶甲醇=9.5∶0.5,流速0.8ml/min；進樣量20l。

1.4細胞生長曲線繪制以5104個/ml密度接種HUVEC細胞于24孔培養板中，每孔2ml，分別加不同濃度的DZA干預培養1～4d，每天各取3孔，臺盼藍染色，顯微鏡下計數非染色的活細胞數，繪制生長曲線，并按如下公式計算細胞生長抑制率（GI）=（Nc-Nt）/Nc100%，其中Nc和Nt分別為某一時相點對照組和處理組細胞數。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期相分布按照BDBiosciencesPharmingen公司提供的CycleTESTTMPLUSDNA試劑盒說明書進行。

細胞經處理后送至中山大學免疫教研室用BDFACScan流式儀（Macintosh操作平臺，BDCellQuest1.0分析軟件）分析細胞周期相分布。

1.6TUNEL檢測細胞凋亡按照DeathDetectionKit,POD原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。

主要步驟：

4%多聚甲醛溶液室溫固定HUVEC30min，PBS洗片，與阻斷劑（0.3%H2O2甲醇溶液）室溫孵育30min，PBS洗片，加通透液（0.1%TritonTMX-100溶于0.1%枸鞣酸鈉溶液）在冰浴中孵育2min，PBS沖洗2次，滴加50l的TUNEL反應混合液，在濕盒中37℃孵育60min，PBS沖洗3次，在熒光鏡下分析結果并照相。

1.7Westernblot法檢測ER-蛋白的表達按照GENMED蛋白質西方雜交印跡試劑盒說明書進行。

提取胞漿蛋白，Bradford法測蛋白含量后，取40g總蛋白進行SDS凝膠電泳并轉移至聚偏(二)氟乙烯膜（PVDF），1%BSA的PBST（含5%tween-20的PBS緩沖液）封閉1h，1∶400稀釋ER-單抗4℃過夜，PBST漂洗10min3，1∶40稀釋生物素化二抗工作液，室溫振搖1h，PBST漂洗10min3，1∶40稀釋HRP標記的鏈酶卵白素三抗工作液，室溫振搖1h，PBST漂洗10min3，DAB顯色，照相并進行圖象分析計算ER-蛋白的相對表達量（正常組設為100）。

1.8qRT-PCR法檢測ER-mRNA的表達HUVEC細胞經處理后送至中山大學達安基因有限公司檢測ER-mRNA的表達量。

用TRIZol提取總RNA，取4lRNA模板做逆轉錄成cDNA。

內參-actin采用RT-PCR熒光定量，ER-采用巢式RT-PCR熒光定量。

-actin引物：

Forward5-GCGCGGCTACAGCTTCA-3，Reverse5-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3，探針序列5-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGA-TAMRA-3；ER-外引物：

Forward5-TGCCAGGCTTTGTGGATTTG-3，Reverse5-GCCGCTGCATGACCTCCT-3，內引物：

Forward5-TCTCGTCTGGCGCTCCAT-3，Reverse5-CTGGTTCCTGTCCAAGAGCAA-3，探針序列5-FAM-CACCCAGGGAAGCTACTGTTTGCTCCTAA-TAMRA-3。

所有引物由上海生工合成。

ER-mRNA的相對表達量為ER-拷貝數與-actin的拷貝數之比。

1.9MSP法檢測ER-基因啟動子甲基化按照UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（Cat.DV811A）說明書提取DNA，按照EZDNAMethylation-GoldKit(tm)試劑盒（CatalogNos.D5005）說明書步驟對DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。

通過http://www.ucsf.edu/urogene/methprimer設計ER-甲基化（M）和非甲基化（U）引物，由上海生工合成，其中甲基化引物：

Forward5-GAACGAGTTGGAGTTTTTGAATC-3，Reverse5-CCGATCTAACCGTAAACCTACG-3，擴增片段171bp；非甲基化引物：

Forward5-GAATGAGTTGGAGTTTTTGAATTGT-3，Reverse5-AAAAACCAATCTAACCATAAACCTACA-3，擴增片段176bp。

該引物對應序列位于ER-基因啟動子的第二CpG島（457bp-843bp）。

擴增條件：

94℃5min，94℃30s，59.5℃30s，70℃30s，40循環，最后70℃延伸10min。

擴增產物2%凝膠電泳30min觀察并照相。

1.10數據處理用SPSS10.0軟件進行統計學處理，數據用s表示，采用Studentsｔ檢驗獨立樣本的差異性，least-squares法進行相關性分析，檢驗的顯著性水平設在Ｐ＜0.05.2結果2.1胞內SAH濃度（圖1）對照組細胞內SAH的濃度為4.320.65nmol/mgprotein，培養24,48,72h后，其含量處于一個相對穩定水平。

但經DZA處理后，胞內SAH的濃度顯著升高（Ｐ＜0.05），DZA的作用濃度越高、作用時間越長，胞內SAH含量增加越明顯，提示DZA對胞內SAH濃度的增加效應具有時間和劑量依賴性。

2.2HUVEC細胞生長增殖能力（圖2）從HUVEC細胞的生長曲線反應DZA對血管內皮細胞生長增殖能力的影響。

按公式計算結果顯示DZA處理24～96h對HUVEC細胞的生長抑制率為24.1%～69.6%，相關性分析顯示SAH濃度與細胞數存在負相關（r=-0.89,Ｐ＜0.001），提示胞內SAH升高能抑制HUVEC細胞生長增殖。

2.3細胞周期相分布經三種不同濃度的DZA分別處理24,48,72h后，細胞周期相的百分比分布發生不同的變化，其中G1/G0期隨著DZA濃度的增加和作用時間的延長，由正常對照的53.4612.35%上升至58.2113.24%～86.2013.57%，S期由正常對照的35.198.96%下降至33.188.55%～8.102.46%，而G2/M期的變化無規律，提示胞內SAH升高主要使HUVEC細胞周期受阻于G1/G0期（Ｐ＜0.05），而S期減少（Ｐ＜0.05）。

2.4HUVEC細胞凋亡結果（圖3）利用TUNEL法檢測細胞凋亡時，在熒光顯微鏡下觀察到凋亡的細胞呈陽性。

本實驗中對照組可見少量熒光染色呈陽性的凋亡細胞，20mol/LDZA處理24,48,72h后，熒光染色的強度逐漸增加，特別是作用72h后熒光強度最強，提示胞內SAH升高能使HUVEC血管內皮細胞產生凋亡。

2.5ER-蛋白表達（圖4）Westernblot法檢測ER-蛋白的表達結果以PVFD膜上染色條帶的深淺來判斷蛋白表達的高低。

實驗結果顯示，對照組染色條帶最深，5,10,20mol/LDZA處理24h后，染色條帶強度逐漸減弱（圖4A），圖片分析結果顯示ER-蛋白的相對表達量（對照組設定為100%）隨著DZA濃度的增加而降低（Ｐ＜0.01，圖4B），SAH濃度與ER-蛋白的相對表達量存在負相關（r=-0.92,Ｐ＜0.001），提示胞內SAH升高能抑制促增殖基因ER-蛋白的表達。

2.6ER-mRNA表達（圖5）不同濃度的DZA處理72h后，與對照組相比，HUVEC細胞ER-mRNA的表達量顯著降低，隨著DZA濃度的增加，其表達量下降越明顯（Ｐ＜0.05），SAH濃度與ER-mRNA的表達量間也存在負相關（r=-0.88,Ｐ＜0.001），提示胞內SAH的升高能抑制ER-mRNA的表達。

圖5熒光定量PCR檢測ER-mRNA表達（n=3）2.7ER-基因啟動子甲基化（圖6）甲基化特異的PCR（MSP）引物有兩對：

一對是針對基因啟動子CpG島未甲基化序列的引物（U），另一對是針對基因啟動子CpG島發生甲基化序列的引物（M），因而兩對引物中只有一對引物（U或M）能擴增，其MSP產物電泳結果只有一個亮帶。

對照組HUVEC細胞ER-基因啟動子第二CpG島U引物未見擴增產物（176bp），而M引物的擴增產物在171bp處有一亮帶，表明ER-基因啟動子第二CpG島處于甲基化狀態，經5,10,20mol/LDZA處理72h后，其甲基化狀態仍未發生改變，提示DZA并不能改變ER-基因啟動子第二CpG島甲基化狀態。

3討論血管內皮細胞損傷是As發生的早期病理特征。

以往有研究發現血管內皮細胞功能的損傷，并不總是隨著循環系統中總同型半胱氨酸濃度的增加而增加［2，5］。

本研究結果顯示，應用DZA升高了胞內SAH含量，細胞的生長增殖能力下降24.1%～69.6%（主要受阻于G1/G0期），同時凋亡率增加，SAH濃度與細胞數存在負相關（r=-0.89,Ｐ＜0.001），從而提示SAH升高能抑制血管內皮細胞的生長，SAH在As的形成過程中發揮著重要的作用。

有關表遺傳學中特異基因啟動子甲基化導致其表達變化在腫瘤中報道較多，但在As中目前只有對ER-、ec-sod及p53等少數幾個基因的研究［6］，胞內SAH的升高抑制血管內皮細胞增殖是否與增殖基因ER-啟動子的甲基化而導致其表達有關，未見報道。

雌激素受體（ER）屬于核受體家族，有ER-和ER-兩個亞型。

在心血管疾病中對ER-的研究較多，而對ER-的研究較少［7］。

KortelainenML等［8］用ER的單克隆抗體檢測發現絕經前的女性中患有明顯As者其表達降低，提示ER基因表達沉默與As形成有明顯的相關性。

近年來對已患有冠心病女性的隨機研究表明雌激素替代療法（HRT）對絕經后女性沒有益處，且這種效應與脂質變化無關，提示可能有其他機制參與。

為了探討該機制，PostWS等［9］采用Southernblot方法研究表明在右心房中年齡相關ER-基因甲基化增加，在靜脈和動脈中能檢測到ER-表達，在As斑塊中比正常鄰近動脈ER-基因甲基化明顯增加，而在體外培養人動脈內皮細胞ER-基因甲基化卻保持較低。

另外，在培養動脈平滑肌細胞（SMC）與As斑塊中的SMC有相似的表型，ER-基因甲基化水平較高（19%～99%），從而提示血管組織中ER-基因甲基化致其表達失活在As形成和血管系統老化中發揮重要作用［10］。

另有研究也發現ER-基因甲基化與老齡化As呈明顯相關性（r=0.36，Ｐ＜0.05）［9］。

然而，本實驗結果顯示，對照組HUVEC細胞ER-基因處于甲基化狀態，其mRNA的表達量相對內參-actin來說較低，胞內SAH升高對ER-基因的甲基化狀態沒有明顯的改變，但在轉錄和翻譯水平降低了ER-表達（r=-0.92,-0.88,Ｐ＜0.001），提示SAH升高對ER-的調節作用不是通過改變啟動子甲基化實現的，是通過何種途徑還有待進一步的探討。

【參考文獻】［1］FruchartJC,NiermanMC,StroesES,etal.NewRiskFactorsforAtherosclerosisandPatientRiskAssessment［J］.Circulation,2004,109(23Suppl1):15-19.［2］BrattstromL,WilckenDE.HomocysteineandCardiovascularDisease:CauseorEffect?［J］.AmJC