昆蟲病毒的研究進展

論文導讀：至今國際上已有30多個國家和地區開展了昆蟲病毒防治工作。目前應用基因工程技術改良病毒殺蟲劑的途徑主要有以下3條途徑：（1）修飾病毒本身基因以提高桿狀病毒的感染力。因此近年來人們在病毒增效因子和采用基因工程技術改造病毒殺蟲劑等方面作了深入的研究。

關鍵詞：昆蟲病毒，類群，生物防治，增效因子，基因工程

1961年，美國應用棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)防治棉花、玉米、高粱、大豆、番茄等多種作物的害蟲，取得較好的效果，并于1971年正式登記，是第一個工業化生產的昆蟲病毒商品。20世紀70年代初，桿狀病毒被FAO/WHO推薦為一種安全的生物殺蟲劑用于害蟲防治。桿狀病毒殺蟲劑應用最成功的例子是巴西的豆夜蛾NPV，在近100萬hm2的大豆上應用，每年可節省費用1100萬美元，同時還免去了1700萬t化學農藥的使用，具有巨大的經濟和生態效益。［5］據不完全統計，至今國際上已有30多個國家和地區開展了昆蟲病毒防治工作，已有50多種農林害蟲得到了有效的防治。2.1我國昆蟲病毒的應用進展我國的昆蟲病毒防治開始于1973年左右，蒲蟄龍等在廣東首次發現馬尾松毛蟲質多角體病毒（DpCPV）。1988—1993年間，在湖北、新疆、河南、河北等省利用松毛蟲CPV病毒防治松毛蟲，總計面積約7萬hm2，其防治效果相當于當前的高效化學農藥。另一項應用廣泛的病毒是棉鈴蟲NPV病毒。論文檢測。20世紀70年代，我國產棉區廣泛開展了利用棉鈴蟲NPV防治棉鈴蟲的田間實驗，并在湖北興建了第一座國家投資建設的年產能力為30t的棉鈴蟲NPV制劑工廠。［6］武漢大學劉年翠等（1978）開始對菜粉蝶顆粒體病毒（PrGV）進行了系統深入的基礎和應用研究。該制劑在我國29個省市、216個單位進行了1.33萬hm2田間試驗，標志著昆蟲病毒殺蟲劑應用研究和產業化基本模式已經形成。［7］戴冠群等（1973）在廣州地區首次分離到斜紋夜蛾核型多角體病毒（PINPV）后，中山大學昆蟲學研究所與廣州市中達生物工程有限公司合作，于1998年生產出商品化的“蟲瘟一號”病毒殺蟲劑，殺蟲效果良好，年產量達30t以上。［8］3病毒增效因子的研究3.1生物增效因子Tanada(1959)首次報道顆粒體病毒(GV)和核型多角體病毒(NPV)同時感染美洲粘蟲(Pseudaletiaunipuncta)時，PuGV對PuNPV的增效作用。此外,還發現一種粉紋夜蛾顆粒體病毒TnGV(TrichoplusianiGranulosisVirus)對苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）和粉紋夜蛾核型多角體病毒（TnNPV）都有較高的增效活性,八字地老虎顆粒體病毒(XestiaCnigrumGranulosisVirus)也能增強八字地老虎核型多角體病毒對該種幼蟲的感染。［9］因此，GV增強蛋白對NPV的增強作用是很普遍的。論文檢測。此外還發現粘蟲痘病毒的包含體也存在這種能加強NPV感染的增強因子。3.2非生物增效因子除了生物因子能有效地增強病毒的感染力外，一些非生物因子也對病毒有增效的作用，近年來光增白劑對桿狀病毒的增效作用已引起人們的興趣，因為光增白劑不僅能增強病毒的感染性，而且能有效保護桿狀病毒免受紫外線輻射損傷，同時還在一定范圍內擴大病毒宿主域，是一種很有應用潛力的桿狀病毒增效因子。Shapiro等（1992）首次報道光增白劑能極大增強NPV的感染性，他們用二苯乙烯類光增白劑和舞毒蛾NPV(LymantriadisparNPV,LdNPV)混合喂食舞毒蛾幼蟲，LdNPV的感染性大大增強，其LC50從18000降至10～44PIBs/mL，減少了99.9%。［10］Vail等用光增白劑TinopalLPW和AfMNPV混合喂食4種夜蛾科昆蟲，分別為煙芽夜蛾(Heliothivirescens)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigue)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)和美洲棉鈴蟲(Heliothiszea)，LT50值減少了52.4%，LC50值則減少了65.5%～92.6%。粉紋夜蛾和煙芽夜蛾對AfMNPV的敏感性最強，而甜菜夜蛾敏感性最差。另外，他們還發現了光增白劑增效作用的最適濃度為0.25%～1%，濃度為0.01%～0.1%時無明顯增效作用，濃度過高則會抑制昆蟲進食。［11］4遺傳重組桿狀病毒

為了提高桿狀病毒的殺蟲譜和殺蟲速度，人們利用遺傳工程對桿狀病毒的基因進行修飾，目前應用基因工程技術改良病毒殺蟲劑的途徑主要有以下3條途徑：（1）修飾病毒本身基因以提高桿狀病毒的感染力；（2）在桿狀病毒基因組中插入外源基因以增強病毒毒力；（3）用異源病毒重組來擴大桿狀病毒殺蟲譜。目前對第二條途徑的內容研究得較多。4.1修飾病毒本身基因4.1.1缺失egt基因egt基因是桿狀病毒在個體水平調控感染宿主生長發育的惟一已知基因。缺失egt基因的重組病毒可引起幼蟲生長發育代謝的失調，加速感染蟲體的死亡。［12］O’Reily等（1991）發現銀紋夜蛾核多角體病毒的一個早期非必需基因蛻皮甾體尿苷二磷酸葡萄糖轉移酶基因，該基因受早期啟動子控制，編碼的一個506aa蛋白能阻止幼蟲蛻皮和化蛹，促進病毒自身的增殖。缺失該基因的重組病毒能比野生型病毒提早27.5h殺死粉紋夜蛾幼蟲，受感染的幼蟲取食量也減少了40%。［13］4.1.2修飾gP64基因gP64基因編碼的64kD膜蛋白對病毒的附著和進入細胞有重要作用，Bonning等(1996)將AcNPV的gP64基因與專性殺甲蟲的蘇云金桿菌晶體毒素基因融合，并在大腸桿菌中表達，其表達產物可殺鱗翅目幼蟲和甲蟲。［14］4.1.3缺失p10基因P10蛋白是多角體膜的纖維結構成分，Maeda等(1995)發現缺失p10基因的重組病毒在昆蟲中腸釋放病毒粒子的效率提高，毒力因而提高2倍，但對紫外線等的抵抗力降低。［15］4.1.４pp34基因缺失AcMNPVpp34基因編碼的多角體膜蛋白(Polyhedralenvelopeprotein)是構成多角體膜的主要組分。Zuidema等(1989)用插入失活法破壞這一基因后，病毒多角體外周不存在膜狀結構，而病毒的感染性有所提高。pp34基因缺失病毒對寄主感染性提高的原因，可能與該病毒的病毒粒子更容易從多角體中釋放有關。［16］4.2插入外源基因4.2.1插入昆蟲激素基因目前已有羽化激素、利尿激素（DH）、保幼激素酯酶（JHE）和蛻皮激素（PTTH）、促前胸腺激素PTTH基因等被重組到桿狀基因組在并得到表達。Eldridge等（1991）從煙青蟲(Heliothisassulta)中將羽化激素的cDNA克隆，并被AcNPV在昆蟲細胞中表達。純化的重組羽化激素注入草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)蛹體內，可激發蛻皮行為，對煙草天蛾幼蟲有活性。［17］Maeda(1989)將一種昆蟲利尿激素基因重組到BmNPV中感染昆蟲幼蟲，結果使幼蟲的血淋巴比野生型病毒感染的少30%，感染幼蟲的時間也縮短了一天。［18］Hammock等（1990）把煙芽夜蛾中分離的JHE插入到AcNPV中得到重組病毒感染1齡的粉紋夜蛾幼蟲，能減少幼蟲的取食和體重，并使蟲體變黑，但對高齡幼蟲的LT50(半致死時間)和LD50(致死中量)值并無影響。論文檢測。［19］4.2.2插入昆蟲毒素和細菌毒素基因目前將昆蟲專性毒素和細菌毒素引入桿狀病毒基因組的成功例子有γ-內毒素、蝎神經毒素、螨神經毒素、馬蜂毒素、蜘蛛神經毒素和Bt殺蟲基因等。Stewart等（1991）將一種北非蝎的神經毒素基因插入AcNPV基因組中，感染幼蟲的致死時間比野生型病毒感染的幼蟲縮短25%。［20］Wood(1994)把螨神經毒素和蜘蛛神經毒素基因插入AcNPV基因組構建的重組病毒，其殺蟲效力有所提高。［21］Tomalski（1993）等將馬蜂毒素基因插入Ac-NPV中并獲得表達，但重組病毒的毒力未見明顯提高。［22］Merrywheather等（1990）構建的一株含Bt殺蟲基因、多角體陽性的重組病毒，其毒素基因在昆蟲細胞中能表達有活性的毒蛋白，但添飼感染粉紋夜蛾二齡幼蟲時其LD50為132PIB/蟲，比野生型病毒反而高64PIB/蟲，這可能是由于重組病毒的親本病毒與野生型病毒不是同一株系所致，或者是毒蛋白的拒食效應使幼蟲吞食病毒多角體減少。［23］4.2.3插入植物蛋白酶抑制劑基因植物蛋白酶抑制劑基因編碼的植物蛋白酶抑制因子作為植物抵抗害蟲的天然防御體系，近年來已引起人們的注意。季平等（1996）把慈姑蛋白酶抑制劑B基因插入家蠶BmNPV基因組中，獲得了帶慈姑蛋白酶抑制劑B基因的重組家蠶BmNPV。重組病毒對家蠶的致病能力比野生型病毒稍有增強的傾向，半數致死時間(LT50)可提早10h左右。［24］4.2.4插入昆蟲病毒增強蛋白基因昆蟲病毒增強蛋白基因編碼的昆蟲病毒增強蛋白是一種磷脂蛋白，分子量在89～110kD。［25］Lepore等（1996）用基因工程的方法構建含有增強蛋白基因的重組病毒AcMNPV，該重組病毒表達的蛋白分子，其生物活性和生化性質與原始的增強蛋白相同。［26］4.3用異源病毒重組來擴大桿狀病毒殺蟲譜桿狀病毒殺蟲范圍狹窄，一般只能感染一種或幾種害蟲。可以通過異源桿狀病毒之間的重組來實現擴大桿狀病毒殺蟲范圍。胡遠揚等（1998）用熒光素酶基因（Luciferase）作為報導基因，構建了包括蟑螂濃核病毒基因組兩末端倒置重復序列ITRs(invertedterminalrepeat)、SV40啟動子、Luciferase、SV40PolyA信號序列組成的重組蟑螂病毒表達質粒，篩選獲得兩個完整的含熒光素酶基因的重組蟑螂濃核病毒表達質粒克隆，為構建殺滅蟑螂重組病毒奠定了基礎。［27］袁哲明等（2000）證實，從棉鈴蟲GV基因中擴增表達的P102融合蛋白能提高蘇云金桿菌對棉鈴蟲幼蟲的感染率，從粉紋夜蛾GV基因組中擴增表達的P96蛋白顯著提高了HaNPV對錦鈴蟲的毒力。［28］5病毒殺蟲劑的發展展望病毒殺蟲劑是一種靶標專一的殺蟲劑，它能導致害蟲染病爆發和流行，可在幾年內將蟲害維持在經濟閥值以下，而且它不殺死天敵，是一類具有良好應用前景的殺蟲劑。但是，目前病毒殺蟲劑也存在殺蟲范圍太窄、生產困難、作用速度緩慢等問題。因此近年來人們在病毒增效因子和采用基因工程技術改造病毒殺蟲劑等方面作了深入的研究。相信隨著在分子水平和細胞水平對病毒細胞相互作用機制的進一步了解，一定能使病毒殺蟲劑能得到廣泛應用，造福人類。

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