評價要求qPCR法和dPCR法國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會 I 2規范性引用文件 2 7 6核酸靶序列定量的方法設計和優化 7數據質量控制與分析 8核酸定量測量方法的驗證 附錄A(資料性)分光光度法 附錄B(資料性)核酸完整性 25附錄C(資料性)PCR擴增效率 27附錄D(資料性)測量不確定度 I本文件等同采用ISO20395:2019《生物技術核酸靶序列定量方法的性能評價要求qPCR法和1生物技術核酸靶序列定量方法的性能評價要求qPCR法和dPCR法本文件適用于數字PCR(dPCR)或實時定量PCR(qPCR)擴增技術對DNA(脫氧核糖核酸)和DNA(gDNA)和質粒DNA;單鏈DNA(ssDNA),互補DNA(cDNA),單鏈RNA(ssRNA)包括核糖體RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA);雙鏈RNA,包括長鏈和短鏈非編碼RNA[微小RNA(miRNA)和ISO/IEC指南98-3:2008測量不確定度第3部分：測量不確定度的表達指南(GUM:1995)[Uncertaintyofmeasurement—Part3:Guidetotheexpressionofuncertaintyinmeasurement(GUM:ISO/IEC指南99國際計量詞匯基本和通用概念以及相關術語(VIM)[Internationalvocabularyofmetrology—Basicandgene2GB/T42077—2022/ISO20395:2ISO/IEC指南99界定的以及下列術語和定義適用于本文件?？截悢禎舛萩opynumberconcentration3GB/T42077—2022/ISO20395:2019定量循環差值deltaC?數字PCRdigitalPCR將核酸模板分布在多個等體積的反應單元，每個反應單元中包含或不包含一個或多個拷貝的靶序列(核酸模板),對靶序列進行PCR擴增λ定量限limitofquantification;LOQ由給定的測量程序獲得的測得值。其聲稱樣品中不存在某種成分的誤判概率為β,其存在某種成線性linearity用一種方法分析描述一定范圍內提供與在實驗室樣品中測定的核酸靶序列的濃度和儀器響應信號4[來源：ISO/IEC指南99:2007,2.23,有修改]分析描述加熱過程中DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線。由于DNA雙螺旋是在一定溫度范圍內而不是在一個特定的溫度下解離，當50%的雙鏈DNA螺信使RNAmessengerRNA;mRNA無模板對照notemplatecontrol;NTC通過減去(C。標度)或除以(線性標度)反映非特定技術因素的一個或多個參數來修正核酸靶序列反應單元partitionsPCR分析PCRassay用指定的寡核苷酸引物(在某些情況下，還包括一個或多個探針)鑒定和/或量化核酸靶序列的5PCR效率PCRefficiencyE每一個PCR循環擴增得到的分子(產物)的量與模板的比值。實時定量PCRquantitativereal-timePCR將特定的DNA片段進行體外擴增與利用熒光信號積累實時檢測和定量擴增過程中特定PCR產內參基因referencegene內源基因endogenousgene靶基因在每個生物樣本中幾乎以恒定的拷貝數濃度存在，對生物或實驗條件變化引起的反應波動在適當的條件下，逆轉錄酶利用一個或多個寡核苷酸引物由以RNA為模板合成cDNA的過程。參與逆轉錄反應中實際轉化合成cDNA的RNA模板的百分比。逆轉錄陰性對照RTminuscontro逆轉錄dPCRreversetranscriptiondPCR;RT-dPCR首先用逆轉錄酶將RNA鏈反轉錄生成與其互補的DNA(互補DNA或cDNA),然后以合成的cD-NA為模板使用dPCR進行擴增的過程。6GB/T42077—2022/ISO20395:2首先用逆轉錄酶將RNA鏈反轉錄生成與其互補的DNA(互補DNA或cDNA),然后以合成的cD-NA為模板使用qPCR進行擴增的過程。樣本sample當基因組(或其他靶序列)中的單個核苷酸A,T,C或G與對照模板的差異而引起的DNA序列變模板template測試樣品testsample7GB/T42077—2022/ISO片段的隨機性以及實驗過程的標準化。4.2～4.4概述了宜考慮的特定因素。在方法驗證(8.2)中對擬4.2定量方法4.2.1概述4.2.2qPCR標準曲線法測定核酸濃度標準曲線應使用具有特定的絕對或相對濃度且具有與測試樣品相同或相似基質的標準品來構建轉錄步驟。如果分析環狀DNA,則應先線性化去除所有的超螺旋。如果測試樣品是單鏈DNA(例如曲線公式宜反映出1個單位的C?值的差異。標準溶液的濃度應均勻地分布在整個待測樣本濃度范圍內，最好超出樣本的濃度范圍。至少宜使 (1)a——標準曲線的截距；b——斜率。dPCR是一種終點測量的方法，具有無需使用標準曲線即可直接定量核酸靶序列的能力。含有測8GB/T42077—2022/ISO (2)Np——陽性反應單元數；Nr——反應單元總數。 (3)用于計算拷貝數濃度的分割體積應以儀器期間核查的經驗值或已發表的積引入的測量不確定度應反映在拷貝數濃度的合成測量不確定度中(見10.4)。如果dPCR混合液和測試樣本的稀釋液是按照體積配制的，則測試樣品的拷貝數濃度(copies· (4)如果dPCR混合液和測試樣本的稀釋液是按照重量配制的，則測試樣品的拷貝數濃度(copies·如果模板是單鏈的，則估算的拷貝數濃度是指單鏈模板的拷貝數濃度。如果模板包含目標序列多4.2.4qPCR相對定量法在數據分析中計算的初始△C?應基于使用同一PCR分析兩個樣本之間的C。值。不推薦用同一樣本經過兩次PCR擴增后的C?值來計算初始△C?,因為該△C?在目標數量方面沒有可比性，且不同相對定量=(1+E)AC? (6)91:1比例的參考樣品對兩次PCR擴增下qPCR擴增效率可能出現的差異進行歸一化。此外，用于相對定量的qPCR宜在每次PCR擴增時添加參考品或參照模板作為對照，以監測定量方法隨時間變化的再現性，這是因為與使用標準曲線不同(參見4.2.2),該方法沒有已知濃度的標準品且也不能在每個實驗中都檢測PCR擴增效率。的有效性。這些檢查可以是諸如偏離假設分布的統計測試或量化位數圖檢驗等方式。對于任何分布假如果使用對數轉換后的數據進行統計分析，則置信區間和測量不確定度應在同一標度上。如果將足以覆蓋兩個非對稱置信區間中最大的一個。確定同一測試溶液中的靶基因A和靶基因B的比率，可以使用雙重dPCR檢測。在雙重測定條件歸一化策略總體來說消除了影響樣本的非特異性信號，因此避免了非特異性擴增對靶基因測定的影響。通過有效的歸一化策略可控制的技術因素包括來自采樣、運輸和儲存過盡管歸一化通常應用于qPCR的Cg值，但C?值和拷貝數都可以進行歸一化。有許多方法可用于對技術差異進行歸一化，其適用于DNA或mRNA(基因表a)基于內參基因歸一化。定量基因組DNA(gDNA)時，數據可以歸一化為一個或多個參考基因。宜評估多個基因組位點，以確保所選位點能代表基因組拷貝數。所使用的參考基因應對并且在GOI分析時會產生偏差，因此歸一化時宜使用多個內參基因。測量mRNA和miRNA表達的參考基因，應在適用于測量程序的實驗條件和樣品類型下進行實驗驗證?？梢允褂媒y計數據來確定進行歸一化的最佳參考基因數量。c)基于所有的檢測基因的表達量歸一化，通常被稱為整體歸一化。當無法確定可做參考的穩定基因(例如在某些情況下用于miRNA表達測量和單細胞基因表達研究)時，只要測量的目標樣本量足夠多，就能使用該方法。宜評估整體歸一化所需的樣本量。d)在基于qPCR或dPCR測量程序的測試結果被報告為指定輸入量的情況下，對樣本的數量來進行歸一化。比如細胞數、血液體積或RNA總量。對于某些應用，例如僅基于少數細胞的應用，其表達是隨機的，且輸入量是獨立定義的(如通過顯微鏡),對樣本的數量來進行歸一化比對內參基因進行歸一化要更好。4.4對照設置qPCR或dPCR方法應設置正確的對照以評估所產生的數據的總體質量和可靠性。對照品的性質宜準確反映測試樣本。方法宜明確每個分析實驗中包括的陽性和陰性對照。表1給出了相關對照的示例。陰性對照應與測試樣品一起，包含PCR設置的陰性對照及與分析樣品進行同樣提取和制備過程的提取空白對照。陰性對照宜設置在測試樣本中，以便評估測試樣品分析過程中的污染程度。對于RT-qPCR或RT-dPCR方法，陰性對照應包括含有陽性RNA樣品的RT(一)對照，該RNA樣品已用RNA分離方法處理。在合適的情況下，陽性對照材料的核酸序列純度宜通過深度測序驗證。用作標準品的陽性對照材表1核酸靶序列定量方法的陽性對照和陰性對照對照對照典型組成列入原因陰性檢測反應階段的污染(用于DNA分析的qPCR/dPCR;分別用于RNA的1步或2步分析的RT-qPCR/dPCR或RT);檢測非預期的擴增產物，如使用dsDNA結合染料時可能出陰性提取空白陰性RT(一)gDNA的擴增(用于mRNA檢測)陰性照，不包含靶序列的模板表征和監測假陽性率(例如，用于SNVs的10NA;用于轉基因檢測的非轉基因樣品)陽性具有良好特性的生物材料或鑒定反應成分的功能，并評估PCR擴增效率；陽性陽性內參對照加內參基因的樣本或空白基質確認沒有發生抑制反應(QC為假陰性結果)注：對照類型來源自ISO24276。GB/T42077—2022/ISO5.2.4qPCR/dPCR法評估總DNA GB/T42077—2022/ISO20395:2019d)靶gDNA的RT(一)對照反應或分析方法也適用于確定RNA樣品中的gDNA污染(見設計引物的退火溫度宜在50℃~68℃范圍內，GC含量宜在40%～60%范圍，同時沒有任何明顯的二級結構。引物對中的兩條引物T。之差宜在1℃~2℃。探針長度宜小于30個堿基。使用水解探針時，探針的Tm要求宜比引物的Tm至少高5℃。另與相似序列結合(例如，同一基因組內的同源基因)。如果引物對之間miRNA通常形成密切相關的序列家族，它們之間的差異僅為1bp～2bp,因此應針對相同體外測試(見6.2.5)。與原始miRNA和前體miRNGB/T42077—2022/ISO20395:2019生物信息學特異性分析宜包括針對特定基因組參考序列的BLAST搜索。交叉反應的影響宜在測對于使用基于oligo(dT)引物法合成cDNA的RT方法來說，由于mRNA轉錄片段斷裂或逆轉錄應優化核酸定量檢測方法性能。下面列出了為獲得最佳檢測性能而宜考慮可以從供應商購買基于核酸定量的檢測方法。分析方法在用于分析之前對于dPCR,還需優化以最大程度地減少陰性和陽性簇群之間具有中等熒光幅度(對于實時dPCR系統為C?)的反應單元數量。數字化分析(Rs)的分辨率是對兩個正負簇(陽性和陰性)在線性分離中的區分程度的定量度量。Rs定義為兩個峰之間的熒光差異除以峰的合并寬度。對于較復雜的樣本允許PCR擴增效率應通過校準曲線或稀釋系列DNA(qPCR)或RNA(RT-qPCR)進行分析評估(見附錄C)。對于RT-qPCR,應使用RNA校準品或一系列RNA稀釋液進行校準，因為這樣可以在適用的線性范圍內驗證相同的逆轉錄效率。對于RT-qPCR分析，還可以使用DNA校準品或稀釋系列標準曲線或稀釋系列溶液的斜率可以轉換為效率值(見附錄C)。(RT)-qPCR的效率宜在多個實驗(至少3個)中進行評估，并宜計算置信區間以評估估計的準確性。在無干擾的情況下(參見6.3.1),PCR平均擴增效率宜為90%～110%(-3.6≥斜率≥-3.1)。線性應以相關系數(如皮爾遜相關系數R)表征。相關系數R2宜大于0.99。 8核酸定量測量方法的驗證8.1通則核酸定量測量方法(qPCR和dPCR)應驗證。ISO5725-1提供了方法驗證的一般指導。方法驗證 在8.2～8.7中給出了表征qPCR和dPCR測量程序的這些性能屬性的要求，并在8.8和8.9中分別提供了對qPCR和dPCR的特殊考慮。8.2精密度精密度是在規定條件下，對同一被測樣品獨立重復測量所得的測得值間的重復測量(在實驗范圍內)和獨立實驗的次數應足以提供可靠的標準偏差(SD)估計。ISO5725-1分別根據公式(8)和公式(9)采用單因素方差分析(ANOVA)方法，計算相對重復性(Srpeat,ra)和相 (8) (9)應指定與L0Q相關的精密度，如SD或RSD。LOQ水平。LOQ估計的精密度取決于在每個濃度下的重復次數以及樣品之間的濃度差異。每個濃度至少須重復10次，并且要小幅增加濃度(LOQ預期濃度Tm值。GB/T42077—2022/ISOCVc?=√(1+E)Sc?2×l(+)-1……(10)用于核酸定量的儀器應使用適當的標準品和/或參考材料(如果有)進行校準。用于核酸定量的輔10.1測量不確定度計算的一般要求測量不確定度可以定義為測量的真實值所在的估計值范圍，值的范圍表示測量結果的可靠性。不確定度的評估包括測量過程中隨機誤差和系統誤差的影響。在評估影響測量結果的不確定度因素時，宜考慮測量過程中所有可能的變化來源。附錄D概述了qPCR和dPCR測量結果的不確定度來源。應映了影響測量結果的關鍵分析步驟。qPCR的參考文獻和dPCR的參考文獻提供了有關測量不確定度稀釋的隨機誤差);不確定度應根據ISO/IEC指南98-3進行組合。用于計算具有指定置信度(如95%)的擴展不確定方法驗證中進行的實驗可提供有關精密度(見8.2)和正確度(見8.6)的信息，這些信息可用于計算根據重復性和試驗運行間的估計(見8.2),可以使用公式(11)計算與測量樣品平均拷貝數濃度的方Wbis,ra=√u2in.ra+u2nt,r…………(12)qPCR測量不確定度還應考慮PCR擴增效率的不確定度。PCR擴增效率是使用基于標準曲線的以用來估計分隔單元體積的不確定度。分配體積值宜適合所用的dPCR試劑(預混液)的 數之比為1.8,表明樣品中大約有70%～80%的蛋白質。鑒于許多蛋白質可以同時抑制PCR和逆轉GB/T42077—2022/ISO2YY210圖A.1高質量DNA樣品的分光光度讀數示例輸出顯示220nm～350nm的吸光度以及DNA濃度(ng/pL)和吸光度的比值。圖A.2低質量DNA樣品的分光光度讀數示例輸出顯示220nm～350nm的吸光度以及DNA濃度(ng/pL)和吸光度的比值。別的。對于原核RNA,使用23S和16S核糖體亞基的rRNA比值評估完整性。對于真核RNA,使用GB/T42077—2022/ISO20395:2至于DNA完整性，可以通過使用多個不同大小的擴增子測量相同的轉錄子，該方法可應用于RNA完整性分析GB/T42077—2022/ISOy=a+bx…………(C.1)將擬合參數c和d的重要性與斜率b進行比較。c和d的顯著權重表明在低或/和高濃度下如果數據出現偏離線性的情況，則移除極端數據點，并檢查現有覆蓋較窄范圍的剩余數據是種偏離可能是由于較高濃度的樣本的熒光提前增加，被儀器軟件識別而錯誤地減去基線。線歸的影響較大，所以對線性擬合的影響也較為顯著,導致PCR擴增效率的評估明顯高于100%,理論上這是不可能的。此時，宜對基線設置方法進行調整，或在較窄的濃度范圍內對包含標準誤差(SE)[公式(C.5)]:CI=E±tgs%,-2×SEn——測定PCR擴增效率而進行的實驗次數。GB/T42077—2022/ISO20395:2019D.1概述準確性。其影響可能是系統性的；會影響其正負偏差(例如，核酸提取或逆轉錄效率<100%)或隨機偏差(與所應用技術的精密度相關)。在整個過程的不同階段進行重復實驗可以提高實驗的精密度，并預圖D.1中說明了qPCR的反應從生物學樣品到核酸定量整個反應過程可能出現的不確定度因素。對于RT-qPCR,不確定度包括DNA酶處理和逆轉錄。對于采用標準曲線的qPCR方法(見4.2.2)檢測中心箭頭表示從樣本到定量方法的實驗過程，實驗進程的分支描述了實驗流程的不同階段不確定樣品類型樣品來源基因1,2,3)分析移液器分析校準稀釋校準稀釋反應效率引物線性分析移液器分析校準稀釋線性擴增效率特異性線性樣品純化一樣品純化一樣品純化一設備校準一設備校準一純度完整性板間校準板間校準效率定量模式(值)定量模式(值)交叉污染回收率提取過程符合預期提取過程核酸提取歸一化校準曲線樣本與分析初始定量D.3dPCR的不確定度來源圖D.2中說明了用于定量拷貝數濃度的微滴式dPCR測量程序的不確定度來源(見4.2.3)。閾值Df本加入PCR混合物前樣品的稀釋倍數；Ma+禪本——稀釋液和樣品的質量；注：經許可復制，見參考文獻[58]。圖D.2dPCR檢測方法的不確定度貢獻因果圖檢查項目EEDDED顯微切割還是宏觀切割?E處理程序EEE樣本存儲條件和時間[特別是福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)樣品]EEEDE污染的評估(DNA或RNA)EEGB/T42077—2022/ISO檢查項目E純度(Az?o/A2so)DDEE電泳D抑制物檢測(C。稀釋法、加標樣品或其他)EEEEE溫度和時間ED逆轉錄前后的C?值DDEDEEDDD各引物的外顯子或內含子位置(如果適用)EE引物序列ED探針序列D所有結合位點和修飾信息E引物制造商D檢查項目DEE引物(探針)、Mg2+和dNTP濃度E聚合酶識別位點及其濃度EED添加劑(SYBRGreenI、DMSO等)EDEPCR反應的設置(手動或自動)DqPCR儀器制造商E最優化條件的證據(根據梯度實驗)D特異性(凝膠電泳、測序、熔解曲線或酶切)E驗證SYBRGreenI和NTC的C?值EEED標準曲線的相關系數R2E線性動態范圍EE整個范圍的置信區間DE如果是多通道檢測，每個通道反應的效率和檢測下限EqPCR分析軟件(來源、版本)EC?值的測定方法EEE參考基因的數量和選擇的理由EGB/T42077—2022/ISO20395:2019表E.1MIQE清單[經美國臨床化學協會(AACC)許可轉載](續)檢查項目歸一化方法的描述ED技術重復的次數和進度階段(RT或qPCR)E重復性(批內差異)E復現性(批間差異，%CV)DDE軟件(來源、版本)E使用實時PCR數據標記語言(RDML)提交C?值或原始數據D注：E必要，D可選。E.3dMIQE清單表E.2詳細列出了dMIQE指南中公布的基于dPCR的實驗結果核對表中的詳細的方法學和性能參數。檢查項目EEDDEE顯微切割還是宏觀切割?E處理程序EEE樣本存儲條件和時間[特別是福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)樣品]EEE檢查項目DNA/RNA定量E質量/完整性-儀器/方法；例如RIN/RQI和軌跡或3':5’EE模板修飾(酶解、超聲、預擴增等)E模板處理(初始加熱或化學變性)EERNA樣品的DNA污染評估EEDE逆轉錄(如有必要)cDNA制備方法十濃度EEEEDDD反應體積(兩步逆轉錄反應)DDEDE特異性篩選軟件(如BLAST等)EDDD各引物的外顯子或內含子位置(如果適用)EE引物序列和/或擴增基因上下游序列EGB/T42077—2022/ISO20395:2019檢查項目D探針序列D所有結合位點和修飾信息E引物制造商DDEE引物(探針)、Mg2+、dNTP濃度E聚合酶種類和濃度EED添加劑(SYBRGreenI、DMSO等)EDED質量和體積稀釋(手動/自動)DDE單個反應單元體積E測得的反應單元總體積(有效反應大小)ED對照組的詳細設計和使用EdPCR儀器生產廠家ED特異性(在測量稀有突變，病原體序列等時)EDE每個反應單元平均拷貝數(λ或等效值)EdPCR分析程序(來源，版本)EGB/T42077—2022/ISO20395:表E.2dMIQE清單[經美國臨床化學協會(AACC)許可轉載](續)檢查項目EE作為補充數據的陽性和陰性實驗結果示例E在適當的情況下，證明參考基因的數據和選擇理由EED技術重復的次數和階段(RT或qPCR)E重復性(批內變異)E重現性(批間/用戶/實驗室等變異)D實驗方差或置信區間EED注：E必要，D可選。[1]BustinSA,BenesV,GarsonJA,Hellem2009;55:611-22.[3]BarwickVJ,PreparationofCalibra[6]StahlbergA,RusnakovaV,ForootanA,AnderovaM,KubistaM.RT-qPCRwork-flowfor[7]WhaleAS,HuggettJF,CowenS,SpeirsV,ShawJ,Ell[8]BlandJM,Altma[10]HuggettJ,DhedaK,BustinS,ZumlaA.;Real-timeRT-PCRnormalisati[11]DevonshireAS,WhaleAS,GutteridgeA,standardisationofcell-freeDNAmeasurementinplasma:controlsforextractionefficiency,curatenormalizationofreal-timequantitativeRT-PCRdatabygeom[13]AndersenCL,JensenJL,OrntoftTF,Nortion,appliedtobladderwisecomparisonandstatisticalanalysisofrelatRes2002;30:e36.[15]MestdaghP,VanVlierompeleJ.,AnovelanduniversalmethodformicroRNART-qPCRdatanormalization.2009;10:R64.[16]LivakKJ,WillsQF,TippingAJ,DattaK,MittfromthepancreaticisletsofLangerhansrevealslognormaldistributionofmRNAlevels.GenomeRes2005;15:1388-92CISO2019—Allrightsresefsensitivity,linearityandresistancetoinhibitionofdigitalandnon-digi[19]NolanT,HandsRE,OgunkoladeW,Bus[21]RodriguezA,RodriguezM,CordobaJJ,AndradeMJ,Designofprimersandprobesfor[22]NolanT,HuggettJ,SanchezE.,GoodpracticeguidefortheapplicaPCR(qPCR).doi:10.13140/RG.2[24]www.ncbi.nlm.nih.[26]LudwigN,BeckerM,SchumannT,SpeerT,FehlmannT,KellerA,Meese[27]LievensA,JacchiaS,KagkliD,SaviniC,Q[28]DevonshireAS,ElaswarapuR,FoyCA,ApplicabilityofRNAstandardsfor[29]StahlbergA,HakanssonJ,XianX,SembH,KubistaM,Properties[30]SandersR,MasonDJ,FoyCA,HuggettJF,EvaluationofdigitalP[31]StahlbergA,KubistaM,PfafflM,Comparisonof[32]FoxBC,DevonshireAS,BaradezMO,MarshallD,FoyCA,Comparisonofreversetran-susceptibilityofPCRreactionstoinhibitors:animportantandunrecognisedphenomenon.BMCResNotes2008;1:70.[35]StahlbergA,AmanP,RidellBfordetectionofB-lymphocytemonoclonalitybycompariso[36]SidstedtM,RomsosEL,HedellR,AnsellR,SteffenGB/T42077—2022/ISOlevel:AnalysisofCNVrevealsthepowerofhighthroughputqPCRtoenhancequantitativMethods2010;50:271-646.[38]DevonshireAS,HoneyborneI,GutterreproducibleabsolutequantificationofMycobacteriumtuberculosiscomplexbydigitalPCR.AnalChem2015;87:3706-13.[39]MojtahediM,Fouquierd'HerouelA,HuangS.,fromquantificationcycle(Cq)distributiota.BMCBioinformatics2016;17:421.[41]KlineMC,DuewerDL,EvaluatingDropletQuantificationofHumanGenomicDNA:LiftingtheTraceabilityFog.AnalChem201[42]JonesM,WilliamsDropletDigitalPCRthroughapplicationofanovelopeJVirolMethods2014;202:46-5Chem2015;407:5827-34.[44]WhaleAS,HuggettJF,TzonevS,FundamentalsofDetectQuantif2016;10:15-23.[45]CLSI,GuidelineEP17-A2:EvaluationofDetectionCapab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